Name: mass histology to quantify neurodegeneration in drosophila
Uploaded: 2016-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
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This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).

1.首輪にヘッドを固定し、パラフィンに埋め込み注：固定プロセスの手順はすべて、ドラフト内で行う必要があります。安息香酸メチルは、健康上のリスクをもたらすものではないが、ドラフト内で処理されない場合は圧倒的なことができ非常に明確な臭気を持っています。 <ol><li>ハエを麻酔する前に、（クロロホルム及び酢酸を混在させないでください）99％エタノール30 mLに氷酢酸のクロロホルム5mLを15mLのを追加することにより、カルノア液の50ミリリットルを構成しています。カラーは平らでき、完全に解決策で覆われていることを確実にするために、このようなcrystalizing皿のように、平らな底部を有するガラス容器にそれを注ぎます。 </li><li> CO 2またはエーテルでハエを麻酔。 </li><li>スレッドは、ピンセットを用いてカラーに首によって（ほとんどの襟付き20まで）飛びます。 図1Aに見られるように、同じ方向に頭の全てを合わせ、損傷が頭や目に発生しないことを確実にするために穏やかであることを忘れないでください。 </li><li>ハエの順序を容易セクションで識別できるように、ランダムな位置での正弦oculisハエ （矢印、 図1A）を含みます。また、場合実験ハエが十分な顔料は、スライドを染色するために存在することを確認するために、それらの間のような野生型のようないくつかの赤い目ハエを、スレッド、光や白の目の色を持っています。複数のカラーを使用した場合はカラー番号とともにプロトコルシートにハエの順序を記録します。 </li><li> 4時間 - 襟が終了した後、3.5用に準備カルノア液に入れてください。 </li><li>適切な処分キャニスターにカルノア液をダンプし、エタノール洗浄を開始します。コンテナ内のカラーの配置を乱さないようにゆっくりと注ぐようにしてください。 </li><li>二度99％のエタノール中で30分間のカラーを洗ってください。 </li><li> 1時間100％エタノール中でカラーを洗ってください。 overdehydrationを防ぐために、時間に洗浄液を必ず変更してください。 </li><li>安息香酸メチルにカラーを入れてO / RTでN。安息香酸メチルの蒸発を防ぐためにパラフィルムで容器を密閉します。 </li><li>ヒュームフード内で適切な使い捨て容器にmethylbenozateを注ぎます。 （ - 57°C 56）パラフィンワックス、メチルベンゾ1低融点：1の以前に調製された混合物を追加します。この時点から、カラーはパラフィンが硬化しないことを確認するために、65℃のインキュベーター内に保持する必要があります。 </li><li>適切な使い捨て容器にmethylbenozateとパラフィンの混合物を注ぐ、溶融純粋パラフィンワックスを注ぐ、カラーの上に、65℃に保ちました。 </li><li> 30分後にパラフィンを変更し、この少なくとも5回繰り返します。少なくとも6から8回の洗浄を実施すべきです。 </li><li>洗浄が完了すると、約スロット襟の大きさのゴムアイスキューブトレイにカラーを配置します。完全に覆われるまで、それらの上に溶融パラフィンを注ぎ、それがO / N（気泡を回避しよう）を硬化することを可能にします。 </li><li>パラフィンブロックcontaiを削除します寧アイスキューブトレイからカラー。そっと襟を折っ、カミソリの刃を使用して、襟からパラフィンブロックを区切ります。体が襟にとどまる一方でヘッドがパラフィンブロックになります。ブロックを室温で維持することができます。 </li><li>首輪をきれいにするには、光洗浄できれいにパラフィンを、削除し、再利用する前にエタノールで洗浄するために65℃でdeparafinization剤でそれらを浸します。 </li></ol> 2.セクショニングと取り付け<ol><li> 50℃に加熱プレートを温めます。プレート上のオブジェクトの所有者（または金属マウントブロック）とかみそりの刃を配置し、それらをウォームアップしましょう。 </li><li> （簡潔に接触側のブロックを溶融）加熱された取り付けブロックに（正面セクションに対して）切片のための所望の向きに応じて、（水平部のため）のいずれかの側に向かってヘッドをパラフィンブロックを添付したり、上向きに。加熱プレートからブロックを削除し、それは少なくとも10マイルのために冷却することができますパラフィンは、取り付けブロックの上に適切なシールのために十分に硬化されることを保証するn個。不均一なセクションを防ぐために、できるだけ多くのブロックの表面に平行に整列ヘッドの行を保管してください。 </li><li>カミソリの刃を取り、埋め込まれた頭を持つ唯一の小さな行が残るように離れてハエの頭から余分なパラフィンをトリム（かみそりの刃は簡単にトリミングのためにウォームアップすることができます）。パラフィンは、（切片中に行うことができ、よりトリミング）を切片中に破損しないようにあまりにも多くをトリミングすることがないことを確認してください。 </li><li>ミクロトームのオブジェクトホルダーに取り付けブロックを配置し、ヘッドの列の整列は、ブレードのエッジにできるだけ平行であることを確認してください。 </li><li>ポリ-L-リジン（PLL）溶液の薄い層で覆うことにより、顕微鏡スライドを調製し、5分間、それらを乾燥させます。使用直前に水でそれらをカバーしています。 </li><li> 7μmのセクションをカットし、水に浮かぶスライドにセクションのリボンを転送します。&lt;BR /&gt;注：水平方向のセクションの脳全体を得るために、我々は、（脳に口吻から切断）ヘッドが完全に切断されるまで目にカットし始めたときから、リボンを集めます。複数のスライドは、ヘッド全体のために必要とされてもよいです。 </li><li> 37℃の熱板上でスライドを置き、リボンが約1分間拡大することができます。 </li><li> （それを注ぐまたは組織を使用して）過剰の水を除去し、スライドO / Nを乾燥させます。 </li><li> （完全にセクションをカバーする）deparafinization剤が充填された背の高い、縦スライド染色ジャーにスライドを配置することによって、スライドからパラフィンワックスを除去します。 60分ごと - 30分の3回の洗浄を行います。 </li><li>最終洗浄からスライドを削除してください。スライドに埋め込むメディアの2滴を置き、大きなカバースリップでそれをカバーしています。 </li></ol> 3.セクションを撮影し、分析<ol><li> 2 D - 準備されたスライドが1のために乾燥することができます。その後、蛍光microscでそれらを調べます青色光下でのOPE。 </li><li>ハエの向きを決定するために、特定の地域に焦点を当てた場合に関心領域を見つけるために、低倍率を使用してください。 注：SWSのハエ（ 図2を参照）のために、我々は偉大な交連を含むセクションを見つけて、（通常は40倍の倍率で）画像を取ります。 （ 図3のように）脳全体を分析するとき、私たちは頭からすべてのセクションをスクロールし、いずれかの最も深刻な表現型または液胞を示すすべてのセクションとセクションを撮影します。 </li><li>二重盲検分析のために、取ると数の画像遺伝子型を知らなくても、後でそれらを識別するための行のカラー番号とヘッドの位置を記録します。 </li><li>画像が撮影されると、画像処理ソフトウェアを使用して分析します。 </li><li>セクションごとや頭あたりの空胞の数をカウントします。 、液胞のサイズを測定するソフトウェアプログラムで画像を開いて、あまりにも選択で空胞を選択するにはリットル。選択された空胞内のピクセルの量を決定します。 </li><li> μmの2への変換のために、写真を取得するために使用される倍率でステージマイクロメータ用較正スライドの写真を撮ります。変換係数を計算するためには100μm2のピクセルの量を決定します。 </li><li>上記のステップで算出された変換係数によって画素数を割ることによってミクロン2に総画素数を変換します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

記載された方法は、 ショウジョウバエの脳における神経変性を定量化する手段を提供します。他の方法は、特定の細胞型を計数するように、神経変性を同定するために使用することができるが、この方法の利点は、より一般的に適用できることです。細胞を計数することは、これらの細胞が確実に特異的な抗体や、常に利用可能でない細胞特異的マーカーの発現、のいずれかを用いて...

平均余命の増加に伴い、アルツハイマー病やパーキンソンなどの神経変性疾患は、一般人口の増大する健康への脅威となっています。国立衛生研究所によると、115万人が世界中で、基礎となる重要な進歩は、それらの多くは、これらの疾患のうちの少なくともいくつかに関与する遺伝子および危険因子を同定することにしたが2050年に認知症により影響を受けると予測されます分子メカニズムはまだ不明かよく理解しています。 線虫（Caenorhabditis elegans）およびキイロショウジョウバエのような単純な無脊椎動物のモデル生物は、短いライフサイクル、子孫の数が多いと、十分に確立し、時にはユニークな遺伝的および分子的方法1の可用性を含む神経変性疾患のメカニズムを研究するための実験種々の利点を提供しています-12。さらに、これらの生物は、公平に適しています神経変性の表現型に対するそれらの悪化または改善効果によって、これらの疾患の要因を特定することができる相互作用の画面。 そのような遺伝的相互作用を分析し、高齢化の影響を評価することは神経変性を検出するために、その重症度を測定するための定量的なプロトコルが必要です。数値性能値13から21を提供するような嗅覚学習、負の走地性、または高速走光性ショウジョウバエにおける行動の側面を、測定するときにこの評価は、比較的容易に行うことができます。ニューロンを計数することによりニューロンの生存に対する効果を決定することも可能です。 PDに影響されるドーパミン作動性ニューロンのように、明確に識別可能である特定の集団に着目した場合ただし、これは可能であり、その後も、結果は22-24議論されています。 ここで説明するプロトコルは、パラフィン連続切片を実行するために、カラー方式を使用して、方法それは、もともとショウジョウバエ 25に解剖学的脳の突然変異体を単離するためにそれを使用しハイゼンベルクとBöhl、によって開発されました。カラー方法の使用は、その後凍結切片、ビブラトーム切片及びプラスチックセクション26-28に含むように適合されています。ここでは、この方法は、次に、神経変性表現型16,21,29-32とハエに開発空胞を測定することができる全体フライヘッドの連続切片を得るために使用されます。これらの測定は、特定の脳領域で行うことができ、または脳全体を覆うことができます。後者のアプローチは、老化中に観察されたように、1つは、弱い変性表現型を識別することができます。最後に、20ハエまで、カラーを使用している場合だけでなく、より少ない時間がかかるだけでなく、原因のわずかな変化にアーティファクトを最小化する、同じ製剤中に対照および実験ハエの分析を可能にする1つの製剤として処理することができます準備。

<table><tbody><tr><td>Name of the Reagent/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Collar</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rubber ice cube tray for embedding</td><td>Household store</td><td></td><td>The size can be made-to-fit by glueing in additional walls&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Crystallizing dish</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Methylbenzoate</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Distinct Odor - Use in fume hood!</td></tr><tr><td>Low Melting Point Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Make sure to keep extra melted in a 65&amp;deg;C waterbath</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Three different containers for washes</td></tr><tr><td>Vertical Staining Jar with Cover</td><td>Ted Pella Inc.&amp;nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

mass histology to quantify neurodegeneration in drosophila

アルツハイマー病（AD）またはパーキンソン病（PD）などの進行性神経変性疾患は、世界中のヒトの健康に増加脅威です。哺乳動物のモデルは病原性の基礎となるメカニズムに重要な洞察を提供してきたが、一緒に高コストの哺乳動物系の複雑さは、その使用を制限しています。したがって、シンプルだが十分に確立されたショウジョウバエモデル・システムは、これらの疾患に影響される分子経路を調査するための代替手段を提供します。行動障害のほか、神経変性疾患は、神経細胞死と軸索障害などの組織学的表現型によって特徴付けられます。神経変性を定量化するために、それが遺伝的要因と環境要因によって影響される方法を決定するために、我々は大人のハエの脳内の空胞を測定することに基づいている組織学的アプローチを使用しています。系統誤差の影響を最小限に抑えるために、直接制御とEXPからの切片を比較します1つの製剤でerimentalハエは、我々はパラフィン切片のための「カラー」メソッドを使用します。神経変性は、その後、ハエの脳に開発した空胞のサイズ及び/又は数を測定することによって評価されます。これは、いずれかの特定の関心領域に焦点を合わせることによって、または完全長に及ぶ連続切片を得ることにより脳全体を分析することによって行うことができます。通常の老化時に起こるようなので、この方法は、1が厳しい変性だけでなく、いくつかのセクションにのみ検出され、比較的穏やかな表現型だけでなく、を測定することができます。

全体フライヘッドを包含する眼の色素33によって染色された連続切片で説明した方法の結果を使用。この部分は、個々のヘッドのセクションが上から下に表示され、図1Bに示されています。別のハエのセクションは、この例では左から右に見られます。配向およびハエの識別を容易にする、アイレスフライ（正弦oculis）が 3位（矢印、 ...

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Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

mass-histology-to-quantify-neurodegeneration-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

10.1K ビュー.  Oregon Health & Sciences University.  ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。 

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

神経科学

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

遺伝学

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

発生生物学

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;運動ニューロン変性

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Direct Cryosectioning of Drosophila Heads for Enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression patterns. Traditional methods often involve challenges such as performing complex dissection, maintaining tissue integrity, and visualizing specific expression patterns during high-resolution imaging. We present an optimized protocol that combines cryosectioning with fluorescence staining and immunostaining. This method improves tissue preservation and signal clarity and reduces the need for laborious dissection for Drosophila brain imaging. The method entails rapid dissection, optimal fixation, cryoprotection, and cryosectioning, followed by fluorescent staining and immunostaining. The protocol significantly reduces tissue damage, enhances antibody penetration, and yields sharp, well-defined images. We demonstrate the effectiveness of this approach by visualizing specific neural populations and synaptic proteins with high fidelity. This versatile method allows for the analysis of various protein markers in the adult brain across multiple z-planes and can be adapted for other tissues and model organisms. The protocol provides a reliable and efficient tool for researchers conducting high-quality immunohistochemistry in Drosophila neurobiology studies. This method's detailed visualization facilitates comprehensive analysis of neuroanatomy, pathology, and protein localization, making it particularly valuable for neuroscience research.

This study presents a simplified protocol for tissue processing involving decapitation, fixation, cryosectioning, fluorescence staining, immunostaining, and imaging, which can be extended to confocal and multiphoton imaging. The method maintains efficacy comparable to complex dissections, bypassing the need for advanced motor skills. Quantitative image analysis provides extensive investigative potential.

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

Immunostaining Drosophila melanogaster brains is essential for exploring the mechanisms behind complex behaviors, neural circuits, and protein expression ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

に神経変性を定量化するために、マス組織学

要約

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でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

神経変性表現型を評価する

研究のための単純な神経細胞学的損傷法

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

神経変性と関連した成人ショウジョウバエにおけるシナプス変性の可視化

脳蛍光染色および免疫染色を強化するためのショウジョウバエ頭部の直接凍結切片

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

に神経変性を定量化するために、マス組織学

要約

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でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

神経変性表現型を評価する

研究のための単純な神経細胞学的損傷法

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

ショウジョウバエの背側縦筋神経筋接合部の構造的完全性の評価

神経変性と関連した成人ショウジョウバエにおけるシナプス変性の可視化

脳蛍光染色および免疫染色を強化するためのショウジョウバエ頭部の直接凍結切片