1。化学変異注意：我々は、複製RBフォームはEBフォームより化学的突然変異誘発をより従順であることがわかった。半ばサイクル（HPI 20から18の間）で、RBは、事前RB-EB遷移の最大の数字である。 クラミジアは偏性細胞内の病原体であるため、ホストの健全性に対する変異の効果は、細菌の回復を制限することができます。ベロ細胞は、試験した他の細胞株に比べEMSの高レベルの悪影響に対してより耐性であることがわかった。 組換えによる変異の分離は抗生物質耐性遺伝子組換え子孫のために選択する必要があります。我々は、組換え分析を実行すると、同質遺伝子系統を分離する能力のために変異体を生成するための薬剤耐性菌（ 例えばリファンピン、スペクチノマイシン、またはトリメトプリム）を使用することをお勧めします。抗生物質耐性株は、段階的な選択処理（15,16）によって生成された。 しないE： クラミジアトラコマチス （ひずみL2 / 434/Bu / ATCC VR902B）はBSL2病原体である。このような病原体を取り扱うための制度標準操作手順（SOP）を参照してください。 <ol><li>培養細胞と感染の調製： <ol><li>シード約1×25 1cm 2当たり10 6 Vero細胞（ATCC CCL-81）（T25）、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）3ml中フラスコ。 37℃、5％CO 2。細胞は24時間以内にコンフルエントな単層を形成すべきである。 </li><li>培地を吸引。培地3ml（DMEM、200 ngの/ mlのシクロヘキシミド、10％FBS）の総容積の5の感染多重度（MOI）（〜14×10 6）でクラミジアとVero細胞のコンフルエントT25フラスコに感染。 </li></ol></li><li> 18時間感染後（HPI）に変異導入を開始します。 <ol><li>リン酸20 mg / mlのEMS（エチルメタンスルホン酸）を準備生理食塩水（PBS）は、0.9 mMのカルシウムで緩衝EMSのような化学物質の安全フード内クロライドおよび0.49 mMの塩化マグネシウムは、揮発性の液体である。 注：EMSは強力な変異と発癌物質である。 EMSは、1Mの水酸化ナトリウムで無駄に流出を除染、プラスチック、紙、ガラス中和する。 </li><li>培地を吸引除去し、PBS /のMgCl 2 / CaCl 2を3mlで細胞を1回洗浄する。室温でのドラフトで1時間PBS /のMgCl 2 / CaCl 2を20 mg / mlのEMS 3mlで細胞をインキュベート。 Vero細胞は、短い期間のインキュベーター外EMSと条件のこの濃度を生き残ることができます。突然変異していない対照サンプルを含めることを忘れないでください。 </li><li> EMSを含む培地を取り出し、変異を不活性化するには、1 MのNaOHを容器に入れてください。残留変異を除去するために感染した細胞を3 mlのPBS +のMgCl 2 / CaCl 2を3回洗浄する。 200 ngの/ mlのシクロヘキシミド及び25μgの/ mlのゲンタマイシンとDMEM/10％FBS 6mlのを追加し、5％COでインキュベート<sub&gt;の2、48〜72時間、37℃。介在物は変異誘発後36時間程度の細菌を欠いて表示されます。残りは空のままで72時間後に介在物の約10％が細菌で満たされている。 </li><li>低張溶解によってEBSを抽出：完全培地を吸引。 10分間、細胞を取り除くために1.0ミリリットルH 2 Oとロックを追加します。少なくとも10回上下にピペッティングして細胞を溶解。微量でライセートと1X最終濃度にそれを持って来るために0.250ミリリットル5Xショリン酸グルタミン酸バッファ（SPG）を追加収集します。 -80℃で保存 注：突然変異誘発のレベルはリファンピン耐性の誘導によって評価することができる。リファンピン耐性の検定頻度に、リファンピンの200 ngの/ mlの存在下での細菌のプラーク1×10 8と7×10倍連続希釈。リファンピン耐性の周波数は、めっき細菌の総数で割っリファンピン耐性プラーク数として定義される。プラーク手順については、下記のセクションを参照してください。 </li></ol></li></ol> 2。プラーク精製によってクラミジアトラコマチス変異株のクローン単離<ol><li>ウェル当たり3ミリリットルDMEM/10％FBSでシード〜0.4×10 6細胞：6ウェルプレートでVero細胞のコンフルエントな単層を設定します。細胞は、次の24時間にわたって均質な単層を形成することができます。 </li><li>氷の上で突然変異クラミジアの原液を解凍。 DMEM/10％FBSで希釈当たり200μlの総体積で6×10倍連続希釈を行い、氷の上に設定してください。 注：インクルージョン形成単位の細菌力価は（IFU）プラーク形成単位（P​​FU）の良い推定値である。プラーク10、100を目指して、1000 PFU。 </li><li>ウェル当たり3ミリリットルPBSで2回Vero細胞を洗ってください。 </li><li> 6ウェルプレートと重複の細菌希釈液100μlを各ウェルに3ミリリットルDMEMを追加。渦巻さえ混合を確保するためのプレート。 </li><li> 15で30分間2,700 xgで感染したプレートスピン°Cその後加湿で37℃でインキュベートし、1〜2時間、5％CO 2インキュベーター。 </li><li> ：DMEM中アガロース（6井戸用）0.54パーセントを準備<ol><li> 18.9ミリリットル冷たい倍DMEM、4.2ミリリットルFBS、0.42ミリリットル100倍NEAA、0.042ミリリットルは200μg/ mlのシクロヘキシミド、0.021ミリリットル50mg/mlでゲンタマイシン：以下の成分を追加します。よく混ぜる。 </li><li>塊を防止するために攪拌、ホット滅菌1.2％アガロース/ H 2 Oの18.9ミリリットルで混ぜる。混合物が触れないように暖かくする必要があります。感染した細胞に添加する前に55℃の温水浴してください。 </li></ol></li><li>皿から細菌懸濁液を吸引し、ウェルあたり6ミリリットル0.54パーセントアガロース/ DMEMを適用します。アガロースが15分間フード外室温で完全に固化することができます。 15分間バイオセーフティフードで、取り外し蓋とプレートを乾燥させる。 注：生物学的封じ込めのフードからの振動が固化アガロースを歪めることができます。 </li><li> 7-10日間CO 2インキュベーター内で37℃でインキュベートする。プラークは解剖顕微鏡の助けを借りて見えるはずです。 （REプラークの典型的なイメージのために、図3を FER。） </li><li> 96ウェルプレートにウェル当たり100μlの中で前に隔離する変異の前日、シード1×10 4 Vero細胞。細胞は24時間以内にコンフルエントになります。 </li><li>解剖顕微鏡を用いて、マークプラークを採取する。滅菌1.0ミリリットルバリアピペットチップを使用してプラークのプラグを収集します。 </li><li> DMEM100μlの中で再懸濁しプラークは10％FBS、400 ngの/ mlのシクロヘキシミド、50μgの/ mlのゲンタマイシンを補った。 </li><li>変異株を展開するには、Vero細胞のコンフルエントな単層上にサスペンションをオーバーレイ。 2,700×gで、15℃で30分間でプレートスピン。 </li><li>加湿インキュベーター中で37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 48 HPI、早ければ、14日ほど遅く発生する可能性がある細胞の&gt; 50％が感染している収穫EBを、。感染した細胞の量は十分な生菌が格納されることを可能にする。変異株は、成長率と感染性が異なる。ナチュラに成長の遅い株を許可する十分な細胞が感染されるまでLLY隣接セルに再感染する。 </li><li>感染細胞の低張溶解によってEBSを抽出します。 <ol><li>完全培地を吸引。 </li><li>滅菌水160μlのを追加します。 10分間室温でインキュベートする。 </li><li>完全な溶解を確実にするために上下に数回ピペッティングして細胞を破砕、交差汚染を回避するために、バリアのヒントを使用しています。 </li><li>マイクロチューブに溶解物160μLを移します。 </li><li> 5倍のSPG40μlのに混ぜる。 -80℃で保存</li></ol></li><li>関心の表現型（S）のためのアッセイおよび画面変異。 </li></ol> 3。選択されたクラミジアの変異体の全ゲノムシーケンシング<ol><li>宿主DNAを汚染の大部分は自由である勾配精製EBを、からゲノムDNAを抽出します。 EBをのクラミジアと精製の ​​大規模培養のためのプロトコルは、REFで見つけることができます。 （17）。内線に商業ゲノムDNA精製キット（ 例えばキアゲン猫。69504）を使用しメーカーの指示に従って2×10 9細菌からDNAをRACT。 </li><li>正確にDNA量を測定する蛍光（量子ビット、インビトロジェン猫。Q32866）を使用します。 DNAの精製1-5μgのイルミナシーケンシングプラットフォームのために必要です。 注：いくつかのプラットフォームがIllumina/Solexa-とソリッドベースシステムを含むシーケンス細菌ゲノムに使用することができます。我々は、それが短いの高密度を生成としてHiSeq（イルミナ）を使用することを選択したが、高品質のシーケンシングを読み取り。このようなIonTorrent（Life Technologies社）とMySeq（イルミナ）など小規模なゲノムシーケンサは、あまりにも適しており、十分なゲノムアセンブリのため25Xの最小限の範囲を超えた時、少なくとも4 クラミジアゲノムまで、これらのシングを多重化するための十分以上。イルミナプラットフォームのためのDNAシークエンシングライブラリーの調製を以下に説明する。 </li><li>でS220アダプティブ集束音響を使用して適切なサイズにフラグメントDNA（イルミナシーケンシングのための300-400塩基対）製造元が推奨する設定に従ってインストゥルメント（Covaris）。注意：サンプルのエアロゾル化のために、サンプルの大きな損失で噴霧の結果DNA断片。 </li><li>メーカーの指示に従って、商業建築·キット（イルミナFC-102-1001）を使用して、ゲノムシーケンシングライブラリを準備します。ライブラリは、複数のサンプルを同時にプールし、配列決定することができるようにバーコードプライマー（イルミナFC-121-1003）を用いて索引付けすることができる。 </li><li>シークエンシングのサンプルを実行します。このステップは通常の商用サービスや専用の技術スタッフが運営する中核施設によって実行されます。彼らの手順と推奨事項に従ってください。 </li><li>イルミナ読み取りが（FASTQ形式）は、またSNP /変異を同定するために使用することができるGeneious（Biomatters）など、ユーザーフレンドリーなグラフィックユーザーインターフェースのソフトウェアを使用して、基準ゲノムに組み立てることができる。マップ変異に、最小バリアント周波数と最小の適用範囲のための50倍、90％までのパラメータを設定します。オープン同一レベルこのようなMAQ（18）とBWA（19）として電子ゲノムアセンブラを用いることもできる。 </li><li>サンガー配列決定により変異の確認：サンガー配列決定により同定された変異とシーケンス精製または希釈（1：20）PCR産物に隣接300-500 bpの領域をPCR増幅のための鋳型としてゲノムDNAを使用しています。 </li></ol> 4。 クラミジア組換え体の生成注： クラミジアは感染時にDNAを交換することができ、どれが組換え株の世代（12、13、20）を可能にします。 2つのユニークな抗生物質耐性株による細胞の同時感染の後、組換え &quot;子孫&quot;は、デュアル抗生物質耐性（12,13）のために選択することができる。我々は、突然変異を分離し、共同質遺伝子系統を生成するために、この現象を利​​用した。したがって、変異株は抗生物質耐性の背景（CTL0567（rpoB）で例えばリファンピン耐性（RIF R）H471Y）彼らは野生型株bearinに交差することができるように生成された著異なる抗生物質耐性対立遺伝子（ 例えば、スペクチノマイシン耐性（SPC R）、r01/r02でG1197A（16SRNA 1と2をコピー））。 クラミジアにおけるDNA交換と再結合に関する詳細については、参考文献（12、13）を参照してください。 <ol><li> 24ウェルプレート上に成長したVero細胞のコンフルエントな単層に各株からcentrifuging6×10 5細菌によって、野生型およびクローンの変異株を共同感染。並行して、単独の各株で単層に感染。 </li><li> 44でHPI、感染細胞の低張溶解によって収穫したEB： <ol><li>完全培地を吸引。 </li><li>滅菌水0.4 mlを加え、10分間放置。 </li><li>活発な、少なくとも10回のアップ＆ダウンペッティングにより細胞を溶解。転送は、マイクロチューブに溶解物。 </li><li> 1X SPGの最終濃度のために5倍のSPGの0.1ミリリットルでミックス。 </li><li>粗溶解液を即座に使用されるか、または-80℃で保存することができる℃で</li></ol></li><li>原油EBのプラーク50μlのは名誉な組換え体を選択するために、適切な抗生物質を添加したアガロース/ DMEM中のd 5×1時10分の段階希釈。 （組換え体の選択のための代表的な抗生物質の濃度についての表を参照してください。） </li><li>プラークは、浄化し、上記のように組換え株を充実させる。所望の表現型の有無のためにスコアが組換え体。変異の有無をタイピングする目的のためDNAzol治療（次項）により組換え株からDNAを抽出します。 </li><li>交雑をさらに突然変異を分離し、同質遺伝子系統を生成するために、他の抗生物質耐性マーカーを有する菌株を繰り返すことができる。別の抗生物質マーカーを冠した別の野生型株に選択された組換え体を共感染させる。 </li></ol> 表1：組換え体の選択のための抗生物質の濃度： <table border="1"><tbody><tr><th>最終濃度</th><th>準備指示</th></tr><tr><td> 200 ngの/ mlのリファンピン</td&gt; <td>ジメチルスルホキシド（DMSO）に25 mg / mlの貯蔵ストックを作る。 H 2 Oとストレージ株式を希釈して200μgの/ mlのワーキングソリューションを構成する暗闇の中で-20℃で保管してください。 </td></tr><tr><td> 200μgの/ミリリットルトリメトプリム</td><td> DMSOで100 mg / mlのストックを作る。 -20°Cで保存</td></tr><tr><td> 200μgの/ミリリットルスペクチノ</td><td> 100μlのアリコートの水で100 mg / mlのストックを作る。 -20℃で保存繰り返し凍結融解は避けてください。 </td></tr></tbody></table> 5。ジェノタイピングのための組換え株からのゲノムDNAの抽出注：カラムベースの精製キットを使用することもできる。 DNAzol処理によるDNA抽出の利点はコストです。 <ol><li> 12ウェルプレート上に成長したVero細胞の単層上に1.2×10 5クラミジアに感染。 </li><li> 36-48 HPIでは、培地を吸引し、DNAzolの0.375ミリリットル（インビトロジェン10503から027）を追加します。優しく細胞とピペットリサを攪拌1.5 mlのマイクロチューブにTES。 </li><li> 100％エタノールの0.188ミリリットルを加えてDNAを沈殿させる。転倒混和します。 </li><li>ピペットチップでスプールによりDNAを抽出し、きれいなチューブに入れます。また、ペレットを室温で2分または4℃、デカント上澄みのトップスピードで遠心分離によってDNA。 </li><li> 75％エタノール1.0mlので二回DNA沈殿物を洗ってください。 </li><li> 15秒のためにエタノールを除去した後空気乾燥DNA。 </li><li>の0.1M HEPESの20.2μlのpH8.0に中和し、その後0.2ミリリットル8 mMのNaOHでDNAを可溶化する。水やTE、0.5 mlの最終容積に持ち出す。また、TEバッファー（DNAペレットが完全に可溶化されません。）中のDNAを再懸濁します。 </li><li>同定された変異に隣接300-500 bpの領域のPCR増幅のためのテンプレートとしてDNAzol抽出したDNAを使用してください。シーケンスは、精製されたまたはサンガー配列決定により（午前1時20分）PCR産物を希釈した。 </li></ol>

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開示することは何もありません。

それは遺伝子型と表現型の間のリンケージを確立するように、この方法論は、遺伝子解析のための基本的な要件を満たしています。重要なことに、これはしばしば、非モデル微生物における遺伝子機能の解析における律速段階である組換えDNA形質転換菌の遺伝子の挿入不活化のための従来の分子生物学のツールの助けを借りずに達成される。 一つの重要なステップは、?...

関連付けられていると、米国では年間推定280万生殖路感染症（疾病管理センター）の後遺症などの骨盤内炎症性疾患、子宮外妊娠、および不妊症（1）などのための絶対細胞内細菌のクラミジアトラコマチスアカウント 。 クラミジア属はユニークを持っている感染が、非複製素体（EB）と非感染性はなく複製網状体（RB）：2つの形式で構成される二相性発達サイクルで生理。感染endoctyotosis（2）続いて上皮細胞へのEBのアタッチメントから始まります。膜結合液胞は、インクルージョンと呼ばれる中では、EBをその後二分裂によって複製RB形、に分化する。半ばサイクルで、RBの遷移当時感染の新しいラウンドを開始するために、細胞外空間に放出されているEBを、ときに宿主細胞溶解する（3）。 クラミジアですこのような細菌の遺伝学のほとんどの研究の中心となっている標的遺伝子の交換、トランスポゾン、および形質導入ファージ、などの標準的な分子遺伝学的ツールを使用してルーチン操作に耐火、それは個々のクラミジア遺伝子が自然免疫の回避に寄与する程度は不明である、栄養買収、発達トランジション、または真核生物宿主（4）内の病原体の生存のために重要な他のプロセス。したがって、この病原体はその臨床的重要性にもかかわらず、不十分な特徴のままです。 クラミジア属のゲノム。次世代シーケンシング技術を用いて配列決定、複数の種と生物型に（5）（〜1 MB）比較的小さい。 WGSによって比較ゲノム解析クラミジア種の進化にユニークな洞察を提供しており、ヒトの（6-8）へとある程度彼らの適応は病原因子のポテンシャル関数（9、10）のようないくつかの情報を提供してきました。 T臨床分離株で表示される、彼の遺伝的多様性は、このような遺伝子の変異を容易に対して選択されていたので、おそらく、体系的にほとんどの病原因子の機能をマッピングするために必要な解像度を提供していません。自然淘汰から交絡影響を与えることなく、病原性のメジャー欠陥その定義されたアッセイと相まって変異誘発の遺伝子変化は、調査することができる突然変異のスペクトルを拡張することができます。化学変異原は、特に、それらがnull、条件、hypomorphic（機能低下）を生成することができますとして有用、とhypermorphic（関数のゲイン）対立遺伝子である。堅牢な次世代のゲノム配列決定技術の到来により、そのような変異を容易に識別してマッピングすることができる。このように、強いアソシエーションが前方に遺伝的アプローチの適用を可能にする、遺伝子または遺伝子経路の変異および共通の表現型の間で行うことができる。 臨床株のゲノム配列は、モザイクBを明らかにしたetweenの血清型と頻繁な組み換えの軌跡（11）。組換えの経験的証拠は、2つの異なる抗生物質耐性株の両方株（12,13）からの遺伝的寄与を有することが判明した二重耐性子孫組換えの選択の同時感染により実証した。したがって、同時感染設定で野生型と変異株の間で遺伝子交換は、化学的に誘発される突然変異の偏析が観察された表現型につながる影響を受けた遺伝子を特定することができます。 ここでは、化学的突然変異誘発、WGS、および感染細胞内のDNA交換（14）（ 図1）のためのシステムに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl methanesulfonate (EMS) </td><td>Sigma</td><td>M0880</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexamide</td><td>Sigma</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin </td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and 0.901 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (PBS+MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water (sterile, tissue culture grade)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids (NEAA) </td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td><td>Lonzo</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>Genomic DNA purification kits</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Life Technologies</td><td>10503-027</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mM NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemical safety hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological safety hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&gt;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&gt;Dissection microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer (Qubit)</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

クラミジアトラコマチス 、性病と眼感染症の病原体は、組換えDNAで不完全に起因する実験的な変革へのその扱いにくさに特徴のままです。我々はCで遺伝子解析を実行するためのアプローチを開発分子遺伝学的ツールの不足にもかかわらず、 トラコマティス 。我々の方法は、関係する：i）急速に明確な表現型と遺伝的に定義された変異体の包括的なライブラリを生成するために、化学的突然変異誘発し、ii）の全ゲノムシーケンシング（WGS）は、基礎となる遺伝的病変をマッピングすると、変異遺伝子（群）との間の関連を見つけると。共通の表現型; iii）の変異体および野生型細菌と哺乳動物細胞の同時感染を介した組換え株の生成。そこで、遺伝子型と表現型の間の因果関係を確立することができました。相関遺伝子型 - 表現型の関連百鬼夜行を確立するために、化学的に誘発される遺伝子変異とWGSのカップリングldは遺伝子解析に現在難病医学的に、環境に重要な微生物の大規模なリストに広く適用される。

突然変異原への曝露は、細菌の細胞死が原因おそらく、細菌を欠い現れる介在物につながる。一般的に、血清型LGV-L2は完全に48時間後に感染症の中で感染した細胞を溶解しますが、変異誘発物質による治療は&gt; 90 hまでこのサイクルを拡張することができます。介在物の約10％が回復すると予想される。我々の実験では、20 mg / mlのEMSで治療感染Vero細胞は、未処理のコントロールと比較して感?...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。

フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K ビュー.  Duke University Medical Center. 我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することがで?...

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient clearance or persistence of the pathogens may lead to ascending infections of the upper genital tract and are supposed to cause chronic inflammatory damage to infected tissues 1,2. As a consequence, severe clinical sequelae like pelvic inflammatory disease (PID), tubal occlusion and infertility may occur 3,4. 
Most of the research with C. trachomatis has been conducted in epithelial cell lines (e.g. HEp-2 cells and HeLa-229) or in mice. However, as with cell- culture based models, they do neither reflect the physiology of native tissue nor the pathophysiology of C. trachomatis genital tract infections in vivo 5. Further limitations are given by the fact that central signaling cascades (e.g. IFN-&gamma; mediated JAK/STAT signaling pathway) that control intracellular chlamydial growth fundamentally differ between mice and humans 6,7. We and others therefore established a whole organ fallopian tube model to investigate direct interactions between C. trachomatis and human fallopian tube cells ex vivo 8,9.
For this purpose, human fallopian tubes from women undergoing hysterectomy were collected and infected with C. trachomatis serovar D. Within 24 h post infection, specimen where analyzed using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) to detect Chlamydia trachomatis mediated epithelial damage as well as C. trachomatis inclusion formation in the fallopian tissue.

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

We describe an ex vivo infection model for visualisation of direct interactions from bacterial pathogens with human fallopian tube cells. The whole organ tissue model was established to investigate C. trachomatis induced pathology to the female fallopian tube under "life-like" conditions.

の調査のための人間の卵管モデル<em&gt; C.トラコマチス</em&gt;感染症

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

医学

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

遺伝学

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

の遺伝的操作<em&gt;Δku80</emの機能ゲノム解析のための&gt;株<em&gt;トキソプラズマ</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

免疫・感染学

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

生化学

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard manufacturing. To achieve an effective protein-based subunit vaccine, the protein antigen often needs to adopt a native-like conformation. This is particularly important for pathogen-surface antigens that are membrane-bound proteins. Cell-free methods have been successfully used to produce correctly folded functional membrane protein through the co-translation of nanolipoprotein particles (NLPs), commonly known as nanodiscs. 
This strategy can be used to produce subunit vaccines consisting of membrane proteins in a lipid-bound environment. However, cell-free protein production is often limited to small scale (&lt;1 mL). The amount of protein produced in small-scale production runs is usually sufficient for biochemical and biophysical studies. However, the cell-free process needs to be scaled up, optimized, and carefully tested to obtain enough protein for vaccine studies in animal models. Other processes involved in vaccine production, such as purification, adjuvant addition, and lyophilization, need to be optimized in parallel. This paper reports the development of a scaled-up protocol to express, purify, and formulate a membrane-bound protein subunit vaccine. 
Scaled-up cell-free reactions require optimization of plasmid concentrations and ratios when using multiple plasmid expression vectors, lipid selection, and adjuvant addition for high-level production of formulated nanolipoprotein particles. The method is demonstrated here with the expression of a chlamydial major outer membrane protein (MOMP) but may be widely applied to other membrane protein antigens. Antigen effectiveness can be evaluated in vivo through immunization studies to measure antibody production, as demonstrated here.

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

This protocol describes using commercial, cell-free protein expression kits to produce membrane proteins supported in nanodisc that can be used as antigens in subunit vaccines.

フォワード遺伝的アプローチで

要約

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の調査のための人間の卵管モデル

酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

の遺伝的操作

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ

ワクチン開発のためのクラミジア・ムリダルム由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加

フォワード遺伝的アプローチで

要約

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の調査のための人間の卵管モデル

酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

の遺伝的操作

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング

アメーバ共培養し、アメーバ濃縮アプローチによって新しい細胞内病原体の発見

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ

ワクチン開発のためのクラ ミジア・ムリダルム 由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加

ワクチン開発のためのクラミジア・ムリダルム由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加