ממומן על ידי NSF (0854551).

1. הכנה שלפני הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונים הבאים (ראה טבלה 1 ליצירות): (א) NFR 1 ליטר (רינגר צפרדע הרגיל), (ב) מי מלח 100 מ&quot;ל, 10% (ג) 100 המ&quot;ל CMF (Ca 2 + / Mg 2 פתרון +-חופשי ), (ד) 1 המ&quot;ל שלו (אינסולין transferrin-סלניום, I1884 סיגמא), (ה) 100 מיליליטר מדיום L-15 תרבות, (ו) 10 מיליליטר HCG (גונדוטרופין כוריוני האנושי סיגמא CG-10), (ז) 100 מיליליטר K פתרון +-פנימי, (ח) 100 המ&quot;ל K +-פתרון הפנימי לAmphotericin B. הכח האוסמוטי של פתרון 1 צריך להיבדק כדי לוודא שהוא כ 260 mOsM באמצעות osmometer לחץ אדים (למשל מודל Wescor # 5100C שברשות) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר פתרונות (ב) ו (ג). פתרונות (א) (ב) ו (ג) ניתן לאחסן עד שלושה חודשים ב 4 ° C. להכין תמיסה (ד) על ידי הוספת 1 ​​מיליליטר H 2 O deionized לבקבוקון המכיל אבקת lyophilized באמצעות מחט 25 מד מזרק ומסנן מזרק. זה פתרון סופי גניתן לאחסן ב 4 ° C למשך 30 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה (ה) במכסת מנוע זרימה למינרית על ידי שילוב של כל הרכיבים בכוס או בקבוק. סנן לעקר את הפתרון הסופי ולהעביר 10 aliquots מ&quot;ל לתוך צינורות צנטריפוגות סטריליים. חנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן (הפתרון (ו)) HCG ידי הוספת 10 מ&quot;ל deionized H 2 0 לבקבוקון המכיל אבקת lyophilized באמצעות מחט 25 מד מזרק ומסנן מזרק. פתרון סופי זה ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך 30 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק לפחות שני כלי microdissection ידי הדבקת סיכת Minutien (26002-10, כלי מדע פיין) לסוף הכוס פסטר פיפטה עם דבק cyanoacrylate. לאפשר את הקצה החד של הסיכה להאריך מעבר לקצה פיפטה כ 0.5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ימים לפני הכנת תרבויות, לגרום לגידול בהליך הבא. זהה את זוג הורים מוכן של Xenopus ידי התבוננות ביב בולט, אדמדם בפיגמנטציה כהה והנקבה בsu מישורייםrface מכפותיו הקדמיות של הזכר. אחד ובזמן, בניכוי כל צפרדע להחזיק אותו צד גחון על כיור ברשת, כך שהוא לא יכול לברוח. מזריק 1 מ&quot;ל של פתרון (ו) דרך הרשת ומתחת לעור לתוך אחד מצקי הלימפה הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את זוג ההורים יחד בטנק גלון מכוסה 10 של מים. כדי להבטיח שבעלי החיים לא ירמסו את הביצים שמטילות חדשה ומופרות, התקנת רצפה מרושתת עם גודל רשת של כ ½ &quot;כ 1-2 סנטימטרים מצוידים מעל תחתית המכל (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר צפרדעים באין מפריעים במשך 12-48 שעות עד שבעלי החיים הם בamplexus וביצים מופרות הם נצפו על הרצפה מתחת למסך (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בעלי החיים מהטנק, אבל משאיר את הביצים באין מפריעות במשך לפחות 24 שעות ארוכות יותר. זה זוג צפרדעים ניתן מחדש התרבה ​​לאחר שישה שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העוברים מתחתית המכל ולהעבירם לפולחן ארבעה או חמישה מ&quot;מ 60x15מאכלים המכילים יור מלוח 10% (פתרון ב). מיין את העוברים בשלב בהתאם לתכנית של Niewkoop ופייבר (אסמכתא 20). עוברים שימושיים יהיו אלה בשלב 22-24. 