Gefördert durch die NSF (0.854.551).

Ein. Pre-experimentelle Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen (siehe Tabelle 1 für Kompositionen): (a) 1 Liter NFR (Normal Frog Ringer), (b) 100 ml 10% iger Kochsalzlösung, (c) 100 ml CMF (Ca 2 + / Mg 2 +-freien Lösung ), (d) 1 ml ITS (Insulin-Transferrin-Selen, Sigma I1884), (e) 100 ml L-15 Kulturmedium, (f) 10 ml HCG (humanes Choriongonadotropin Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-interne Lösung, (h) 100 ml K +-interne Lösung für Amphotericin B. Der osmotische Stärke der Lösung 1, ist zu überprüfen, dass es ungefähr 260 mOsM Verwendung eines Dampfdruckosmometer (zB Wescor Modell # 5100C) ist werden . </li><li> Filtern sterilisieren Lösungen (b) und (c). Lösungen (a) (b) und (c) können bis zu drei Monate gelagert werden bei 4 ° C. Planen Lösung (d) durch Zugabe von 1 ml deionisiertes H 2 O, um das Fläschchen mit dem lyophilisierten Pulver über eine 25-Gauge-Nadel und Spritze Spritzenfilter. Diese fertige Lösung cein bei 4 ° C für 30 Tage gelagert werden. </li><li> Planen Lösung (e) in einer Sterilbank durch Kombination aller Komponenten in einem Becherglas oder Kolben. Filtern sterilisieren die endgültige Lösung und Transfer 10 ml Aliquots in sterile Zentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Sie die HCG (Lösung (f)) durch Zugabe von 10 ml deionisiertes H 2 0 bis das Fläschchen mit dem lyophilisierten Pulvers über eine 25-Gauge-Injektionsnadel und Spritze Filter. Diese fertige Lösung kann bei 4 ° C für 30 Tage gelagert werden. </li><li> Fabrizieren mindestens zwei Mikrodissektion Werkzeuge durch Aufkleben eines Minutien Stift (26.002 bis 10, Fine Science Tools) mit dem Ende eines Glases Pasteurpipette mit Sekundenkleber. Lassen Sie das scharfe Ende des Stiftes über das Ende der Pipette ca. 0,5 cm verlängern. </li><li> Zwei Tage vor der Zubereitung Kulturen, induzieren Zucht mit dem folgenden Verfahren. Identifizieren eines Zucht-ready Paar Xenopus durch Beobachtung einer prominenten, rötlich Kloake durch die weibliche und dunkle Pigmentierung auf der ebenen surface der Vorderpfoten des Männchens. Einer nach dem anderen, net jeder Frosch und halten Sie sie Bauchseite nach unten auf eine Spüle mit dem Netz, so dass es nicht entweichen kann. Jeweils 1 ml der Lösung (f) durch das Netz und subkutan in einen der dorsalen Lymphsäcke. </li><li> Legen Sie die Zucht Paar zusammen in einem überdachten 10 Gallonen Wassertank. Um sicherzustellen, dass die Tiere nicht mit Füßen treten, die neu verlegt und befruchtete Eier, installieren Sie ein abgeschirmtes Boden mit einer Maschenweite von ca. ½ &quot;ausgestattet ca. 1-2 cm über dem Boden des Tanks (Abbildung 1A). </li><li> Lassen Frösche ungestört 12-48 h, bis die Tiere in amplexus sind und befruchteten Eier werden auf dem Boden unterhalb des Bildschirms (Abbildung 1B) beobachtet. </li><li> Entfernen Sie die Tiere aus dem Tank, aber lassen Sie die Eier ungestört mindestens 24 Stunden länger. Dieses Paar Frösche können nach sechs Wochen wieder gezüchtet werden. </li><li> Lösen Sie die Embryonen aus dem Boden des Tanks und übertragen Sie sie auf vier oder fünf 60x15 mm Kulture Schalen mit 10% iger Kochsalzlösung (Lösung b). Sortieren Sie die Embryonen von der Bühne nach dem Schema der Niewkoop und Faber (ref. 20). Nützliche Embryonen werden diejenigen im Stadium 22-24 sein. 2A zeigt einen Embryo in etwa Stufe 22, während 2B zeigt einen Embryo, der zu weit entlang in der Entwicklung nützlich zu sein (ca. Stufe 28). Es ist wichtig, Embryonen, die gesund sind wählen: solche, die ein glattes Aussehen mit hellbraunen und weißen Mottling sind ideal. Embryonen, die große schwarze oder weiße Flecken haben, sind in der Regel ungesunden und unbrauchbar. </li></ol> 2. Mikrodissektion von Xenopus Embryonen <ol><li> Innerhalb einer Sterilbank, Etikett und etwa in der Mitte zu füllen drei 60x15 mm sterile Kulturschalen mit 10% iger Kochsalzlösung und einer mit CMF. </li><li> Verwendung einer sterilen, Glas Pasteurpipette Transfer fünf vor zehn Stadium 22-24 Embryonen in eine der Schalen mit 10% iger Kochsalzlösung. Mit der Hilfe eines Stereo-Zoom sezierenten Mikroskop innerhalb der Haube (0,6-5x mit 10 x Okulare), entfernen Sie das Gelee Mantel und Dotterhaut von jedem Embryo mit zwei Paar sterile Nr. 5 Zange (11251-30, Fine Science Tools). (Siehe 3A und 3B). </li><li> Waschen Sie die nackten Embryonen, indem sie ein zu einer Zeit, durch die verbleibenden zwei Gerichte von 10% Kochsalzlösung und schließlich in die Schale mit CMF. Verwenden Sie eine neue, sterile Pipette für jede Übertragung und minimieren das Volumen der Lösung übertragen von Gericht zu Gericht. </li><li> Im Gegenzug halten sich Embryo vorsichtig, aber fest mit einer Zange und mit Hilfe der Mikrodissektion Werkzeug in Schritt 1,5 gestaltet, entfernen Sie das Neuralrohr und die damit verbundenen Myotomen die am meisten Dorsalseite des Tieres befinden. Tun dies, indem sie drei Scheiben, eine an jedem Ende der Standort des Neuralrohr und eine dritte gerade ventralen dazu (4A). Bewegen jedes seziert Neuralrohr / Myotome zu einem sauberen Teil der Schale weg von dem Eigelb Granuln und andere Ablagerungen (4B). Die dorsal-ventralen Achse und die Orte der Neuralrohr und Myotome sind in Abbildung 4 dargestellt. </li><li> Nach etwa 15 Minuten in dieser Lösung (CMF) Verwendung der Pinzette pigmentierte Haut frei von der sezierten Gewebes zu heben und zu verwerfen. Nach einer weiteren 30 bis 60 min werden die Zellen bilden einen &quot;Sandhaufen&quot;, wie sie dissoziiert voneinander (4C) zu werden. </li></ol> 3. Vorbereitung der Nerv-Muskel-Co-Kulturen <ol><li> Auftauen eine 10 ml Tube Kulturmedium und aseptisch 70 ul ITS und 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795). </li><li> Etikett und füllen sterilen 35 mm Kulturschalen (FD35-100 World Precision Instruments) etwa zur Hälfte mit L-15 Kulturmedium (Lösung (E)), eine für jedes Embryo seziert. </li><li> Fabrizieren Plattieren Pipette durch Ergreifen jedes Ende einer Pasteurpipette aus Glas während die sich verjüngenden Abschnitt über einer Flamme. Ziehen Sie die Enden auseinander zu 10 cm und dann brechen Sie das Ende ein Trinkgeld von etwa 0,2 mm zu erhalten. </li><li> Verwenden der Plattierfläche Pipette zum Aufsaugen der &quot;Sandhaufen&quot; von einem Embryo Minimierung der Menge an Lösung gezogen. Auszutreiben der Zellen auf dem Boden der Kulturschale. Platte der Zellen in mehreren Zeilen. Beobachten plattierten undifferenzierten Zellen (5A und 5B). </li><li> Lassen Sie die Gerichte der plattierten Zellen ungestört für mindestens 15 Minuten, damit die Zellen Zeit, um die Schale zu befestigen. </li></ol> 4. Patch-Clamp-Nerv-Muskel-Synapse <ol><li> Nach 12-24 h in Kultur nehmen plattierten Zellen auf verschiedenen morphologischen Merkmale: Muskelzellen werden spindelförmig und spinalen Neuronen verlängern lange Prozesse (Abbildung 6). Functional synaptischen Kontakte zwischen Neuriten Krampfadern und Muskelzellen können bei gleichzeitiger gepaart elektrophysiologischen Ableitungen bestätigt werden. &quot;M&quot;, &quot;S&quot; und &quot;V&quot; beziehen sich jeweils auf die Muskelzelle, neuronaleSoma und präsynaptischen Krampfadern. </li><li> Bereiten Sie zwei Patch-Elektroden für die Aufzeichnung: eine für den präsynaptischen Krampfadern und eine für die Muskelzelle. </li><li> Für die präsynaptischen Elektrode, Vorbereitung einer Amphotericin-haltigen Lösung wie folgt: Fügen 100 ul DMSO zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 5 mg Amphotericin B (Sigma A4888). Vortex diese Lösung für 10 sek. Als Nächstes fügen Sie 10 ul dieser Lösung zu einem zweiten Mikrozentrifugenröhrchen, die 625 ul K +-interne Lösung für Amphotericin B (Lösung (h)) enthält. Wirbels wie oben. </li><li> Füllen den präsynaptischen Elektrode mit der Amphotericin-haltigen K +-interne Lösung in Schritt 4.3 hergestellten und der postsynaptischen Elektrode mit K +-interne Lösung (Lösung (g)). </li><li> Ersetzen Medien in der Kulturschale mit NFR und Verlagern dieses zu einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast-Optik ausgerüstet. </li><li> Positionieren Sie beide Elektroden direkt über ihre jeweiligen Ziele. Besorgen Sie sich die whole-cell configuration mit der Muskelzelle Elektrode vor dem perforierten Patch-Konfiguration mit dem Krampfadern Elektrode. </li><li> Um die Funktionalität der Synapse zu bestätigen, depolarisiert die Krampfadern mit einem Patch-Clamp-Verstärkers (z. B. Axopatch 200B, Molecular Devices) unter Software-Steuerung (zB durch pCLAMP 9, Molecular Devices) und beachten Sie die gleichzeitige präsynaptischen und postsynaptischen Ströme. Abbildung 7 zeigt die Ströme gesehen in Reaktion auf depolarisierende Schritte Spannung, die dem präsynaptischen Krampfadern in 10 mV-Schritten von -30 mV bis +40 mV. Die Einwärtsströme in der präsynaptischen Zelle aus gesehen werden durch Na + und Ca 2 + und den Auswärtsströme von K + durchgeführt wird. Ströme in der postsynaptischen Zelle aufgezeichnet sind Antworten auf Neurotransmitter aus der Krampfadern freigegeben und werden meist von Na + durch Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-Kanäle. </li></ol>

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	<li>Augustine, G. J., Eckert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divalent+cations+differentially+support+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse.">Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse.</a> J. Physiol. 346, 257-271 (1984).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).</li><li>Weldon, P. R., Cohen, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+regulation+of+neurotransmitter+specification+and+embryonic+neuronal+calcium+spike+activity.">Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity.</a> J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).</li><li>Niewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Cokultivieren von Motoneuronen und Muskelzellen sind die Verwendung geeigneter inszenierten Embryonen aus der induzierten Zucht von Xenopus Fröschen erzeugt und der sorgfältigen aseptischen Dissektion der undifferenzierten spinalen Neuronen und Myoblasten. Befruchtete Eier sollten in Ruhe gelassen werden, bis sie ungefähr Stufe erreichen 10 oder so bewegen sie früher oft hält ihre Entwicklung. Gesunde Embryonen werden durch eine glatte Optik und braun und weiß gefleckten Färbung identifiziert. Stufe 22-24 Embryonen sind die nützlichsten, denn dies ist der Punkt während der Entwicklung kurz nach der Neuralrohr geschlossen und vor den Myozyten deutlich differenziert. Darüber hinaus scheitern Zellen von älteren Embryonen gut dissoziieren in CMF. Vorsicht beim Entfernen der Dotterhaut da es stark haftet für den Embryo werden. Die Membran sollte auseinandergerissen werden mit scharfen Pinzette so dass der Embryo entsteht intakt. Ein weiterer wichtiger precaution ist, sorgfältig zu platzieren der Zellen auf dem Boden der Kulturschale (anstatt sie dort anzusiedeln). Dieses Verfahren ist bevorzugt, da dies die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Zellen in die Kulturschale haften. Funktionelle Neurotransmission zwischen Nerv und Muskel kann mit nur postsynaptischen Aufzeichnung bestimmt werden und oft festgestellt werden kann durch die Beobachtung der spontanen Muskelkontraktion nach Innervation. Un-innervierten Muskelzellen nicht in Kultur zucken. Postsynaptischen Aufnahme allein ist nützlich für die Aufnahme Miniatur-Endplatte Ströme oder Potenziale, aber Messungen evozierte Freisetzung erfordert präsynaptische Stimulation, und die Korrelation der prä-und postsynaptischen Ströme benötigt Doppel Patch-Clamp. Neben dem gepaarten Patch Aufnahme hier beschriebene Methode bietet diese Vorbereitung die Möglichkeit, ein Drittel Pipette in der neuronalen Soma 5 einzuführen Dies ermöglicht die Erzeugung eines Aktionspotentials that können zur präsynaptischen Krampfadern ausbreiten und zu der Freisetzung von Neurotransmittern. Zusätzlich kann putativen Mittel, die gedacht sind, zu vermitteln oder zu modulieren synaptischen Übertragung zu jeder Seite der Synapse eingeführt werden: über die Muskelzelle Pipette oder durch Diffusion von einem dritten Pipette an dem Soma platziert.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ausstattung / Zubehör </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td></td></tr><tr><td> Insulin-Transferrin-Selen </td><td> Sigma </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> Humanes Choriongonadotropin </td><td> Sigma </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Dampfdruckosmometers </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Minutien Pins </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Sigma </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Lösungsname </td><td> Rezept </td></tr><tr><td> (A) NFR (Normal Frog Ringer (in mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl 2, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) 10% iger Kochsalzlösung </td><td> 10 ml NFR 90 ml deionisiertes H 2 O </td></tr><tr><td> (C) CMF (Ca 2 + / Mg 2 +-freie Lösung) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1,2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) L-15 Nährmedien </td><td> 50 ml L-15 Medien (Sigma L1518) + 50 ml NFR. </td></tr><tr><td> (G) K +-interne Lösung (in mM) </td><td> 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl 2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr><tr><td> (H) K +-interne Lösung für Amphotericin B (in mM) </td><td> 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Table 1.

simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recording from xenopus nerve-muscle co-cultures

Viele Informationen über die Kopplung von präsynaptischen Ionenströme mit der Freisetzung von Neurotransmitter hat sich von wirbellosen Präparate, vor allem die Tintenfische riesigen Synapse 1 erhalten worden. Jedoch mit Ausnahme der Herstellung hier beschriebenen existieren wenige Wirbeltier Zubereitungen, in denen es möglich ist, die gleichzeitige Messungen der Neurotransmitter-Ausschüttung und präsynaptischen Ionenströme machen. Embryonale Xenopus Motoneuronen und Muskelzellen können zusammen in einfachen Kulturmedium gezüchtet werden bei Raumtemperatur, sie werden innerhalb von zwölf funktionelle Synapsen to 24 Stunden zu bilden, und kann verwendet werden, um Nerven-und Muskel-Zell-Entwicklung und synaptische Interaktion über mehrere Tage zu untersuchen (bis Überwucherung auftritt). Einige Vorteile dieser Co-Kulturen gegenüber anderen Wirbeltieren Zubereitungen sind die Einfachheit der Zubereitung, die Fähigkeit, die Kulturen und die bei Raumtemperatur zu halten und die leichte Zugänglichkeit der Synapsen gebildet 2-4. Die Zubereitung wurde weithin um die biophysikalischen Eigenschaften der präsynaptischen Ionenkanälen und die Regulierung des Senders Release 8.5 Studie verwendet. Darüber hinaus hat die Zubereitung selbst zu anderen Verwendungen, einschließlich der Studie von Neuritauswuchs und Synaptogenese 9-12, molekularen Mechanismen der Neurotransmitterfreisetzung 13-15, die Rolle des diffundierbaren Botenstoffe im Neuromodulation 16,17, und in vitro die synaptische Plastizität verliehen 18 - 19.

4B zeigt die Rückenansicht eines isolierten Rückenmark / Myotom unmittelbar nach ihrer Entnahme aus einer Stufe 22 Xenopus Embryo. 4C zeigt, dass nach Hautentfernung und Inkubation in Ca 2 +-Mg 2 +-freien Lösung (CMF, Lösung ( c)), Zellen in ein &quot;Sandkasten&quot; distanzieren und sind bereit zum Plattieren. Unmittelbar nach der Beschichtung in das Kulturmedium Zellen zeigen wenig morphologischen Variabilität (5B), sondern nehmen auf unterschiedlichen Formen nach 24 Stunden in Kultur. Muskelzellen geworden spindelförmigen während Neuronen während erstreckenden Neuriten bleiben kugelförmige daß aufwendige varicosites an Synapsen mit Muskelzellen (Abbildung 6). Gleichzeitige gepaart Patch Aufnahme aus dem präsynaptischen Krampfadern und postsynaptischen Muskelzelle (Abbildung 7) zeigt die präsynaptischen nach innen und außen Ströme mit der Freisetzung von Neurotransmittern und der resulta assoziiertnt exzitatorischen postsynaptischen Ströme. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1 A:.. Zuchtpaar von Fröschen bei der Paarung Eimer atop Bildschirm B: Frogs in amplexus mit befruchteten Eiern. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2 A:.. &quot;Geeignet&quot; Stufe 22 Embryos B: &quot;ungeeignet&quot; Stufe 28 Embryos. Maßstab entspricht 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3 A:. Stage 22 Embryos vor dem Entfernen des Dotterhaut und Gelee Mantel. Der Pfeil zeigt auf den äußeren Rand des jelly Mantel. Die Dotterhaut hält sich eng an die embryo und praktisch unsichtbar B:. Bare Embryo. Maßstab entspricht 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4 A: Stage 22 Embryos mit einer gestrichelten Linie, die zu werden seziert Teil B:.. Akut isoliert dorsalen Teil des Embryos, &quot;d&quot; und &quot;v&quot; beziehen sich auf die dorsalen und ventralen Aspekte der Embryonen, während &quot;m&quot; und &quot;n&quot; die ungefähre Lage der mytomes und Neuralrohr C:. &quot;Sand Stapel&quot; von Zellen nach 60 min in CMF. Maßstabsbalken entspricht 1 mm für A, und 0,5 mm für die B-und C. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Figur 5 A:. 5x Leistung Ansicht von Zellen in Kultur unmittelbar nach dem Ausplattieren. B: Gleiche Kultur bei 40x. MaßstabBalken repräsentiert 40 um für A, und 5 um für B. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Neuromuskulären Synapse in Kultur mit Identifizierung der neuronalen Soma (S), präsynaptischen Krampfadern (V), und postsynaptischen Muskelzelle (M). Maßstab: 5 um. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Abbildung 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> Abbildung 7. Präsynaptische (oben) und postsynaptischen (unten) Ströme in Reaktion auf die Anwendung von 10 mV inkrementelle Spannung sehen Schritte, um die präsynaptischen Krampfadern von -30 mV bis +40 mV vorgestellt. Spannungsstufen sind neben einigen der präsynaptischen Spuren angegeben. Die Holding Potenzial für beide Zellen betrug -70 mV.

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Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Dieses Video zeigt die Maßnahmen zur primären Kulturen von embryonalen wachsen<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerven-und Muskelzellen und die Nützlichkeit dieser Zubereitung für die Herstellung gleichzeitigen Pre-und Post-synaptischen Patch Clamp Messungen.

Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerv-Muskel-Co-Kulturen

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

10.9K Aufrufe.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Dieses Video zeigt die Maßnahmen zur primären Kulturen von embryonalen wachsen Xenopus Nerven-und Muskelzellen und die Nützlichkeit dieser Zubereitung für die Herstellung gleichzeitigen Pre-und Post-synaptischen Patch Clamp Messungen.

Serie: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biologie

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert<em&gt; In vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes

Heterologous expression of connexins and innexins in Xenopus oocytes is a powerful approach for studying the biophysical properties of gap junctions (GJs). However, this approach is technically challenging because it requires a differential voltage clamp of two opposed oocytes sharing a common ground. Although a small number of labs have succeeded in performing this technique, essentially all of them have used either homemade amplifiers or commercial amplifiers that were designed for single-oocyte recordings. It is often challenging for other labs to implement this technique. Although a high side current measuring mode has been incorporated into a commercial amplifier for dual oocyte voltage-clamp recordings, there had been no report for its application until our recent study. We have made the high side current measuring approach more practical and convenient by introducing several technical modifications, including the construction of a magnetically based recording platform that allows precise placement of oocytes and various electrodes, use of the bath solution as a conductor in voltage differential electrodes, adoption of a commercial low-leakage KCl electrode as the reference electrode, fabrication of current and voltage electrodes from thin-wall glass capillaries, and positioning of all the electrodes using magnetically based devices. The method described here allows convenient and robust recordings of junctional current (Ij) between two opposed Xenopus oocytes.

Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes

Here we present a protocol to express gap junction proteins in Xenopus oocytes and record junctional current between two apposed oocytes using a commercial amplifier designed for dual oocyte voltage-clamp recordings in a high side current measuring mode.

Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen

Heterologous expression of connexins and innexins in Xenopus oocytes is a powerful approach for studying the biophysical properties of gap junctions ...

Electrophysiological Recordings For Assessing Neuronal Regenerations in Co-cultured Spinal Cord Slices

Put a Petri dish with a coated microelectrode array inside under a stereomicroscope. Bring the array into focus, and center a six-microliter droplet of chicken plasma on the electrode array. Using a small spatula, carefully slide two spinal cord sections with their ventral sides facing each other into the plasma droplet.
Next, add eight microliters of thrombin around the chicken plasma droplet. Then, use the pipette tip to carefully mix and spread the chicken plasma and thrombin mixture. Just before the chicken plasma and thrombin mixture becomes too stringy and starts to coagulate, aspirate the excess liquid. Then, cap the Petri dish and place it in a humidified chamber.
Place the chamber inside an incubator at 37 degrees Celsius for about an hour. After incubation, carefully add 10 microliters of nutrient medium to the sample. Cap the Petri dish and place it back into the incubator for an additional 45 minutes. Next, place each of the multi-electrode array culture assemblies into a roller tube and add three milliliters of nutrient medium. Close the lid tightly and place the roller tube into the roller drum. Rotate the drum at 1 to 2 RPM in the incubator at 37 degrees Celsius.
Using sterile rubber-tipped forceps, remove the multi-electrode array culture assemblies from the roller tube and place them into a Petri dish under a stereomicroscope. Bring the tissue into focus and verify that the two slices are fused. Next, hold the assembly steady and place a scalpel blade in the groove of the multielectrode array close to the tissue slices. Hold the scalpel rather horizontally and then lift the scalpel handle up, but let the scalpel blade stay in the groove of the array in such a way that the blade rolls from base to tip, cutting through the tissue, covering the groove.
Sever any residual tissue connections with a 25-gauge needle tip if necessary. Work only in the area within the groove, and do not touch the tender edges. Put the multi-electrode array culture assemblies back into the roller tube and add three milliliters of fresh nutrient medium to the cultures. Then, place the roller tube back onto the roller drum in the incubator at 37 degrees Celsius.
Mount a multi-electrode array culture assembly into a recording chamber and apply about 500 microliters of extracellular solution to the array. Then, mount the assembly on the microscope. Wait 10 minutes for the system to stabilize, and then, record basic spontaneous activity from each of the activity-detecting electrodes for 10 minutes. Repeat the recordings a total of two times.
To ensure stable extracellular conditions, exchange the extracellular solution after every recording session. If desired, disinhibit the network by applying extracellular solution containing one micromolar of strychnine and 10 micromolar of gabazine and wait for at least two minutes before recording the electrical activity.

Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von

Zusammenfassung

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