我々はASOSと研究室に供給するための全体としてICVボーラスの手術に関連するだけでなく、イシス医薬品のアドバイスを提供するためにイシス医薬品からぞんざいメイザーに感謝したいと思います。さらに、我々はこの記事のレビューにキャリーシェイナーに感謝したいと思います。 TMMとSLDはNIH助成P50AG005681、K08NS074194、そしてR01NS078398によってサポートされています。

下記のプロトコルは、セントルイスにあるワシントン大学の制度動物実験委員会によって承認され、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所に準拠しているされています。これは手術を行うのは初めてであるならば、我々は14を開始する前に、導入などの齧歯類の手術でJoveの記事を見てお勧めします。 ASOSは、浸透圧ポンプの注入および単一ICVボーラス注入の両方を通ってマウスCNSに送達することができる。このため、以下に詳述する手順は、2つのセグメントに分割される。それぞれの方法の長所と短所は、ディスカッションセクションで上触れることになります。プロトコルで使用される座標は、成人C57BL6とB6C3マウス用です。対応するラット座標は表1に見出すことができる。 ALZET浸透圧ポンプ 1。アルゼット浸透圧ポンプの調製<ol><li>無菌DRAPを置くeと直接無菌維持するためには何も触れないように注意しながら、慎重にその上に次の項目をドロップ：浸透圧ポンプ（S）、フローモジュレータ（S）、1 mlの滅菌シリンジ（S）、メスの刃、およびチューブのセクションを（チューブ= 5ポンプの1個）。 14日、28日、および42日（ 図2A）：マウスの場合は、ポンプのための3つのオプションがあります。 </li><li>キャップを取ると15〜20ミリリットル食塩水で滅菌50ミリリットルコニカルチューブを埋める。最大6組み立てポンプはコニカルチューブ毎に添加することができます。 </li><li> 100％エタノールでP60ペトリ皿を埋める。エタノールへのカテーテルの適切な数を追加します。マウスについては、カテーテルの長さは、2.5 mmである。 </li><li>必要に応じて1.5のような多くのmlのエッペンドルフチュー​​ブに各ASOをフィルタリング。とチューブを埋めるために無菌の0.9％生理食塩水で満たされたエッペンドルフチュー​​ブを含む。 </li><li>すべてが準備されると、滅菌手袋を置く。無菌ではない何かに触れていないことを確認してください。必要に応じて手袋を変更してください。 </li><li>各ASOが使用されるために1mlのシリンジを埋める上部の穴に針を入れ、ゆっくりと過剰漏れまで記入してくださいとloadpumps。ポンプのすべてが満たされるまで継続する。 </li><li>フローモジュレータをキャップを取るとポンプに挿入。 3〜5ミリメ​​ートルギャップを残して、ほぼすべての中で道の流れが変調器を押してください。 </li><li>手術用メスの刃を使用し、5等しいセグメントにチューブの各部分をカット。チューブの一枚を取り、1ミリリットルのシリンジを用いて滅菌した生理食塩水でいっぱいにし、チューブの一端に流入変調器の上部を挿入します。その後、エタノールからカニューレを取ると、チューブのもう一方の端に接続します。ポンプが完全に組み立てられている。 </li><li>プライミング用食塩水で滅菌50ミリリットルコニカルチューブに完全に組み立てられたポンプを配置します。プライミングは、薬物送達を開始するために流体に浸るだけでなく、適切な温度に来るようにポンプを可能にします。プライミング時間：14日ポンプ：4-6時間、28日間ポンプ：40時間、42日ポンプ：60時間。ポンプの組み立てが完了したら、きれいにコニカルチューブと場所をキャップ37℃手術までC水浴。 </li></ol> 2。プレ外科手順<ol><li>エリアを殺菌し、無菌のフィールドを作成するテーブルトップとstereotaxに滅菌ドレープを置くために70％エタノールですべてを拭う。全体の手術を通して滅菌野に留意することが重要です。ビーズ滅菌、加熱パッド、ライト、デジタル読み出し、及び酸素/イソフルランシステム（ 図1）は、次の電源をオンにします。 </li><li>我々は日常的にそうであるように、単一の手術や手術のバッチ全体のどちらかをやっている場合、以下の項目が必要になります鉗子の1ペア、1湾曲した止血、小さなはさみの1組、小さな曲がっ鈍化はさみの1ペア、1ラットの骨のカッター、1ストレート止血、5-0ナイロン縫合糸、70％エタノールで1コニカルチューブ、95％エタノールで1円錐管、ヨウ素1コニカルチューブ、過酸化水素と1コニカルチューブ、滅菌綿棒のパッケージ、スーパーの1瓶のり、1チューブ抗生物質軟膏、眼1チューブ潤滑剤、および1電気シェーバー。 </li><li> 15秒のためにビーズ滅菌器にはさみ、鉗子、曲線止血の両方の対の先端を置きます。取り外し、70％エタノールに入れます。複数の外科手術を行う際に、動物の間で器具の先端を再滅菌する。 </li><li> 4％のイソフルランとO 2から0.4 L / minで、チャンバーに直接ガスの流れを回します。我々は麻酔の適切な量を提供していることを確認するために、少なくとも1つの年間キャリブレーション当社イソフルラン/酸素システムを持っている。チャンバー内にマウスを置き、呼吸が著しく遅くなるまで待ちます。マウスを取り外し、マウスは完全に無意識であることを確認するためにつま先のピンチを実行します。 </li><li>目の間で最大の肩の上から毛を剃る。マウスが目を覚ますが開始された場合は、マウスがつま先のピンチで確定、再び完全に無意識になるまで、チャンバー内に戻ってマウスを置きます。 stereotaxに麻酔マウスを置き、鼻の上にノーズコーンを押してください。歯や骨が壊れやすいように穏やかである。 </li><li>マウスを麻酔維持するstereotaxへのガスの流れを演出します。時折マウスは手術全体のつま先のピンチと完全に無意識であることを確認するためにチェックすることが重要です。耳の棒で頭を固定します。私たちは、側脳室を対象とするものの、完全にレベル頭蓋骨が原因心室の大きなサイズにする必要はありません、レベリング耳バーを好む。 </li><li>メンテナンスのために2.0％イソフルランレベルを下げます。それぞれの目の上に軽くたたくの眼軟膏。ビデオで見られるように首と頭のベースのみが露出されるように、マウスを上に滅菌ドレープを築く。次いで、剃毛領域の中心から開始しスワブ綿棒は、ヨウ素に浸した綿、続いて95％エタノールに浸した綿で最初に外側に移動する円を描くように頭と首の上部を払拭して手術領域を消毒する。 </li><li>我々は確実に直腸プローブフィードバック温度制御された加熱システムを使用することをお勧めしますマウスの温度が安定した37℃のままマウスの温度が手術中に低下した場合は、手術後の回復は時間がかかることがあり、その結果低体温は、タンパク質タウ15微小管関連の過剰リン酸化を含め、異常なタンパク質活性につながることができます。暖房システムを設定した後、あなたは今、手術を開始する準備が整いました。 </li></ol> 3。アルゼット浸透圧ポンプの注入<ol><li>手術を開始する前に、滅菌手袋の新しいペアに置く。その後、鉗子とはさみの小さなペアを使用して、目の間に動物の頭蓋骨上記の首の付け根からまで皮膚の切開をする</li><li>上向きに曲線と鈍いはさみを取り、左後肢に向かって戻って首の付け根の皮膚の下にスライドさせます。全く抵抗があってはなりません。がある場合は、ハサミを削除して再度実行してください。これは浸透圧ポンプのための皮下ポケットを形成している。 </li><li>のWiPEは綿棒続い滅菌綿棒できれいに頭蓋骨は、ブレグマを高めるために過酸化水素に浸した。 </li><li>ポンプの無菌性を維持するために、ポンプを含んで50ミリリットルコニカルチューブを拭う。慎重にポンプがコニカルチューブの側面に触れないように余分な世話をして、湾曲した止血剤を使用してコニカルチューブからポンプを取る。鉗子でポンプのベースを持ち、湾曲した止血剤との道の残りのフローモジュレータを押してください。 </li><li>流れ変調器とチューブが湾曲した止血と会うポンプホールド。首の付け根の皮膚の下にポンプを挿入し、それが抵抗なく行く限り左後肢に向かって押し戻す。カテーテルのタッチは何もさせないように注意してください。 </li><li>湾曲した止血剤を使用すると、トップは台座を満たしている溝でカニューレをつかむ。位置にカニューレドライバを移動して、所定の位置に固定します。 </li><li>カニューレのベースにスーパー接着剤の一滴を置きます。膿チューブがまっすぐに指摘されるように、ドライバと位置にカニューレのhがトップ。 </li><li>ブレグマにカテーテル先端をタッチしてデジタル表示上の座標をゼロに。カテーテルを上げ、右後方0.5ミリメートル（ 図2B）に横方向に1.1ミリメートルを移動します。湾曲した止血剤と道の皮膚を差し出す。 </li><li>プラスチックカニューレベースがしっかりと頭蓋骨の上部に押し付けられるまで、頭蓋骨を通して薄い金属カテーテルを駆動します。金属カテーテルは相対薄い頭蓋骨のためマウスで頭蓋骨を介して直接駆動することができます。ラットを用いた場合は、カテーテルを下げる前に、頭蓋骨に穴を開ける。 </li><li>離れて頭蓋骨からその上に接着剤を持っている任意の肌を引き出します。場所にカニューレ/カテーテルを保持カニューレドライバと、完全に乾燥させる接着剤のために1〜2分待ちます。 </li><li>カテーテルの配置を評価するために、練習をすると、チューブ（ 図2C）を通じて2.5％FastGreen染料の20-40μLを注入します。 2〜3分、perfus待ち電子1X PBS 0.03％ヘパリンとマウス、脳を取り外します。カテーテルサイトで冠状カット。カテーテルが心室に配置した場合には、染料は、マウスの脳室系（ 図2D）を通じて灌流される。 </li><li>ドライバを上げながら湾曲した止血剤のある場所でカテーテルを保持します。ゆっくりカニューレが適切に頭蓋骨に固定されていることを保証するために止血剤を放出する。 </li><li>綿棒で、カニューレの上に下に押します。カニューレの上部とベースとの間の木立にラットの骨切りを取り付けます。まだ綿棒で押しながらカニューレの上部を切り取る。バリカンのレベルを試してみて、続けるように頭蓋骨からカニューレをデタッチしない。カニューレが動転来ない場合は、速やかに再接着剤、さらに2分間綿棒で圧力をかける。 </li><li>右カニューレ上の余分な注意を払って、5-0縫合糸、定期的な止血剤、及び鉗子、フルオープンに沿って縫合糸を使用した。私たちはのrunninを使用頭蓋骨の上に大きな切開のためにgの水平マットレス縫合（ 図5を参照）。 </li><li>頭と首の上に抗生物質軟膏のDABを適用します。緩め耳バーとノーズコーンを緩める。回復のための温暖化パッド上stereotaxと場所からマウスを外します。一般的に10〜30分に至るまで、回復の期間に密接したマウスを監視します。マウスの周りを歩いて、自分自身をグルーミング開始されるまで2〜3日毎分をチェックしてください。 </li></ol> 4。術後ケア<ol><li>最初の週のための手術後、毎日マウスを監視します。 </li><li>マウスが痛みや苦痛にあると表示された場合、我々は痛みを和らげるために、最大5日間毎に24時間一度カルプロフェンの5 mg / kgを皮下注射でマウスを提供するお勧めします。 </li><li>感染症があるように表示された場合は、寛大に毎日領域に抗生物質軟膏を適用し、傷が正しく癒していることを確認するために出席する獣医師に相談してください。 </li><li> R5-0ナイロン縫合糸を縫合糸からの刺激を防ぐために、手術後7-10日を残したまま削除。 </li></ol> 5。アルゼット浸透圧ポンプを変更したり、削除するポンプを積極的にASOを注入行われた後、それがどちら変更または完全に除去することができる。 <ol><li>以下の変更と上記のように同じ事前手術手順に従ってください：1）あなたは、湾曲したハサミ、湾曲した止血、ラットの骨のカッター、またデジタル表示を必要としませんし、マウスの代わりに頭を準備中の2）、剃るとポンプとチューブの接合部にマウスの裏を消毒する。 </li><li>鉗子やハサミを使って、ポンプ/チューブ接合に垂直、マウスの背面に1.5センチメートル切開を行います。慎重にカテーテルをJAR可能性があるので大幅にチューブを引っ張っ/押さずに切開のポンプを引き出します。 </li><li>ポンプを削除するには、約0.5センチメートルフローモジュレータ上記チューブをクリップし、チューブをtに瞬間接着剤に触れOシールは、それはシャットダウンします。乾燥させる接着剤のために1〜2分待ちます。切開と縫合閉鎖にチューブバックを置きます。縫合し、皮膚や場所温水回収パッド上のマウスの上に軽くたたく抗生物質軟膏。 </li><li>ポンプを変更するには、新たに95％エタノールでいっぱい10cmディッシュと一緒にポンプの準備ができました。カテーテルは、新しいポンプには必要ありません。 </li><li>ピンセットで新しいポンプをつかむ。エタノールに指を浸し、ポンプを手に取り、フローモジュレータを捨てる。その後、慎重にゆっくりとチューブとカニューレに装着フローモジュレータから古いポンプをやってのける。できるだけ早くそれがオフになっているように、ゆっくりと流れ変調器は、マウスの外側に触れたことがないことを確認し、上に新しいポンプをスライドさせます。 </li><li>背中の皮下パケットに切開を通して新しいポンプを再挿入し、皮膚を縫合。回復パッドの傷や場所マウスで軽くたたく抗生物質軟膏。 </li><li>ただ、ポンプ注入と同様に、電話をチェックするために手術後、毎日マウスを監視AIN /不快と感染。必要と認めるとしてカルプロフェンと抗生物質で治療する。 </li></ol> ICVボーラス 6。プレ外科手順<ol><li> ; 2）滅菌水および負荷と10μlのハミルトンシリンジと針をきれいに1）あなたが湾曲したハサミ、湾曲した止血、またはラットの骨のカッターを必要としません：以下の変更と上記の第2節と同様に手術前の手順に従ってくださいASO、3）カニューレドライバーが位置していた定位固定装置に注​​射器と針を取り付けてください。 </li></ol> 7。 ASOのボーラス注射<ol><li>鉗子とはさみの小さなペアを使用して、目の間にまで首の付け根から切開を行います。 </li><li>綿棒はブレグマを強化するために過酸化水素に浸した綿続い滅菌綿棒、きれいな頭蓋骨を拭きます。 </li><li>所定の場所に注射器/注射針を移動し、固定します。針のベベル部分が後方を向くようにしてください。下段針はブレグマをそれに触れるまで。座標のすべてをゼロ。右1.0ミリメートルと0.3ミリメートル前方（ 図3A）に横方向に針を移動します。 </li><li>針穴が頭蓋骨の上部と同じ高さになるだけになるまでゆっくりと頭蓋骨を通して針を駆動します。繰り返しますが、これはマウスの頭蓋骨の薄さが原因で行うことができます。ゼロのz座標は1mm /秒（ 図3B）の割合で-3.0 mmの針を下げる。針の周りにシールするための脳のために2〜3分待ちます。 </li><li>毎秒1μLの割合でASOの完全10μLを届ける。 2〜3分待ちます。この率が異なる薬剤間で異なるかもしれませんが我々は、心室にASOSは1μlの注入速度を使用しています。練習するとき、2.5％FastGreen染料の10〜20μlのを提供することで、針の適切な配置を確認してください。染料注入後すぐに1X PBS 0.03％ヘパリンとマウスを灌流し、染料が脳室系（ 図3C）にあることを確認するために脳の冠状断面を作る。 </li> &lt;李&gt;針の基部に頭蓋骨に対して綿棒をホールド。毎秒1ミリメートルの割合で針を上げる。とすぐに針が頭蓋骨の外にあるように、針穴の上綿棒を転がし、漏れる任意のASOを防ぐために1分間保持する。 </li><li> 、閉じた皮膚を縫合抗生物質軟膏を適用し、温水回収パッド上の場所のマウス。 ASO濃度に依存し、それは完全に回復するために数時間を20分かかる場合があります。 </li><li>ただ、ポンプ注入と同様に、痛み/不快感や感染を確認するために手術後、毎日マウスを監視します。必要と認めるとしてカルプロフェンと抗生物質で治療する。 </li></ol>

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著者はイシス医薬品から自分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​受け取る。

ビデオに示されているようにCNSでグローバルに薬を提供する能力の両方を学び、使いやすい、非常に強力な手法です。慣例により、単一のポンプ注入またはボーラスICVが同時に処理されるようにしたマウスの大集団を考慮して、10分で完了することができる。マウスの行動のためのより大きい数字は有意差を見るのを助けるために重要であるので、これは、行動の読み出しを用いた研究のために特に便利です。 ポンプやボーラス注射経由 ASOSの提供経験に基づいて、我々は、それぞれの方法にいくつかの長所と短所を観察した。これらは私たちの研究室での意見であり、すべてのマウスおよびラットモデルに対して真ではないかもしれないことに注意すべきである。 我々は、ポンプを使用することの利点は、ASOが時間のかなり長い期間にわたって分散されるので、ASOの高い量を送達する能力である見つける。これは通常、アクティブ後長く持続ノックダウンまたはスプライシングに相当ASO注入は、けれども、これは必ずしもそうでないかもしれません。ポンプはまたASO配信の正確な時間枠（14日、28日、または42日）を可能にし、ポンプはさらに長くアクティブASOの注入を可能にするために一度に変更することができます。しかし、複数回のポンプを変更すると、適切に液体を吸収するポンプを防ぐポンプの周りに繊維のポケットの形成に起因するばらつきが増大することに気づいた。ポンプの欠点は、一部のマウスだけでなく、他のポンプなどを許容しないことである。作業しているトランスジェニックラインがより脆弱である場合、ポンプがあまりに面倒かもしれません。ポンプは、また別の手術を追加しました麻酔にマウスを施し、最終的な注入した後に除去する必要があります。行動の仕事をしている場合、ポンプの存在は、マウスのいくつかの挙動に影響を与えるので、ポンプを除去し、回復の少なくとも1〜2週間を可能にするために特に重要である。 ICVボーラス注射で、一つの利点はコストです。があります先行投資は、注射器や注射針を購入するが、購入するためのポンプ/チューブ/カテーテルないが存在しないので、時間をかけて、ボーラス注射はよりコスト効果的です。全体的に、カニューレとポンプの不足のためにICVボーラス注射でアップキープレスがあります。私たちは、ICVボーラスが若いおよび/またはより脆弱なマウスにASOSを配信するために使用することができることもわかります。 ICVボーラスの欠点は、単回注射であることである。できるだけ全体のASOはこの経路を介して配信することができ、使用中のASOの作用持続時間が短い場合、ノックダウン/スプライシング効果も短命になりません。 浸透圧ポンプと同様、ICVボーラス両方はASOSを提供する能力を持っていることができるノックダウンタンパク質または全体のげっ歯類の中枢神経系における遺伝子のスプライシング、複数の神経科学関連分野で幅広い用途を有する技術を変える。あなたは最高のあなたのために適した行政のどのルートが不明な場合、我々は、配信の両方の方法を操縦することをお勧めpecific研究。

いくつかの薬物は、直接中枢神経系（CNS）の配信を要求する、血液脳関門（BBB）を通過することができない。 BBBを回避するために、薬物は、記載された方法を用いて脳内に直接送達することができる。我々の研究室およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの用紙の詳細な明細書フォーカス（ASOS）が、そのような小分子、抗体、遺伝子治療ベクター、 等のような他の薬物は、。、また全く同じアプローチを介して送達することができる。 特定のタンパク質は、神経変性疾患の病因に重要な役割を果たしている。このようなタンパク質は、しばしば有毒種を形成し、集合体に蓄積し、最終的な神経細胞死と3-4その後の神経疾患につながる。これらの疾患の進行を遅らせる、あるいは停止させるための努力で、一つの治療選択肢を直接原因となるタンパク質を標的とし、減少するかもしれない。しかしながら、これらのタンパク質は、しばしば、電子には困難で、CNSを介して発見された遍在<html> ffectively地球規模でそれらをターゲットにしています。 CNS全体にわたって遺伝子を標的とするために、我々はBBBをバイパスする側脳室を介してマウスの脳脊髄液（CSF）中にASOSを管理する。この具​​体的な方法は、ASOSの広範な分布を可能にする、全体の脳と脊髄を浴びるマウスの脳室系を利用する。我々は）18-20 merのRNAのように直接、標的mRNA配列を結合する分子と、ASOの化学修飾に応じて、ノックダウンまたはBにつながるのmRNAを分解する）リクルートのRNase HであるASOSを使用する選択的スプライシング1シフト、2,16,17。なお、複数の分子がshRNAを含む、 インビボで特異的タンパク質をノックダウンするために存在することに留意すべきである。これらの分子は、この記事の焦点ではないので、私たちはより良い細部のノックダウン作用のメカニズムとそれぞれ5-6の長所/短所その記事を確認するためのリーダーを演出します。 jove_content &quot;&gt;前の仕事では、我々は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）7（ 図4）のトランスジェニックラットモデルにおいて蛋白質スーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）をターゲットにASOSを使用している。変異SOD1では、すべてのALSの約2％で発生例8は 、それが最近SOD1は発症が大幅に7に増加した後にALSトランスジェニックラット、生存中の総SOD1レベルを減少させることにより同様に9-10。散発ALSにおいて重要な役割を果たしている可能性があるという仮説が立てられているものの、これらの重要なデータは、最初にあったCNSにおけるASO治療は神経疾患モデルに関する深い肯定的な影響を及ぼす可能性があることを示すためにして以来、人間のSOD1をターゲットASOS入力し、正常に最小限の副作用（Clnicaltrails.gov NCT01041222）との第I相臨床試験を完了した、など神経の2012 64 回年次アメリカンアカデミーで発表。II相試験が現在進行中であるフェーズを楽しみにしASOSを移動する予定です。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; SOD1は、神経疾患の治療にASOSを使用しての最初のデモンストレーションだったターゲットが、他のいくつかの研究はその後さまざまな病気とそれぞれの標的タンパク質を見て行われてきた。 2010年と2011年で、そのASOSは、運動ニューロン2（SMN2）のタンパク質生存のシフトスプライシングは、脊髄筋萎縮（SMA）のトランスジェニックマウスモデルで使用されていたし、病気の表現型11,12の有意な改善をもたらした。これらのスプライシングASOSは、フェーズに今SMA（Clinicaltrails.gov NCT01494701）の子供の私の臨床試験です。また、最近ハンチンチンタンパク質のレベルがベースライン13に戻った後でも、ハンチンチン遺伝子を標的ASOSの過渡投与が劇的にハンチントン病マウスモデルを救出することができたことが示された。 これらの研究の全てにおいて、ASOS、全遺伝子のレベルを減少または遺伝子スプライシングを介して変更する側脳室に配信された全体CNS。浸透圧ポンプと単一のボーラス注入の両方がCSFにASOSを送達するために使用することができる。脳室内（ICV）ボーラスは、高速、一回注入であるのに対し、ポンプは、ゆっくりと、連続的な配信を可能にします。我々は、単一のトランスジェニック系統でポンプとボーラス間の直接比較を報告していないのに私たちは、成功を収めて、これらのメソッドの両方を使用している。 CNSのASOSを使用すると、総タンパク質レベルを減少および/またはいくつかのタンパク質のスプライシングを変更するための強力な方法である。我々は、神経疾患の治療薬として独占的にASOSを使用していますが、私たちは、他の分野でも、この技術の恩恵を受ける可能性があることを認識しています。限り、目的のタンパク質は、CNSで発現させ、究極の目標は、実証技術でASOSを用いた遺伝子発現におけるCNS全体の変更を実現することを目的とするように非常に有用である可能性があります。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

血液脳関門を通過できないため、特定の薬物は、直接中枢神経系（CNS）に送達される必要がある。私たちの研究室では、ここにビデオに示す技術もCNSに他の薬剤の茄多を提供するために使用することができますが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASOS）に特に焦点を当てています。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASOS）はノックダウン配列特異的な目標1と同様に、特定の遺伝子2のシフトアイソ比が能力を持っている。マウスのCNSにおける広範囲の遺伝子ノックダウンまたはスプライシングを達成するために、ASOSは、我々が動画を示すどちらの投与の2つの別個の経路を使用して脳に送達することができる。 最初は、外科的に側脳室に注入されるカテーテルに接続アルゼット浸透圧ポンプを使用しています。これは、ASOSが連続時間の指定期間のCNSに注入することができます。第二は、ハイテクの単回ボーラス注射を含む右側脳室にASOのGH濃度。研究の必要性に応じて、1つの方法は、他よりも好ましいかもしれないが、両方の方法は、全体の脳および脊髄にASOを提供するために、マウス脳の脳室系を使用する。

ポンプ注入またはICVボーラス注射後の指定された時間（私たちは日常的に4週間使用）した後、ASOSの有効性をテストすることが重要である。我々は、両方の定量的リアルタイムPCRと同様に公開され、例えばいずれかのウェスタンブロットまたはELISA（ 図4を用いてタンパク質レベルを使用してmRNAレベルで、標的遺伝子のレベル/アイソフォームを測定するために、脳および脊髄の様々な領域を撮影推薦する）。これは、異なるCNS領域全体ASOの有効性を判断するのに役立ちます。標的タンパク質の半減期が長い場合、我々は最大のタンパク質のノックダウンやスプライシングを評価するためにASOの注入後に長く待つことをお勧めします。 これは、オリゴ分布をテストすることも重要である。同側および対両半球を介して配布をポンプ注入の結果、より高いASO濃度は、多くの場合、脳室系16に近い領域において見られるものの。 ICVボーラス注射はもっとunifoをもたらすCNS〜16オリゴRM流通、効果は長くは続かないかもしれないけれども。私たちは、サウスウェルらのリーダーを演出します。ボーラスオリゴ分布16対ポンプの直接比較を見て。 また、それぞれのASOは、生体内でわずかに異なる動作をしますので、複数回投与と同様ASOSの作用持続時間のテストをお勧めします。 ASOSは、通常数ヶ月後ASO配信を持続ターゲットノックダウンまたはスプライシングと、行動の比較的長い期間を持っている。加えて、いくつかのASOSは他より良い仕事になり、いくつかの遺伝子標的は他よりノックダウンに容易になります。このため、リード候補を決定するために、ASOSをスクリーニングする際、我々は最初のパスとしてASO当たりN = 4-6成体マウスに生体内で少なくとも3-5 ASOSのテストをお勧めします。 ASOS以外の薬物を使用している場合、それはまた、パイロットにとって重要となる理想的な薬物濃度、薬物作用の持続時間、およびCNS薬その具体的な化合物の配布。 <img alt="表1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> 表1。手術座標は。浸透ポンプを移植するだけでなく、脳室内（ICV）ボーラスを行う際にマウスとラットの両方で右側脳室をヒットするために使用される座標。両方の座標は、ポンプとICVボーラスのため、右の側脳室を対象としています。これらは、我々は最も経験があり、ASOの優れたディストリビューションを提供して知っているので、我々は、2つの異なるセットを使用。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> 図1。定位セットアップ。アルゼットポンプとボーラス注入の手術のために（A）必要な定位装置。ⅰ）ガラスビーズは、滅菌R。ⅱ）デジタル読み出し。ⅲ）動く腕と定位ベース。ⅳ）温度制御加熱パッド。ⅴ）酸素システム/イソフルラン。ⅵ）イソフルラン商工会議所は、（B）はノーズコーンと耳バーの間近します（C） 2つの添付ファイルが必要です。左：シリンジ/ ICVボーラス注射用針ホルダー。右：浸透圧ポンプ注入のカニューレドライバー。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> 図2。浸透圧ポンプ注入アルゼット。マウスについて（A）アルゼット浸透圧ポンプオプション。 14日ポンプ（0.25μL/時）、28日ポンプ（0.25μL/時）、42日ポンプ（0.15μL/時）ブレグマからポンプ注入の（B）座標：後部-0.5ミリメートル、横-1.1ミリメートル（右）、及び腹側-2.5ミリメートル（カテーテルの長さ）。（C）を介して、カテーテルを駆動した後、頭蓋骨と接着カニューレ、色素が側脳室カテーテルの適切な配置を評価するために、カテーテルを介してフラッシュされます（D）灌流脳はすぐに（C）のように投与した後に染料。カテーテルが正常に心室に配置されている場合は、染料は、マウス脳室系全体に分配される。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> 図3。脳ボーラス注射。 （）ブレグマからボーラス注射の座標：0.3ミリメートル前方、横-1.0ミリメートル（右）と、腹-3.0ミリメートル（B）腹頭蓋骨-3.0ミリメートルを通して針を駆動した後、染料をシリンジを通じてプッシュされます。ダウンロード（B）のように染料投与後の保存心室。（C）灌流脳内の針の適切な配置を評価する。針が正常心室に配置されている場合染料は、マウスの脳室系全体に分配される。 <img alt="図4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> 図4。アンチセンスオリゴヌクレオチドは（Smith らから直接取得図7）、in vivoでラットSOD1を減らす。 （AD）アンチSOD1オリゴヌクレオチドはスクランブルr146192またはSODを100μgの/日に正常ラットの右側脳室に28日間注入したSOD。脳と脊髄から（）内因性SOD1 mRNAレベルを定量RT-PCRによって測定された。（ B）SOD1とチューブリンタンパク質のレベルはASOの注入に続く。チューブリンとSOD1用（CとD）のタンパク質レベルは、脳次注入の異なる領域のために定量化した。プレセニリン1またはGSK-3＆ベータに対する（E）ASOS;非トランスジェニックマウスと右前頭/側頭皮質で評価mRNAレベルの右側脳室に2週間にわたって注入した。臨床調査のためのアメリカの社会からの許可を得て複製。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> 図5。水平マットレス縫合を実行する。5-0ナイロン縫合糸は、カニューレを介してより多くを集中し、前部と後部の作業を開始する、肌の内外に織り込まれている。かつて最も後部点に到達した、縫合糸は、その後、戻って育ち、かつてよりカニューレを介して通される。これは、適切な創傷閉鎖を確保​​し、皮膚を通して働くからカニューレ/チューブを防ぎます。

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Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

我々は、カテーテルを注入又はマウスにおける右側脳室へのボーラス注入を実行することにより、中枢神経系に薬物を標的化する方法について述べる。私たちは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配信に特に焦点を当てています。この技術は、他の薬剤に、ラットに容易に適用可能である。

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

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Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K ビュー.  Washington University in St. Louis School of Medicine. 我々は、カテーテルを注入又はマウスにおける右側脳室へのボーラス注入を実行することにより、中枢神経系に薬物を標的化する方法について述べる。私たちは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配信に特に焦点を当てています。この技術は、他の薬剤に、ラットに容易に適用可能である。

ビデオ: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

齧歯類モデルで中枢神経系の疾患を治療するための全身および局所薬物送達

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

神経科学

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

創薬初期段階におけるコリン作動性薬物の中枢神経系の薬理効果を研究するコンピュータ テスト バッテリー

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...