2A האיור מראה עובר בשלב 22 תוך כ 2B האיור מראה עובר כי הוא רחוק מדי יחד בפיתוח כדי להיות שימושי (כ שלב 28). חשוב לבחור עוברים שאינם בריאים: אלה שהם חלקים במראה בגוון החום בהירים ומנומר לבנים הם אידיאליים. עוברים שכתמים שחורים או לבנים גדולים הם בדרך כלל לא בריאים ולא תקינים. </li></ol> 2. Microdissection של עוברי Xenopus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מינרית זרימת מכסה מנוע, תווית ולמלא כשלוש 60x15 אמצע מנות מ&quot;מ סטריליים תרבות עם תמיסת מלח 10%, ואחת עם CMF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש, העברת סטרילי זכוכית פיפטה פסטר 09:55 שלב 22-24 עוברים לאחד המאכלים המכילים תמיסת מלח 10%. בעזרת זום סטריאו לנתחמיקרוסקופ ing בתוך מכסה המנוע (0.6-5x עם 10 עיניים x), להסיר את מעייל הריבה וקרום vitelline מכל עובר באמצעות שני זוגות מלקחיים סטריליים # 5 (11251-30, כלי מדע פיין). (ראה 3A ו 3 מספרים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את העוברים החשופים על ידי עובר אותם, אחד בכל פעם, באמצעות שתי המנות הנותרות של תמיסת מלח 10% ולבסוף לתוך הקערה ובי CMF. השתמש פיפטה חדשה, סטרילית עבור כל העברה ולמזער את עוצמת הקול של פתרון הועבר ממנה למנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתורו, החזק כל עובר בעדינות אך בתקיפות עם זוג מלקחיים ו, ​​באמצעות כלי microdissection עצב בשלב 1.5, להסיר את הצינור העצבי וmyotomes קשורים אשר ממוקם בהיבט הגבי ביותר של בעלי החיים. עשה זאת על ידי ביצוע שלוש פרוסות, אחד בכל צד של המיקום של הצינור העצבי ושליש רק גחון אליו (איור 4 א). העבר כל צינור עצבי גזור / myotome לחלק נקי של המנה מהחלמון granules ופסולת אחרת (איור 4 ב). הציר הגבה-הגחון, ואת המיקומים של הצינור העצבי וmyotomes מסומנים באיור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 15 דקות בפתרון זה (CMF) מלקחי שימוש כדי להרים את העור ללא פיגמנט הרקמה הגזורה וזורקים. לאחר 30-60 דקות נוספות, התאים יהוו &quot;ערימת חול&quot; כפי שהם היינו מנותקים אחד מהשני (4C איור). </li></ol> 3. הכנת עצבי שרירי Co-תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר שפופרת 10 מ&quot;ל של מדיום התרבות והסביבה נקיה מחיידקים להוסיף 70 μl ו35 ng / ml-BDNF (סיגמא B3795). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית ולמלא 35 מנות מ&quot;מ סטריליים תרבות (FD35-100 מכשירי Precision העולם) בערך באמצע עם מדיום L-15 תרבות (פתרון (ה)), אחד עבור כל עובר הגזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק פיפטה ציפוי ידי אחיזה כל קצה של זכוכית פיפטה פסטר תוך החזקת החלק המחודד מעל להבה. לפרק את הקצוות לכ 10 סנטימטר ואז לשבור את הקצה להניב קצה של כ -0.2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה הציפוי להתחנף &quot;ערימת החול&quot; שעובר אחד מהפחתת כמות הפתרון נמשכת. לגרש את התאים על תחתית צלחת תרבות. פלייט את התאים לכמה שורות. שים לב לא עברו התמיינות תאים מצופים (האיור 5A ו5B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשאיר את הכלים של תאי ציפוי ללא הפרעה במשך לפחות 15 דקות כדי לאפשר זמן התאים לצרף לתבשיל. </li></ol> 4. סינפסות clamping תיקון עצבי שרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12-24 שעות בתרבות, תאי ציפוי לקחת על מאפיינים מורפולוגיים שונים: תאי שריר הופכים דמויים כישור והנוירונים שדרה להרחיב את תהליכים ארוכים (איור 6). קשר הסינפטי תפקודי בין varicosities neurite ותאי שריר יכול להיות מאושר עם הקלטות אלקטרו סימולטניים לזווג. &quot;ז&quot;, &quot;S&quot; ו &quot;V&quot; מתייחסים בהתאמה לתאי השריר, תאי עצבהסומא וvaricosity סינפטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי אלקטרודות תיקון להקלטה: אחד עבור varicosity presynaptic ואחד לתא השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על האלקטרודה presynaptic, להכין פתרון amphotericin המכיל כדלקמן: הוסף DMSO μl 100 לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ג amphotericin B (סיגמה A4888). מערבולת פתרון זה עבור 10 שניות. לאחר מכן, להוסיף 10 μl של פתרון זה לצינור microcentrifuge שני המכיל 625 K +-μl פתרון הפנימי לAmphotericin B (פתרון (ח)). מערבולת כאמורה לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את האלקטרודה מראש הסינפטית עם K amphotericin המכיל פתרון +-פנימי שהוכן בשלב 4.3 והאלקטרודה פוסט סינפטי עם פתרון K +-פנימי (פתרון (ז)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת במנת התרבות עם NFR ולהעביר אותו למיקרוסקופ ההפוך מצוידים באופטיקה לעומת השלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את שתי האלקטרודות בדיוק מעל היעדים שלהם. השג את השיתוף כל התאnfiguration עם אלקטרודה תא השריר לפני תצורת התיקון המחוררת עם אלקטרודה varicosity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את הפונקציונליות של סינפסה, depolarize varicosity עם מגבר מהדק תיקון (למשל Axopatch 200B, התקנים מולקולריים) תחת שליטת תוכנה (למשל על ידי 9 pCLAMP, התקנים מולקולריים) ולבחון את זרמי presynaptic וpostsynaptic בו זמנית. איור 7 מציג את הזרמים ראו בתגובה לצעדי depolarizing של מתח הניתנים לvaricosity presynaptic בהפרשים קבועים של 10 MV מ-30 mV ל40 mV. הזרמים פנימה ראו בתא presynaptic מתבצעים על ידי Na + ו Ca 2 + והזרמים החיצוניים על ידי + K. זרמים שנרשמו בתא postsynaptic הם תגובות לנוירוטרנסמיטר שוחרר מvaricosity ומתבצעים בעיקר על ידי + Na בערוצי הקולטן אצטילכולין ניאציניות. </li></ol>

