スキッドモアファカルティ·ディベロップメント·グラントは、この原稿の作成と出版に資金を供給した。

1。胚の取付け（例えば、免疫細胞として選択された可視化手法の完了時に、in situハイブリダイゼーションにおいて 、 等 ） <ol><li>選択したバッファ（ 図1A）で満たされた35ミリメートルペトリ皿に胚を置きます。緩衝液の選択は、標識操作に基づいています。一般的に、PBSベースのバッファが適当である。 </li><li>解剖顕微鏡とピンセットを使用しての下では、他のペア（ 図1B）を廃止卵黄を引きながら鉗子の1対の頭を固定します。代わりに、そっと卵黄を引き離すために虫ピンホルダーに虫ピンを使用しています。 </li><li>胚ポーカーを使用して（釣り糸（0.41ミリメートル径）キャピラリーチューブやパスツールピペットのいずれかに接着さ）卵黄の破片（ 図1C-D）の多くを持っていないペトリ皿の部分に胚を移動します。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いて、できるだけ少ない液体中の胚を吸引、およびg本来的スライドさせます（ 図1E）上にそれらをピペット。 </li><li>そっと研究室を使用してワイプ余分な液体を吸い取る。胚との接触を避ける。 </li><li>胚へのメディアのマウントの1滴を追加します。蛍光標識の場合は、選択の退色防止剤を使用しています。比色信号の場合、70％のグリセロールを封入剤として使用することができる。 </li><li>胚ポーカーを使用して、行（ 図1F）での両側に胚を向けます。 </li><li>カバーガラス（ 図1G）の各コーナーにワセリンまたは高真空グリースの1「DAB」を追加します。これは過度の圧縮からの胚の損傷を防止する。 </li><li>胚（ 図1H）の上にカバースリップ（ダウンワセリン側）を配置します。 </li><li>封入剤（70％グリセロールまたは抗フェードマウント試薬）カバースリップに触れられるまでゆっくりと（ 図1H）各コーナーでのカバーガラスをタップします。 </li><li>必要な場合は、すぐ隣COVにピペッティングすることにより、より取付メディアを追加するerslip 20〜200 mlの範囲内ピペッターを使用して。それが下に吸い上げます。 </li><li>研究室を使用すると、カバーガラスの周囲に完全にクリーンで拭いてください。これは、胚を損傷するように、カバーガラスに圧力をかけないことが確実であること。このエリアには、乾燥して、その上に何ワセリンまたは封入剤を持っていない必要があります。 </li><li>カバーガラス（ 図1I）の縁の周りをシールするためにマニキュアを使用してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression.">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li><li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons.">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li><li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. 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競合する経済的利益は、作者のどちらかのために存在していません。

脊髄開発の固定ゼブラフィッシュ胚のエイズの可視化の横方向の取り付け。卵黄球の除去を介して、例外的な顕微鏡イメージングに必要なワーキングディスタンスが小さくなる。我々の代表的な結果は24ゼブラ段階に限られていた以前の胚による胚の大きさおよび組織の脆弱性に解剖するのがより困難であるものの、しかしながら、この技術は、早ければ18ゼブラとして使用することができる。この技術は、ゼブラ24歳以上の胚にも適用可能である。胚ゼブラフィッシュの光学的透明性、逆遺伝学、フォワード遺伝子スクリーニングを実行する機能、およびトランスジェニックアプローチに助けられ、いくつかの発生過程を調べることができる。これはBrdUおよび抗リン酸化ヒストン3 4-6とPAX、NKXと、dbx、およびoligファミリーをニューロンとグリア前駆マーカーの発現を通じてパターニングのようなマーカーを用いた神経細胞の前駆細胞の有糸分裂指数が含まれていS 1,4-6。グリアおよび（例えば、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）およびHUC / Dなど）、ニューロンの判定を報告1,4,5,10の試薬 ​​を使用することができる。神経細胞サブタイプへの分化は、 島、VSX、エングレイルド 、およびGATA遺伝子 1,4-6の発現を介して分析することができます。そして最後に、軸索ガイダンスの分析は、抗アセチル化チューブリン、3A10のような抗体を介して可能であり、ZNP-1 2,11,12。他の脊椎動物モデル系（マウスやヒヨコ）が脊髄の発達を研究するために使用されているが、唯一のゼブラフィッシュは、無傷の胚内のすべての発達の軸を同時に見ることを可能にします。 この方法の明らかな制限は、ライブイメージングを排除する、胚が固定されていることである。実際に、迅速な胚の死卵黄結果（または損傷）の除去は、このように、この技術を用いて、ライブ胚における作動距離を低減することができない。しかし、高倍率脊髄CO生きた胚における番目のイメージングが可能である。ライブイメージング中に卵黄を保持するために、胚を試料とカバーガラスの間に大きな空間を提供する窪みスライドに配置することができる。代わりに、いくつかの22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップは、顕微鏡のスライドのX 1中3のいずれかのスライドに接着することができる。カバーガラスを覆っているカバーガラスのための「ブリッジ」としての役割を果たす。胚は18ゼブラよりも古い場合には、トリカインは、移動を防止するために、胚を麻酔するために使用される。 0.288ミ​​リメートルの作動距離は24 HPFでdeyolked胚に必要ですが、アガロースに埋め込んだライブ胚を扱う場合、無傷の黄身で、3.3ミリメートルの作動距離を持つ微細なレンズで十分です。あるいは、deyolked胚に由来する外植片培養物は、血漿クロット固定化技術13を用いて可視化することができる。細胞の様々な集団は、GFP、mCherry、または光導などの遺伝的にコード化された蛍光タンパク質を利用して観察することができますvertible染​​料楓（数名）です。さらに、キメラ胚の中、蛍光標識された細胞はまた、このアプローチ14で表示することができます。 ヶ月間安定で一貫性のある実装技術が発達し、細胞生物学者のための重要なツールです。この簡単な技術は、異なる実験試験間比較が容易にできるように、再現性がある。さらに、行の胚の位置合わせが容易に後の分析のために、特定胚の識別を可能にします。

ゼブラフィッシュにおける脊髄の可視化は、多くの要因によって阻害される。原因の上にある体節の厚さや脊髄の内部の場所に、かなり長い作動距離は、高解像度の携帯に必要です。 （神経発生の初期段階で依然として存在している）卵黄球は、さらに、必要な作動距離を増加させ、容易にカバースリップからの圧力によって損傷される。また、損傷した卵黄からの破片は、組織の明確な可視化を禁止しています。背腹（DV）軸での断面が可能であるが、それらは容易に前後（AP）軸1に同時可視化を許可していません。 これらの障害を克服するために、胚を切開し、スライド上に搭載されている。この手順では、いくつかの利点があります。まず、ゼブラフィッシュ胚は容易にAP軸の可視化を容易にする、上に向けて側面に位置する。卵黄BALの第二、除去lは、必要な作動距離が減少し、デブリを制限する。第三に、この取り付け手順では、蛍光灯や明視野顕微鏡の両方を可能にします。第四に、マウントされた胚は、長時間の試料の可視化を可能にし、4℃で数ヶ月の​​ために安定している。最後に、開発の進行は、セグメントは、後方のセグメントよりも成熟していることを、前方で発生します。上演一致脊髄hemisegmentsは胚との間で比較されることを保証するためには、上にある体節組織がガイドとして使用されている。例えば、第十最も後方体節は、ステージをマッチさせた胚における発生的に同等である第十脊髄hemisegmentを覆っている。完全な胚のこの取り付け手順では、体節を容易に識別することができます。 我々は発展途上の脊髄に軸索ガイダンスのメカニズムを研究するために遺伝学と遺伝子ノックダウン技術を使用しています。特に、我々はrobo2、robo3、およびDCCが交連一次ASCEのために必要とされることを決定したnding（COPA）軸索経路探索。ここで説明する取り付け手順を使用して、我々は腹側成長、正中線交差、交連幅、背側と前側の成長2,3を調べることができました。この取り付け手順は、DVまたは脊髄のAPパターニングに適用することができる。私たちは、脊髄のDVパターニング下流のWntエフェクターの異なる役割を決定するために、この手順を使用している。この実装を使用して、我々は単一細胞レベルでDVマーカーの解像度を取得し、変更されたWntシグナル受信4,5の結果として微細なパターニングシフトを決定することができた。この取り付け手順では、抗ホスホヒストン3またはBrdU標識（前駆増殖）分化5を通して分裂指数の計算が可能になります。

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

ゼブラフィッシュ脊髄はいくつかの理由で、神経系の研究のための効果的な調査モデルです。まず、遺伝子、遺伝子導入および遺伝子ノックダウンのアプローチは、神経系の発達の根底にある分子機序を調べるために利用することができる。第二に、発達上同期した胚の大クラッチは、大きな実験試料サイズを提供します。第三に、ゼブラフィッシュ胚の光学的透明度は、前駆​​細胞、グリアおよびニューロン集団を視覚化するために研究者を可能にします。ゼブラフィッシュ胚が透明であるが、試料厚さは、効果的な顕微鏡的視覚化を妨げることができます。この理由の一つは、脊髄体節組織とその上のタンデム開発である。もう一つの理由は、まだ初期の神経発生の期間中に存在する大規模な卵黄のボール、である。本稿では、マイクロダイセクションと周囲の体節組織を維持しながら微細な可視化を可能にする固定胚における卵黄の除去を実証する。私たちALSOゼブラフィッシュ胚の半永久的な取り付けを示しています。それは、組織の三次元性を保持し、これは、背腹方向および前後軸における神経発達の観察を可能にする。

そのような細胞のパターニング、分化、および軸索ガイダンスのような種々の発生事象の根底にあるメカニズムを解明する場合には、それらの組織のコンテキスト内で細胞を可視化できることが重要である。 PAX、NKX、あるいはdbxの家族 4における転写因子の発現領域での腹や背のシフトなどの典型的に存在背腹パターニング不良。時には、変更はわずか数細胞直径4を備え、微妙な場合があります。断面解析は、このタイプの分析を可能にする。しかし、弱い信号、またはAP軸に対して垂直でない断面を有する試薬が解釈を制限することができます。さらに、断面解析が容易に変更がAP軸に固執するかどうかを考慮に入れると、クライオスタットの利用可能性に依存していません。この制限は、脊髄の側面図によって回避される。 図2Bに見られるように、NKX6.1のmRNAをd前駆ドメイン内で、24時間後に受精（HPF）で、脊髄の約腹側半分にistributed。前駆細胞は、脊髄の内側部分に見出される床板の存在に起因する有糸分裂後の細胞から区別可能である。 DIC光学を使用して表示、個々の細胞は明らかに識別可能であり、発現細胞および非発現との間の定義された境界が明らかである。 前駆細胞周期の出口は、遺伝子発現の変化を伴う。たとえば、すべての有糸分裂後のニューロンは、免疫細胞の1,5で検出可能であるHUC / Dを発現する。 膵島、GATA、およびVSXの家族のためのmRNAプローブは、各脊髄hemisegment 6内で一貫位置や数の具体的な有糸分裂後ニューロンを標識する。また、このようなロボファミリーのもののような軸索 ​​ガイダンス受容体は、分裂終了ニューロン（ 図2C）の制限された集団において発現される<suP&gt; 2,7,8。胚の横方向の取付けは、有糸分裂後のニューロンの正確なカウントが可能になります。同様に、分裂し続ける前駆細胞は、抗ホスホ - ヒストン3免疫細胞ならびにBrdU標識を用いて定量することができる。また、細胞死はTUNEL標識4-6で評価することができる。 24 HPFで、次の有糸分裂後のニューロンの軸索は、様々な方法で可視化することができ、単一細胞レベルで区別される。背側横昇順（DoLA）、交連プライマリ昇順（COPA）、交連セカンダリ昇順（COSA）、腹側縦降順（草原）、コールマー-Agdur（KA）、交連分岐/縦（COB / L）の周昇順（CIA）周降順（CID）、およびユニポーラ交連降順（UCoD）、Rohon - ベアード（RB）は、運動ニューロン（ M）9。軸索は背側、腹側、前部および後部の方向にこれらのニューロンから伸びている。これらの枝、背側の両方を正中線を横断し、終了しますおよび腹側脊髄。共焦点レーザー走査顕微鏡と組み合わせると、これらの多様な細胞挙動は、免疫細胞化学などGFP 2などの遺伝的にコードされる蛍光タンパク質を用いて、横方向に取り付けられた胚において明らかである。 図2Dに、ZNP-1免疫細胞を開発する運動ニューロンを標識した。運動ニューロンは、周囲の発展途上の筋肉組織を刺激するために腹側脊髄を終了します。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> 図1。切開およびゼブラフィッシュ胚のマウント横。（A）の免疫蛍光のために処理した後に、in situハイブリダイゼーションなどで 、胚を35ミリメートルのペトリ（0.5％トリトンX-100を含むPBS）PBTを充填した皿又はPTwは（PBSとに配置されている0.1％のTween-20）。卵黄ボール（YB）が明らかである。 （B）卵黄を注意深く切開に続いて、胚の頭部を固定することによって除去される。 （C）胚は、ポーカー（釣り糸をパスツールピペットに接着）の胚および卵黄破片（D）を分離するために使用される。清浄胚は、顕微鏡スライド（E）上にピペッティングし、（F）整列される。 （G）ワセリンを、カバースリップの角部に適用される。 （H）カバースリップ媒体を実装する際に胚の上に静かに置かれている。 （I）マニキュアはカバースリップの端をシールするために使用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html>強い&gt;図2。経路探索における遺伝子発現パターンおよび軸索の分析は、横方向にゼブラフィッシュ胚を装着。24ゼブラにおけるゼブラフィッシュ胚の（A）デッサン。 BDでは、卵黄嚢延長上およそ4 hemisegmentsは（箱入り領域）可視化する。 （B）NKX6.1、フロアプレート（FP）を含む腹側脊髄において発現される。 （C）robo3は、分裂終了ニューロン（PMN）で表される。床板および前駆ゾーンは、このより横焦点面に明らかではない。 Bでは、Cは 、脊髄は、画像の左側の括弧で囲まれている。 （D）共焦点顕微鏡は、腹側脊髄を出た運動軸索のラベル画像ZNP-1免疫蛍光に使用された。すべての画像では、前方が左にあり、背側がアップしています。 40X長作動距離、水浸漬（NA 0.8）レンズ（5.3 mm）を用いた。oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K ビュー.  Skidmore College. このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

横方向の流体のパーカッション：マウスにおける外傷性脳損傷のモデル

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...