この方法は、血液媒介細菌が血液脳関門を越えて中枢神経系および脳に感染できるかどうかに関する細菌病因分野の重要な質問に答えるのを助けることができる。この技術により、感染した動物の血液および脳組織内の細菌数を決定し、脳の血管内に存在する細菌の数を除外することができる。この手順を実証することは、私の研究室の研究員であるPallab Ghoshです。
感染後72時間で、1分間に10ミリモルのEDTAを補充したPBSの4ミリリットルの流量に自動灌流システムを設定する。そして、解剖鍋で、サタンの位置に安楽死させた動物を置きます。足のピンチへの応答の欠如によって安楽死を確認します。
そして、75%エタノールで腹部を濡らす。はさみを使用して、腹壁を肋骨ケージのすぐ下に切開し、横隔膜や内臓を露出させます。そして、胸腔を開くために横隔膜を切断します。
左心室を露出させるために両側にこすりケージをカットし、優しく心臓をつかむには鉗子を使用します。灌流システムに接続された21ゲージの蝶の針を左心室に挿入し、右心房を慎重に切断して約200マイクロリットルの血液を10ミリモルEDTAを含む2ミリリットルチューブに入れ、凝固を防ぎます。その後、PBSとEDTAの15〜20ミリリットルで4分間動物を浸透させます。
完全な灌流の後、脳と肝臓は、残りの細菌が循環血液ではなく、収穫された器官からであることを保証するブランチが表示されます。灌流後、目的の器官を個々の無菌、15ミリリットルの円錐管に慎重に移し、チューブあたり4度の無菌4度のPBSを5ミリリットル含む。切断後に脳を収穫するには、はさみを使用して頭皮の皮膚を目の間の中線に切り取り、頭蓋骨に押し付けられた先端を保ち、必要に応じて余分な組織をトリミングします。
はさみの片方の先端を両端のマグナムにそっと挿入し、両側の頭蓋骨に横に切ります。慎重に頭蓋骨の中線の目の間の頭蓋骨をカットし、横圧力を適用し、脳の摂動を避けるために注意してください。鉗子を使用して、頭蓋骨を開いて脳を露出させ、脳の下側と頭蓋骨の基部の間にへらを置き、脳を摂氏4度の5ミリリットルのPBSを含む15ミリリットルのチューブに慎重に移す。
バイオセーフティキャビネットで、チップを挿入し、10秒間、シーケンシャルな5%漂白剤、滅菌水、75%エタノール、無菌水溶液を15ミリリットルの円錐チューブに入れ、組織ホモジナイザーを10秒間実行します。先端が完全に殺菌されたら、感染した脳をチューブ内で均質化する。目に見える組織断片が残らない場合は、次の臓器サンプルへの細菌の持ち越しを防ぐために先端を再殺菌し、次の器官を均質化する。
すべての器官が均質化されたら、滅菌PBSで各器官の10倍の連続希釈を調製し、脳心注入寒天板に希釈液をプレートする。次に、ホモジネート希釈培養を摂氏37度で一晩インキュベートし、各プレート上のコロニー数を数えて、臓器または血液のミリリットル当たりの細菌の総数を決定します。L.単球遺伝子感染マウス器官における細菌の負担の計算は、輸血後感染が、この代表的研究で調べた感染したマウスの血液または器官における細菌の負担を有意に変化させるものではないことを示唆している。
この手順に従って、リステリア単球遺伝子感染器官は、非感染した対照動物と比較して感染したマウス器官への炎症細胞の浸潤に関する追加の質問に答えるために組織病理学的処理などの追加の分析のためにさらに処理することができる。この手順を試みる間, 脳の摂動を避けるために覚えておくと、はさみと脳組織の間の最小限の接触を維持することが重要です.