<ol>
	<li>Augustine, G. J., Eckert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divalent+cations+differentially+support+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse.">Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse.</a> J. Physiol. 346, 257-271 (1984).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).</li><li>Weldon, P. R., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+synaptic+ultrastructure+at+neuromuscular+contacts+in+an+amphibian+cell+culture+system.">Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system.</a> J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).</li><li>Tabti, N., Poo, M. -. M., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 137-153 (1991).</li><li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses.">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J. Neurosci. 17, 2990 (1997).</li><li>DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+domains+at+a+cultured+neuromuscular+junction.">Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction.</a> J. Neurosci. 19, 7846 (1999).</li><li>Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+presynaptic+Ca2++dynamics+during+neurotransmitter+release+with+Ca2+-activated+K++channels.">Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels.</a> Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).</li><li>Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+Ca2++entry+preferentially+evokes+release+of+large+quanta+in+the+developing+Xenopus+neuromuscular+junction.">Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction.</a> J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).</li><li>Xie, S. P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+events+in+the+formation+of+neuromuscular+synapse:+rapid+induction+of+acetylcholine+release+from+embryonic+neurons.">Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).</li><li>Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+filopodial+asymmetry+induced+by+synaptic+target.">Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target.</a> Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).</li><li>Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+promote+synaptogenesis+at+the+neuromuscular+junction+via+transforming+growth+factor-beta1.">Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1.</a> J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).</li><li>Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-induced+switching+in+turning+direction+of+nerve+growth+cones.">cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones.</a> Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).</li><li>Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+synaptotagmin+modulates+short-term+synaptic+plasticity+at+developing+neuromuscular+junctions.">Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).</li><li>Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+synapsin+I+correlates+with+maturation+of+the+neuromuscular+synapse.">Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse.</a> Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).</li><li>Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsin+IIa+accelerates+functional+development+of+neuromuscular+synapses.">Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).</li><li>Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiation+of+quantal+secretion+by+insulin-like+growth+factor-1+at+developing+motoneurons+in+Xenopus+cell+culture.">Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture.</a> J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).</li><li>Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+neurotrophins+and+schwann+cell-derived+signals+on+neuronal+survival/growth+and+synaptogenesis.">Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis.</a> J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).</li><li>Dan, Y., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hebbian+depression+of+isolated+neuromuscular+synapses+in+vitro.">Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro.</a> Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).</li><li>Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+regulation+of+neurotransmitter+specification+and+embryonic+neuronal+calcium+spike+activity.">Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity.</a> J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).</li><li>Niewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שלבים עיקריים בשיתוף culturing המוצלח של תאי עצב אחראים ותאי שריר הנם שימוש במבוים עוברים נוצרים מהגידול המושרה של צפרדעי Xenopus כראוי, ונתיחה האספטי המדוקדקת של נוירונים בעמוד השדרה עברו התמיינות וmyoblasts. ביצים מופרות יש להשאירו כפי שעד שהם יגיעו לכ לביים 10 או כדי להעביר אותם במוקדם לעתים קרובות עוצר את התפתחותם. עוברים בריאים מזוהים במראה חלק וחום וצביעה מנומרת לבנה. 22-24 עוברי שלב הם שימושיים ביותר, כי זו היא הנקודה במהלך פיתוח רק לאחר סגירת הצינור העצבית ולפני myocytes שהבדיל באופן משמעותי. בנוסף, תאים מעוברים מבוגרים לא מצליחין לנתק גם בCMF. יש להקפיד בעת הסרת קרום vitelline כפי שהוא שומר מאוד לעובר. הקרום צריך לקרוע באמצעות מלקחיים חדים כך שהעובר יוצא ללא פגע. נוסף precautio החשובn הוא למקם את התאים בזהירות על תחתית צלחת התרבות (ולא לתת להם להתיישב שם). זוהי השיטה מועדפת כמו זה מגדיל את הסיכוי שהתאים ידבקו במנת התרבות. עצבי תפקודית בין העצב ושריר ניתן לקבוע עם הקלטה פשוט postsynaptic ולעתים קרובות ניתן לקביעה על ידי התצפית של התכווצות שרירים ספונטנית לאחר עצבוב. תאי שריר בלתי innervated לא מפרפרים בתרבות. הקלטת postsynaptic לבד שימושית עבור הקלטת זרמים זעירים endplate או פוטנציאלים, אך מדידות של שחרור עורר דורשות גירוי סינפטי, ומתאם של זרמים לפני וpostsynaptic דורש תיקון-מהדק כפול. מלבד שיטת ההקלטה לזווג-תיקון המתואר כאן, ההכנה הזאת מציעה את ההזדמנות להציג את פיפטה שלישית בסומה העצבית 5 זה מאפשר את הדור של פוטנציאל פעולה thaלא יכול להפיץ לvaricosity presynaptic ולהוביל לשחרור של נוירוטרנסמיטר. בנוסף, סוכנים משוערים, כי הם חשבו שיתווכו או לווסת את ההעברה הסינפטית יכולים להיות הציגו את שני צדי סינפסה: באמצעות פיפטה תא השריר או באמצעות דיפוזיה מפיפטה 3 הוצבה בסומה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ציוד / ספקים </td><td> מוכר </td><td> קטלוג / מספר דגם </td><td></td></tr><tr><td> אינסולין transferrin-סלניום </td><td> סיגמא </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> גונדוטרופין כוריוני האנושי </td><td> סיגמא </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Osmometer לחץ האדים </td><td> Wescor </td><td> 5100C שברשות </td><td></td></tr><tr><td> סיכות Minutien </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> סיגמא </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם פתרון </td><td> מתכון </td></tr><tr><td> (א) (רינגר צפרדע הרגיל NFR (במ&quot;מ) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl 2, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (ב) 10% מלוחים </td><td> 10 מ&quot;ל 90 מיליליטר NFR deionized H 2 O </td></tr><tr><td> (ג) CMF (Ca 2 + / Mg 2 פתרון +-חינם) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na +-HEPES, 7.35 PH. </td></tr><tr><td> (ה) מדיה L-15 תרבות </td><td> 50 מיליליטר L-15 מדיה (סיגמא L1518) + 50 המ&quot;ל NFR. </td></tr><tr><td> (ז) K +-פתרון פנימי (במ&quot;מ) </td><td> 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl 2, 10 EGTA, 5 HEPES, 7.3 pH </td></tr><tr><td> (ח) K +-פתרון הפנימי לAmphotericin B (במ&quot;מ) </td><td> 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Tablדואר 1.

simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recording from xenopus nerve-muscle co-cultures

מידע רב על הצימוד של זרמים יוניים presynaptic עם שחרורו של הנוירוטרנסמיטר הושג מהכנות חסרות חוליות, בעיקר התמנון הענקי 1 סינפסה. עם זאת, מלבד ההכנה שתוארה כאן, כמה הכנות חוליות קיימות בו ניתן לבצע מדידות בו זמניות של שחרור הנוירוטרנסמיטר וזרמים יוניים presynaptic. תאי עצב אחראים עובריים Xenopus ותאי שריר ניתן לגדל ביחד במדיום התרבות פשוט בטמפרטורת חדר, הם יהוו סינפסות פונקציונליות בתוך 12-24 שעות, והוא יכולים לשמש כדי לחקור עצב ופיתוח תאי שריר ואינטראקציות הסינפטי במשך כמה ימים (עד יתר מתרחש). יתרונות מסוימים של עמיתים לתרבויות אלה סביב הכנות חוליות אחרות כוללים את הפשטות של הכנה, את היכולת לשמור על התרבויות והעבודה בטמפרטורת חדר, ונגישות המוכנה של הסינפסות נוצרת 2-4. ההכנה כבר בשימוש נרחב כדי ללמוד את מאפייני biophysical של תעלות יונים presynaptic והרגולציה של שחרור משדר 5-8. בנוסף, ההכנה הלוותה עצמו לשימושים אחרים, כולל מחקר של התולדה וsynaptogenesis neurite 9-12, מנגנונים מולקולריים של הנוירוטרנסמיטר שחרור 13-15, התפקיד של שליחי diffusible בneuromodulation 16,17, ובפלסטיות הסינפטית מבחנה 18 - 19.

האיור 4B מראה נוף הגבי של חוט שדרה / myotome מבודד מייד לאחר הסרתו משלב 22 Xenopus העובר 4C. איור מראה כי, לאחר הסרת עור ודגירה בCa 2 +-Mg 2 +-פתרון חופשי (CMF, פתרון ( ג)), תאי לנתק ל&quot; ערימת חול &quot;והם מוכנים לציפוי. מייד לאחר ציפוי לתאים בינוניים התרבות יפגין שונות מורפולוגית קטנות (איור 5 ב), אבל קח בצורות שונות לאחר עשרים וארבעה שעות בתרבות. תאי שריר הופכים בצורת הציר זמן שנוירונים יישארו כדוריים תוך neurites הארכה שvaricosites המשוכלל בסינפסות עם תאי שריר (איור 6). הקלטת סימולטני לזווג תיקון מvaricosity סינפטי ותא השריר סינפטי (איור 7) חושפת את הזרמים פנימה והחוצה presynaptic קשורים בשחרור של נוירוטרנסמיטר וresultant מעורר זרמי postsynaptic. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1:.. זוג רבייה של צפרדעים בדלי הזדווגות על גבי מסך ב &#39;: צפרדעים בamplexus עם ביצים מופרות. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2:.. שלב &quot;מתאים&quot; 22 עובר B: שלב &quot;לא מתאים&quot; 28 עובר. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ&quot;מ. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3: 22. עובר שלב לפני הסרת vitelline הקרום ומעייל ריבה. החץ מצביע על הקצה החיצוני של מעייל הריבה. קרום vitelline שומר באופן הדוק לembrיו והוא כמעט בלתי נראה ב &#39;:. עובר חשוף. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ&quot;מ. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4: 22 עובר במה עם קו מקווקו מציין לביתור חלק ב &#39;:.. חלק הגבה מבודד חריפות של עובר; &quot;ד&quot; ו &quot;V&quot; מתייחסים להיבטי הגב וגחון של העוברים, ואילו &quot;מ&quot; ו&quot; n &quot;מציין את המיקום המשוער של mytomes והצינור עצבי C:.&quot; ערימת חול &quot;של תאים לאחר 60 דקות בCMF. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ&quot;מ ול0.5 מ&quot;מ לB ו-C. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5:. נוף 5x כוח של תאים בתרבית מייד לאחר ציפוי. ב &#39;: את התרבות ב40X. סולםבר מייצג 40 מיקרומטר ול5 מיקרומטר לB. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. צומת Neuromuscular בתרבות עם זיהוי של סומה העצבית (S), varicosity presynaptic (V), ותא השריר postsynaptic (M). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="איור 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> איור 7. זרמי presynaptic (למעלה) וpostsynaptic (תחתון) ראו בתגובה לבקשה של מתח 10 mV מצטבר צעדים שהוצגו לvaricosity presynaptic מ-30 mV ל40 mV. צעדי מתח מופיעים לצד כמה מעקבות presynaptic. הפוטנציאל מחזיק עבור שני התאים היה -70 mV.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures at JoVE.com

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

סרטון זה מדגים את הנהלים משמשים לגידול תרביות ראשוניות של עוברי<em&gt; Xenopus</em&gt; עצב ותאי שריר והתועלת של תכשיר זה לביצוע הקלטות מהדקות סימולטניים לפני ואחרי-הסינפטי תיקון.

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ<em&gt; Xenopus</em&gt; עצבי שרירי Co-תרבויות

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

10.9K Views.  David Geffen School of Medicine at UCLA. סרטון זה מדגים את הנהלים משמשים לגידול תרביות ראשוניות של עוברי Xenopus עצב ותאי שריר והתועלת של תכשיר זה לביצוע הקלטות מהדקות סימולטניים לפני ואחרי-הסינפטי תיקון.

Video: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biology

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים<em&gt; בחי</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes

Heterologous expression of connexins and innexins in Xenopus oocytes is a powerful approach for studying the biophysical properties of gap junctions (GJs). However, this approach is technically challenging because it requires a differential voltage clamp of two opposed oocytes sharing a common ground. Although a small number of labs have succeeded in performing this technique, essentially all of them have used either homemade amplifiers or commercial amplifiers that were designed for single-oocyte recordings. It is often challenging for other labs to implement this technique. Although a high side current measuring mode has been incorporated into a commercial amplifier for dual oocyte voltage-clamp recordings, there had been no report for its application until our recent study. We have made the high side current measuring approach more practical and convenient by introducing several technical modifications, including the construction of a magnetically based recording platform that allows precise placement of oocytes and various electrodes, use of the bath solution as a conductor in voltage differential electrodes, adoption of a commercial low-leakage KCl electrode as the reference electrode, fabrication of current and voltage electrodes from thin-wall glass capillaries, and positioning of all the electrodes using magnetically based devices. The method described here allows convenient and robust recordings of junctional current (Ij) between two opposed Xenopus oocytes.

Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes

Here we present a protocol to express gap junction proteins in Xenopus oocytes and record junctional current between two apposed oocytes using a commercial amplifier designed for dual oocyte voltage-clamp recordings in a high side current measuring mode.

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

Heterologous expression of connexins and innexins in Xenopus oocytes is a powerful approach for studying the biophysical properties of gap junctions ...

Electrophysiological Recordings For Assessing Neuronal Regenerations in Co-cultured Spinal Cord Slices

Put a Petri dish with a coated microelectrode array inside under a stereomicroscope. Bring the array into focus, and center a six-microliter droplet of chicken plasma on the electrode array. Using a small spatula, carefully slide two spinal cord sections with their ventral sides facing each other into the plasma droplet.
Next, add eight microliters of thrombin around the chicken plasma droplet. Then, use the pipette tip to carefully mix and spread the chicken plasma and thrombin mixture. Just before the chicken plasma and thrombin mixture becomes too stringy and starts to coagulate, aspirate the excess liquid. Then, cap the Petri dish and place it in a humidified chamber.
Place the chamber inside an incubator at 37 degrees Celsius for about an hour. After incubation, carefully add 10 microliters of nutrient medium to the sample. Cap the Petri dish and place it back into the incubator for an additional 45 minutes. Next, place each of the multi-electrode array culture assemblies into a roller tube and add three milliliters of nutrient medium. Close the lid tightly and place the roller tube into the roller drum. Rotate the drum at 1 to 2 RPM in the incubator at 37 degrees Celsius.
Using sterile rubber-tipped forceps, remove the multi-electrode array culture assemblies from the roller tube and place them into a Petri dish under a stereomicroscope. Bring the tissue into focus and verify that the two slices are fused. Next, hold the assembly steady and place a scalpel blade in the groove of the multielectrode array close to the tissue slices. Hold the scalpel rather horizontally and then lift the scalpel handle up, but let the scalpel blade stay in the groove of the array in such a way that the blade rolls from base to tip, cutting through the tissue, covering the groove.
Sever any residual tissue connections with a 25-gauge needle tip if necessary. Work only in the area within the groove, and do not touch the tender edges. Put the multi-electrode array culture assemblies back into the roller tube and add three milliliters of fresh nutrient medium to the cultures. Then, place the roller tube back onto the roller drum in the incubator at 37 degrees Celsius.
Mount a multi-electrode array culture assembly into a recording chamber and apply about 500 microliters of extracellular solution to the array. Then, mount the assembly on the microscope. Wait 10 minutes for the system to stabilize, and then, record basic spontaneous activity from each of the activity-detecting electrodes for 10 minutes. Repeat the recordings a total of two times.
To ensure stable extracellular conditions, exchange the extracellular solution after every recording session. If desired, disinhibit the network by applying extracellular solution containing one micromolar of strychnine and 10 micromolar of gabazine and wait for at least two minutes before recording the electrical activity.

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים

הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

רישומים אלקטרופיזיולוגיים להערכת התחדשות עצבית בפרוסות חוט שדרה בתרבית משותפת

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

רישומים אלקטרופיזיולוגיים להערכת התחדשות עצבית בפרוסות חוט שדרה בתרבית משותפת

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים