著者らは、T -迷路と動作の部屋を提供するための博士チャールズLuetjeに感謝したいと思います。この作品は、米国心臓協会（YAへ）、神経疾患のための国立研究所と脳卒中グラントR01NS64269（RGZに）、とピュー慈善信託（RGZまで）によってサポートされています。

1。はじめこのビデオでは、我々は運動と神経変性疾患の危険にさらされている学習と記憶機能の測定を示すために、 ショウジョウバエを使って 2つの行動アッセイのデモンストレーションを行います。最初に、我々は、運動行動が負の走地性アッセイを用いて測定することができる方法を紹介します。第二に、我々は嫌悪苦味を有する光を関連付けるために訓練して、メモリ機能を評価するために6時間後に試験されている正走光ハエを使用して、学習と記憶能力を評価します。最後に、我々はこれらの行動アッセイの意義と限界について説明します。 2。機器と試薬<ol><li>仕事を飛ぶ<ul><li>ステレオスコープ（ツァイス） </li><li>ハエをプッシュするための小さなペイントブラシ</li><li> ショウジョウバエ二酸化炭素（CO 2）麻酔器（Geneseesci、株式会社） </li></ul></li><li>負の走地性アッセイ<ul><li> 28.5 × 95 mmのポリスチレンバイアル（キャピトルバイアル、（株）） </li><li>ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル） </li><li>シャーピーペン</li><li>接着テープ</li></ul></li><li>嫌悪走光性の抑制アッセイ<ul><li>塩酸キニーネ（シグマアルドリッチ、CAS番号：6119-47-7） </li><li>蒸留水</li><li>重量で正確な希釈用デジタル測定尺度</li><li>クイックディスコネクタ、高密度ポリエチレン（NALGENE VWR商品番号62868〜021） </li><li>光源用クイックディスコネクタアダプタと合わせて閉鎖端から2mLのマークでカット15 ml遠心チューブ（VWRインターナショナル）、 </li><li>チャンバーの内側を覆うフィルター紙の上にキニーネのソリューションをロードするために、シングルチャンネル200μLピペッター</li><li> T -迷路（シンプルな行動システム、図1） </li><li>アルミ箔</li><li>光源（ツァイス） </li><li>赤い光でランプ。 </li><li>ろ紙</li><li>ミニアラームタイマー/ストップウォッチ（VWRインターナショナル） </li></ul></li></ol> 3。ハエの準備<ul><li>ハエは25℃、標準コーンミール寒天、糖蜜、酵母の培地で12時間の明/暗サイクルでCに保持されます。 </li><li>処女のハエが羽化の日の二酸化炭素麻酔下で絶縁されています。老化研究のために、ハエがバイアル当たり20のグループ内に保持され、3日ごとに新鮮なバイアルに移した。遺伝的背景に起因する違いを最小限に抑えるため、老化研究のために、同じ親のクロスから兄弟のハエを使用することが重要です。 </li><li>両方のアッセイでは、ハエがバイアルあたり10個ハエのグループに性欲を刺激すると保持されます。行動に男女差は有意であり、データは6を解釈し、再現するのは難しいかもしれませんが、それは研究で、男性と女性のハエが混在しないことをお勧めします。 </li><li>負の走地性アッセイのために、ハエがバイアルごとに10のグループにソートされ、麻酔後1時間をテストした。これは運動活動に影響を与える可能性があるのでハエが麻酔から完全に回復することが重要です。 </li><li> APSアッセイのために、各グループのハエは、アッセイを実行する前に6時間ろ紙を湿らせた水と空のポリスチレンバイアルに配置されます。これは、ハエがアッセイの前に飢えていると嫌悪味に、より鋭敏になることが保証されます。検定が実行される直前に、10のグループからそれぞれのフライは、エスケープを避けるために、ゆるく蓋をされ、空の15mlの遠心管に配置されます。 </li></ul> 4。負の走地性アッセイ<ul><li>走地性は一般に、同じ遺伝子型や治療の10人（各遺伝子型/治療のために合計100から200ハエ）7の十から二十グループに対して測定されます。 CO 2麻酔器と場所には10の女性または男性のハエのソートグループ別のバイアル内の各グループ。麻酔から回復するハエの少なくとも1つの時間を許可します。 </li><li>二つの空ポリスチレンバイアルが垂直に対向してテープでつながっているように各グループのクライミング装置を、準備します。バイアルの開口部が完全にハエのためにも登山の表面を提供するために、互いに整列していることを確認することが重要です。 </li><li>下のバイアルの場合は、底面上に8cmの垂直距離を測定し、バイアルの全周に円を描くことによって、各バイアルをマーク。 </li><li>慎重にフライの脱出を防止する低バイアルに10ハエのグループを転送します。すぐにしっかりと接触する開口部の近くにバイアルおよびテープと下バイアルをカバー。ハエは、アッセイを行う前に1分間のための新しい設定に慣れることができます。 </li><li>ゆっくりとバイアルの底にハエをタップし、タップした後、10秒で、8 cmのマークの上に登ることができますハエの数を測定する。 </li><li>各試行の間に1分間の休止期間を考慮し、同じグループに10回、このアッセイを繰り返します。 </li><li>として8 cmのマークを渡されたグループごとのハエの数を記録合計ハエの割合。 </li></ul> 5。嫌悪走光性の抑制アッセイ（APSアッセイ） もともとルブールとBuecher（2002）4から適応、このアッセイは、嫌悪刺激（この場合は、キニーネの苦味）の光を関連付けるためにそれらを訓練するためにハエの正の走光性行動を悪用します。トレーニング/コンディショニング段階の後、野生型のハエは、嫌悪の味と明るい領域を関連付けると、それを避けることができるようになります。侵害の学習能力を持つハエはこの関連付けを行うために失敗します。さらに、APSのアッセイはまた、学んだタスクを思い出すの能力をテストするために同じテストを6時間後のコンディショニングに既に訓練されたハエを施すことにより5を飛ぶの短期記憶機能を測定するために使用することができます。 <ol><li>キニーネ溶液を調製<ul><li> 0.1Mストック溶液（50mLの蒸留水で1.98グラム）を作るために蒸留水で塩酸キニーネを溶かす。ストック溶液は小分けに年に-20℃までのために保持することができます</li><li>蒸留水でのストック溶液を希釈することにより、1μMのワーキング溶液を調製。 </li></ul></li><li> T -迷路の準備<ul><li> T -迷路はトラップドアと2つの独立したチャンバー、&quot;暗い&quot;チャンバーと&quot;点灯&quot;チャンバー（図1）と中央の列で構成されています。 </li><li>チャンバーの準備には2つの15mlのプラスチック遠心管に取り、底から2 mLのマークで切断手動で終了して閉じていた。両端にコネクタアダプタを合わせ、パラフィルムで接続をシール。チューブの端のアダプタは、グースネックの光源の入力スロットとして機能します。光源とつのチューブを接続し、このチューブは&quot;明るい&quot;チャンバーになります。 &quot;暗い&quot;室として機能するようにアルミホイルを使用して他のチューブを巻きます。 </li><li>蒸留水や光のチャンバー内で紙と場所をフィルタリングするためにキニーネのソリューションのいずれかの180uLを追加。 </li><li>中央の閉鎖（図1）のトラップドアで、中央の列の両側に点灯し、暗いチャンバーをねじ込んでT -迷路を組み立てる。 </li><li>照明室に光源を挿入します。 </li></ul></li><li>訓練は、嫌悪刺激と走光性を抑制するために飛ぶ<ul><li> T -迷路から緩めて暗室をし、このチャンバ内に単一のフライを転送し、すぐに迷路に戻って暗いチューブをねじ込みます。 </li><li>部屋の照明をオフにし、赤のランプをオンにします。 </li><li>フライは、30秒間暗室に順応し、徐々に明るい部屋を照らす光源をオンにすることができます。徐々に二つの部屋を分けるトラップドアを開きます。 </li><li>フライは10秒以内に点灯室に歩いている場合、それは積極的に走光とみなされ、アッセイのために訓練される状態になります。走光性の障害は、アッセイから除外する必要がある負の走光性と視覚系とハエの問題があることを示します。 </li><li>忌避走光性の抑制（APS）トレーニング、暗室に戻って向光性を示したフライをタップするために、トラップドアを閉じて、光をオフにする。 acclimatizingの30秒を許可する。この時間の間に照明室にキニーネ溶液をろ紙を置く。徐々にトラップドアを開いて、光をオンにします。キニーネコーティング点灯チャンバ内へのハエの散歩を許可します。 1分後、暗室に戻ってフライをタップし、これを9回以上繰り返す。 （通常、野生型は3〜5訓練の試験後に点灯チャンバーを避ける飛ぶ。） </li><li>すぐにトレーニングの後、5つのテストの試験が実施される。各試験の試験では、光が照明室に歩いて訓練されたハエのためにオンになって10秒後に許可する。照明バイアルに歩いて失敗は、&quot;強化を通じて学習タスク&quot;に相当する、&quot;パス&quot;として記録されます。 5年連続の試行の合格率はPC0（0時間後のコンディショニング）として記録し、下の図2に示されています。 </li></ul></li><li>ハエの短期記憶の機能を評価する<ul><li>訓練と初期PC0録音した後、各フライは元の食品のバイアル瓶に戻し入れられ、6時間わき続け​​た。 </li><li>六時間後研修、被験者の前と同じ方法で再び5試験にそれぞれのフライ、そして（失敗）フライは回避（合格）または入る明るいバイアルを回数を記録。この合格率は、短期記憶の指標であるPC6（6時間ポストコンディショニング）、として記録されます。 </li></ul></li></ol> 6。データの解釈と統計解析<ol><li>負の走地性アッセイ<ul><li>このアッセイから生成された生データは、各グループに10秒で8センチの大台にハエの数を表します。割合にこれを変換し、10セッション以上の各群の平均合格率を計算する。 </li><li>データは平均値の標準誤差（SEM）を持つグループごとの平均合格率（遺伝子型、治療法など）としてグラフィカルに表現されます。 </li><li>群間の差して、Student t検定またはANOVAを用いて統計的に有意かどうかであると決定することができます。 </li></ul></li><li>嫌悪走光性の抑制アッセイ<ul><li>このアッセイからの生データは、各フライは5つの連続試験では照明室を回避する回数として表されます。合格率は、合計回の試行の成功回避の試行の割合として計算されます。グループごとに15ハエの最小値は、この方法で平均合格率を計算する。 </li><li>または平均合格率PC6（6時間後のコンディショニング、&quot;メモリ&quot;インジケータ）、それぞれのSEMと、データがグラフィカルに平均合格率PC0（インジケータを&quot;学ぶ&quot;すぐにコンディショニング後）として表されます。 </li><li>学習と記憶のインデックスは、野生型と&quot;遺伝子操作 - 良性&quot;グループ（GFP過剰発現が飛ぶような）適切に両方と群間で比較されています。 </li></ul></li></ol> 7。代表的な結果このビデオの実験では、我々は中枢神経系でハエを過剰発現するヒトのタウの学習と記憶と運動障害を評価していますし、ハエを過剰発現するGFPのものに彼らのパフォーマンスを比較。 ショウジョウバエにヒトのタウの神経過剰発現は、脳8に深刻な空胞化を引き起こすと学習と記憶機能の9の大幅な赤字につながることが示されている。図2Aに示すように、10日齢の雄または雌のショウジョウバエを過剰発現するヒトのタウは、年齢をマッチさせたGFP過剰発現が飛ぶと比較して有意な運動の障害を持っている。さらに、これらのハエは、対照群に比べてPC0合格率によって示されるように苦味を有する光を関連付けるだけでなく、PC6合格率（図2B）の減少によって示されるように、この関連付けを覚えて失敗する失敗しました。この実験では、さらにショウジョウバエモデルは人間の神経変性状態を研究し、ヒトや哺乳動物で観察された行動の表現型の一部をrecapitulatingに使用できることを検証します。 <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。忌避走光性の抑制アッセイのためのT -迷路のセットアップ。A.トラップドアで区切られた濾紙と左側に&quot;暗く&quot;チューブ（箔で覆われた）と並ぶ&quot;点灯&quot;ファルコンチューブに接続されている光源とAPSAの実験のための総合的な実験、、。 B.トレーニングやテストのフェーズにおいて、フライは、暗室内にあり、光が明るい部屋でオンになって後にトラップドアが開きました。 <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。汎神経ドライバでハエを過剰発現するGFPまたはTauを使用して負の走地性とAPSの実験から代表的な結果。A.負の走地性の検定では、10日齢の雄（青列）またはメス（赤の列）を過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも高い上昇活性を示した飛ぶ。 B. 20日齢の雌では過剰発現するGFPは、タウ過剰発現が飛ぶよりも、よりよい学習（PC0）とメモリ（PC6）の機能を示した飛ぶ。

<ol>
	<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila.">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li><li>Lloyd, T. E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution.">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li><li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster.">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning &#38; Behavior. 30, 330-341 (2002).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aversive+phototaxic+suppression:+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster.">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li><li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -. B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li><li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster.">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li><li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauopathy+in+Drosophila:+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles.">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li><li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons.">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li><li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li><li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system.">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

負の走地性とAPSアッセイの両方は、遺伝的または環境的操作に起因する運動や学習と記憶容量の変化を測定するための堅牢な行動アッセイです。しかし、さらなる最適化を待って、これらのアッセイにはいくつかの欠点があります。 負の走地性の検定では、特定の遺伝子の突然変異はハエで重度の運動機能障害をレンダリングすることができます。このようなケースでは、ハエはほとんど攪拌時に重力に反応して壁を登ることはできません。直接運動を測定する他の行動アッセイでは、より適切な場合があります。これらのアッセイは、麻痺と発作10を測定する立ち直り反射行動、および運動協調の損失を記録する微細運動行動11があります。 APSのアッセイでは、最初の障害は、ランダムに前方に移動することなく、照明室の入り口で停止ハエすることができます。古いハエが一般的にあまり積極的であり、長期間停止して休息する傾向があるので、高齢化が、研究条件のいずれかである場合、これは問題の多くになります。この場合、実験者は、常に効果的ではない動きを、促進するための機械的な刺激を提供しなければならない。第二に、一つは障害が正の走光性の損失からつけられたチャンバーの結果に移動すると主張するかもしれない。強化負が4を削除すると、以前の仕事はハエが光反応性に引き返すことが示されているので、これは、あまりないケースです。第三に、嫌悪刺激との接触の持続期間は、裁判から裁判に異なる場合があります。この変化は通常、キニーネを避けてからハエを防ぐために浸したろ紙を容器の内壁を取り囲むことによって減らすことができます。さらに、実験者は各フライは特に断りのない1分からチャンバーに費やされる時間の量を増やすことによって、ろ紙との接触に十分な時間を過ごすようにすることができます。 要約すると、負の走地性とAPSのアッセイは、行動障害を評価するための高速かつ簡単な方法であり、定量的に運動し、 ショウジョウバエにおける学習と記憶の能力を示している。これらのアッセイは、 ショウジョウバエにおける人間の神経変性条件をモデル化するのに特に有用である。

<table border="1"><tbody><tr><th>材料</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ポリスチレンバイアル</td><td>キャピトルバイアル、（株） </td><td> 28Fly </td><td> 28.5 × 95 mmのポリスチレンバイアル、材料の品質の重要な、悪いハエが登るにはあまりにも滑りやすい場合。 </td></tr><tr><td>解剖ステレオスコープ</td><td>ツァイス</td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2枝雁首ライトガイド（12V/30W） </td></tr><tr><td>塩酸キニーネ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 6119-47-7 </td><td>蒸留水に溶解する。 </td></tr><tr><td>クイックディスコネクタ</td><td> Nalgene（VWR） </td><td> 62868-021 </td><td>高密度ポリエチレン</td></tr><tr><td> T -迷路</td><td>シンプルな行動システム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネル200μLピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

遺伝的手法の進歩は、モデルシステム1としてショウジョウバエを用いてヒト神経変性疾患に関与する遺伝子の研究が有効になっている。アルツハイマー病、パーキンソン病やハンチントン病を含むこれらの疾患のほとんどは、学習と記憶機能と運動協調2の年齢依存性劣化によって特徴付けられる。ここでは、人間の神経変性に関連した行動の特性のいくつかはハエでrecapitulatedできることを示すために、負の走地性の検定3と嫌悪phototaxic抑制アッセイ（APSアッセイ）4,5、を含む行動アッセイを、使用してください。動揺が運動能力を妨げる可能性の遺伝子または条件を調査するために利用される際に、負の走地性の検定では、ハエの自然な傾向は、重力に逆らって移動する。 APSのアッセイでは、学習と記憶の機能は、正に走でテストされている嫌悪苦味を有する光を関連付ける、従って光に向かって移動するには、このそうでない場合は自然な傾向を避けるために、訓練飛行。 6時間後のトレーニングはメモリ機能を評価するために使用されているこれらの訓練されたハエのテスト。これらのアッセイを用いて、神経変性を発展させるためのあらゆる遺伝的または環境的要因の寄与は、簡単にハエで検討することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration at JoVE.com

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;。

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.2K ビュー.  University of Miami, Miller School of Medicine. 測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイショウジョウバエ。

ビデオ: Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

神経科学

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#39;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including acquisition of spatial memoryand long-term spatial memory 1. The MWM is a relatively simple procedure typically consisting of six day trials, the main advantage being the differentiation between the spatial (hidden-platform) and non-spatial (visible platform) conditions 2-4. In addition, the MWM testing environment reduces odor trail interference 5. This has led the task to be used extensively in the study of the neurobiology and neuropharmacology of spatial learning and memory. The MWM plays an important role in the validation of rodent models for neurocognitive disorders such as Alzheimer&#x2019;s Disease 6, 7. In this protocol we discussed the typical procedure of MWM for testing learning and memory and data analysis commonly used in Alzheimer&#x2019;s disease transgenic model mice.

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#039;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze is a behavioral task to test hippocampal-dependent learning and memory. It has been widely used in the study of neurobiology, neuropharmacology and neurocognitive disorders in rodent models.

アルツハイマー病モデルマウスにおける学習記憶障害のためのモリス水迷路試験

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

で食欲連想嗅覚学習<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

における自発運動量の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

小さなうろこに覆われた爬虫類の空間学習と記憶を評価します

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル