我々は彼らの技術支援のためにマブリーラボとNarieのStorerのメンバーを認識し、米国心臓協会（NCRPサイエンティスト開発グラント0635363N）と資金調達のための国立心臓、肺、血液研究所（グラントSCCOR RFA HL02 - 027）。

パート1：卵の生産とコレクション<ol><li>注射前に夜、場所の仕切​​りでタンクを繁殖で魚をセットアップする。必要に応じて総産卵数を増やすために、魚は1つの男性に女性2の比率で設定することができます。 </li><li>次の朝は、部屋の点灯後、電源をオンにいくつかのタンクから仕切りを引き出し、邪魔されずに嵌合時の約20分間できます。 </li><li>ストレーナーを使用して、繁殖ケージから卵を収集し、卵の水ですすいでください。卵を水でペトリ皿に卵を注ぐと、転送ピペットで未受精卵や破片を取り除く。魚は、注射のために卵の追加のラウンドを生産する大規模なタンクに再グループ化することができます。それらが単一の細胞の段階を通過させることなく生産される卵の最大数を可能にするために採卵のタイミングを調整します。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿の倒立蓋の顕微鏡スライドを置きます。単一の列を形成するスライドの側面に卵を整列するために、転送ピペットを使用してください。卵反対側に対してキムワイプを押すことで、スライドから過剰な卵水を取り外します。 （図1A） </li></ol>パート2：引っ張ってニードル、ロード、および準備<ol><li>マイクロピペットプラーで、愚かなパテのランプを介して敷設して、2つの針および150mmシャーレ内ストアにキャピラリー1.0ミリメートルODのガラスを引き出します。針は、事前にプルアップすることができます。 </li><li> microloaderピペットを用いて注入材料の3μLと積み込む針。残りのほとんどまたはまったく気泡がなくなるまで、針の先端に向かってボーラスを振る。 </li><li>空気源とマイクロインジェクターをオンにします。微量注入器に針を挿入し、ハウジング内に密封を保証する。マイクロマニピュレータの運動と調整の広い範囲を可能にするために適切な位置にあることを確認してください。ステージから高い顕微鏡の視野の平面、、、チップの薄地域を中心に針の先端をもたらす。ピアス絨毛膜と卵黄に十分な針は、細い葉が一貫性のあるビーズの大きさを提供する能力がまだある時点で針をピンチオフする鋭いピンセットを使用してください。マイクロメータでのミネラルオイルを一滴は、各注射の量を計算するために使用することができます。オイルに注入すると、0.1mmの直径を持つビーズは、注入材料の500 PL（図1b）が含まれ、500 PLまたは1nLの注入量は、一般的に使用されています。フットペダルを踏むと針をトリミングし、必要に応じて射出圧力を調整しながらビーズの大きさを監視します。理想的な注入量は、卵の体積の約10％を記入します。針先の品質は、注入の容易さと結果の質と一貫性の両方にとって非常に重要です。 </li></ol>パート3：インジェクション<ol><li>胚は、4細胞期を過ぎて開発していないことを確認します。理想的には、胚は1細胞期になっているはず。 </li><li>あなたの反対側の片手で料理を持って、卵の列に向かって針を下ろします。 </li><li>ピアースは、絨毛膜の表面および卵黄嚢の破砕または引き裂くために見ている間の滑らかなストロークで卵黄を入力してください。卵黄（図1C）への注入材を注入します。気泡を注入するかのどちらかの胚に致死となることができるように卵黄をストレッチすることは避けてください。行を下に向かって、ピペットチップを使用して一貫性のあるビーズのサイズとを、維持するために必要な圧力を調整し、未受精卵を見たり、射出プロセス中に破棄される卵を除去する。 </li><li>卵の列が完了した後、きれいなペトリ皿に注入卵を移動するために卵の水の穏やかな流れを使用してください。必要に応じて繰り返します。対照として、いくつかのuninjected胚を保管してください。初日の終わりには、死亡胚を除去し、注入された胚の数を記録。感染の機会を減らすために定期的に皿の中で卵の水を交換してください。 </li></ol>パート4：代表的な結果注入されているものに応じて、胚は、彼らのuninjected兄弟よりも低いレートで生き残ることができる。幸いなことに、それはそれらの膨大な数字を入れることは容易であるので、これはほとんど問題になりません。それはわずかに発育の遅れを示すことがmorphantsのは正常です。 マイクロインジェクションの結果を説明するために、我々は、ガラスのタンパク質のハート（HEG）のレベルを操作するためにこのプロトコルを使用していました。 HEGは、正常な心臓の開発に必要な膜貫通タンパク質である。その不在では、胚は巨大な流入の器官とチャンバー1の心を開発する。我々は、500μMの濃度で、heg_e3i3_egfr1とheg_e4i4_egfr2、HEGに対して2以前に未記載モルフォを注入した。 2日後の受精では、uninjected兄弟のコントロールは、（図2AおよびB）期待される、正常に表示されます。 heg_e3i3_egfr1を注入された胚は、脳浮腫（図2C）を持っている。これらmorphantsのほとんどの心は、形態を変更したものの、彼らのチャンバーは（図2D）は通常サイズです。胚の注入heg_e4i4_egfr2展示変数心臓欠陥を持つ。他の人が大規模な流入の広大と適度に拡大した心房（図2E及びF）を持っている一方、一部では、正常に表示されます。 HEGの変異体、以前に1を報告したが、非常に拡大した流入路およびアトリウム（図2GおよびH）があります。 我々はまた、完全長cDNA HEGから転写された400 ng /μLのmRNAと野生型胚を注入した。 uninjectedコントロールが（図3AおよびB）正常に発達しながら、HEG mRNAを注入された胚は、本体の軸の短縮野生外観から厳しい単眼症に至るまで表現型のスペクトル、、頭と体の壊死、及び正中線欠陥（図3Cに示すおよびD）。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" />注入されるように図1。胚をシャーレ（）で顕微鏡のスライドに対して、並んでいる。注入量は、マイクロメートルに置かれた鉱物油中に注入することによって決定されます。一般的に使用される500 PL、、の注入量は0.1 mm（B）の直径を有している。すぐに注入した後、モルホリノまたはmRNAは卵黄（C）で中断させるスポットとして表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> 図2：2日後の受精では、uninjected胚は、肉眼的欠陥（）または心臓の表現型（B）を持っていません。モルホリノheg_e3i3_egfr1を注入された胚は、脳浮腫（C、矢印）が、通常サイズの心腔（D）を持っている。モルホリノheg_e4i4_egfr2を注入いくつかの胚は肥大流入地帯と心房（E、F）を持っている。 HEG変異が著しく拡大した流入地帯と心房（G、H）を持っている。 （）、（C）、（E）、及び（G）4X DICイメージです。、（D）、（B）（F）及び（H）20 × DICイメージです。 =アトリウム、それ=流入路。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> 図3。24時間後の受精で、胚は、それらの（B）の間に神経管となく壊死や正中欠損（）と2つの明確に定義された目で長く、まっすぐなボディを持っているuninjected。 HEG mRNAを注入されたいくつかの胚は、対照的に、短縮された体軸、壊死、misshaped体節（C）、及び単眼症（D）を示す。 （A）と（C）4X DICイメージです。（B）と（D）20 × DIC画像です。

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

ゼブラフィッシュのモデルシステムの強みの一つは、特定の遺伝子産物が追加されたり、マイクロインジェクションによる胚から除去することができる容易さです。普遍的に特定のタンパク質を過剰発現するように、コードするmRNAは、それは、1細胞期における卵黄中に注入される。胚のその後の開発中に、RNAは生物全体に分散して変換されます。逆に、特定のタンパク質を除去するために、モルフォが使用されます。モルフォは、特定のRNAのアンチセンス相補性で設計された合成オリゴヌクレオチドである。のmRNAと同様に、モルフォは、1細胞期における卵黄中に注入されています。胚の内部に、彼らは翻訳を防止する、彼らのターゲットRNAをバインドします。 各モルホリノまたはmRNAのために作られる必要がある主な変更は、注入された物質の濃度である。あまりにモルホリノまたはmRNAのどちらかの高濃度は、非特異的毒性を引き起こす可能性があります。各モルホリノが、その最適濃度を決定するために経験的にテストしなければならない一方、200μMと500μMの間で一般的にモルホリノ濃度は、非固有の欠陥を引き起こすことなく効果的に遺伝子の活性をノックダウン。針の開口部の正確なサイズは重要ではありません。針のサイズは、噴射圧力と噴射時間の範囲内で適切なボリュームのボーラスを生成するために調整することができます。 モルフォは、蛋白質内ドメインの機能解剖を含む多くのアプリケーションを持っている。特定のエクソン - イントロン接合部を標的とするように設計するときに、モルフォが発生スプライシングを防止します。我々は、HEGのpre - mRNAの二つモルフォそのバインドエクソン-イントロン接合部の影響を調べた。モルホリノheg_e3i3_egfr1は、成熟した成績証明書にエクソン3を組み込んだからスプライシング機構を防止する、エクソン3とイントロン3の間の接合部を結合する。モルホリノheg_e4i4_egfr2は、同様にエクソン4を削除します。エクソン3と4の両方がEGF様リピートを含むドメインをエンコードする。いくつかの胚はheg_e4i4_egfr2適度に模写変異体を注入し、さらに実験は、心臓の開発にエクソン4をHEGの役割を理解する必要があります。驚いたことに、heg_e3i3_egfr1を注入胚では、脳浮腫、HEG変異体では見られない特徴を持っている。これにより、接合子の変異体では影響を受けないであろう母親の成績証明書をバインドするモルフォの能力に起因する可能性があります。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

ゼブラフィッシュを研究することの利点の一つは、胚のタンパク質レベルの操作の容易さと速度です。標的RNAに対するアンチセンス相補性を有する合成オリゴヌクレオチドであるモルフォは、、特定の遺伝子産物の発現を減らすために胚に追加することができます。逆に、処理されたmRNAは、遺伝子産物のレベルを高めるために胚に追加することができます。胚へのmRNAまたはモルホリノのいずれかを追加するための車両は、マイクロインジェクションです。マイクロインジェクションは、時間あたりの胚数百の注入を可能にする、効率的かつ迅速です。このビデオでは、マイクロインジェクションに関係するすべてのステップを示しています。簡単に言えば、卵は敷設後すぐに採取し、ペトリ皿で​​顕微鏡のスライドに対して、並んでいる。次に、注入材料がロード先の細い針は、インジェクターと空気源に接続されており、インジェクターコントロールが望ましい注入量を生成するために調整されます。最後に、針は、胚の卵黄に突入されており、モルホリノまたはmRNAが排出されます。

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

77.1K ビュー.  Harvard Medical School. このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。

ビデオ: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

生物学

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

モデル遺伝生物として使用するためのメダカ胚のマイクロインジェクション

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Methods Article

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション