1. 화학적 돌연변이 유발 참고 : 우리는 증식하는의 RB 양식 EB 양식보다 화학적 돌연변이 유발에 더 순종 것으로 나타났습니다. 중간 사이클 (HPI 20-18 사이)에서 RBS는 사전 RB-EB 전환에 가장 큰 숫자에 있습니다. 클라미디아의 trachomatis는 의무 세포 내 병원체이기 때문에, 호스트 건강에 돌연변이의 효과는 세균의 회복을 제한 할 수 있습니다. 베로 세포는 테스트를 다른 세포 라인보다 EMS 높은 수준의 부작용에 ​​저항 것으로 밝혀졌다. 재조합에 의한 변이의 분리는 항생제 내성 유전자 재조합 자손에 대한 선택을해야합니다. 우리는 재조합 분석을 수행하고 isogenic 균주를 분리하는 능력 돌연변이를 생성하기위한 약물 내성 변종 (예를 들어, 리팜핀, 스펙 티노 마이신, 또는 트리 메토 프림) 사용하는 것이 좋습니다. 항생제 내성은 단계적으로 선택 과정 (15, 16)에 의해 생성되었다. 아니E : 클라미디아의 trachomatis (변형 L2 / 434/Bu / ATCC VR902B가) BSL2 병원체이다. 이러한 병원균을 처리하기위한 제도적 표준 운영 절차 (SOP)를 참조하십시오. <ol><li> 배양 세포와 감염의 준비 : <ol><li> 25cm 2 (T25) Dulbecco 수정 이글 중간 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 3 ㎖의 플라스크 당 종자 약 1 × 10 6 베로 세포 (ATCC CCL-81). 37 품어 ° C, 5 % CO 2.에게 세포는 24 시간 안에 합류 단층을 형성해야한다. </li><li> 매체를 대기음. 매체의 3 ML의 총 볼륨 5 (~ 14 × 10 6)의 감염의 다중성 (모이) (DMEM, 200 NG / ML cyclohexamide, 10 % FBS)에서 클라미디아와 베로 세포의 합류 T25 플라스크를 감염. </li></ol></li><li> 18 시간 게시물 감염 (HPI)에서 돌연변이를 시작합니다 : <ol><li> 인산의 20 MG / ML EMS (에틸 메탄)를 준비 식염수 (PBS)는 0.9 mM의 칼슘과 버퍼EMS와 같은 화학 물질 안전성 후드 염화 0.49 밀리미터 염화 마그네슘은 휘발성 액체이다. 참고 : EMS는 강력한 돌연변이 및 발암 물질이다. EMS 낭비하고 1 M 수산화 나트륨과 유출, 플라스틱, 종이 및 유리의 오염을 제거 중화. </li><li> 매체를 대기음 PBS / MgCl 2 / 염화칼슘 2 3 ㎖ 한 번 세포를 씻으십시오. 상온에서 흄 후드에서 한 시간 동안 PBS / MgCl 2 / 염화칼슘 20 MG / ML EMS 3 ml의 세포를 품어. 베로 세포는 짧은 기간 동안 인큐베이터 외부 EMS 및 조건이 농도 살아남을 수 있습니다. mutagenized되지 않은 컨트롤 샘플을 포함해야합니다. </li><li> EMS를 포함하는 매체를 제거하고 돌연변이를 비활성화하는 1 M NaOH를 용기에 넣습니다. 잔여 돌연변이를 제거하는 3 ML PBS + MgCl 2 / 염화칼슘에 감염된 세포에게 3 번 씻으십시오. 200 NG / ML cyclohexamide 25 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신과 DMEM/10 % FBS 6 ML을 추가하고, 5 % CO 품어 <suB&gt; 2, 48-72 시간 동안 37 ° C. 흠 돌연변이 유발 후 36 시간에 대한 박테리아의 결여가 나타납니다. 나머지는 비어있는 동안 72 시간에 함유의 약 10 %는 박테리아로 가득 차 있습니다. </li><li> 저장성 용해에 의해 사채를 추출 완전히 매체를 대기음. 10 분 동안 세포를 이동시키다하는 1.0 ML H 2 O와 바위를 추가합니다. 적어도 10 번과 위아래로 pipetting하여 세포를 용해. 의 microfuge에서 해물과 1X 최종 농도를 가져다 0.250 ML 배 자당 인산 글루 탐 산염 버퍼 (SPG)를 추가를 수집합니다. -80에서 보관 ° C. 참고 : 돌연변이 유발의 수준이 리팜핀 내성의 유도에 의해 평가 될 수있다. 리팜핀 내성 시험 주파수를, 패 1 × 10 8 7 X 200 NG / 리팜핀의 ML의 면전에서 박테리아의 10 배 연속 희석. 리팜핀 내성의 빈도는 도금 된 박테리아의 총 개수로 나눈 리팜핀 내성 패의 숫자로 정의됩니다. 플라크 지침은 아래 섹션을 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 패 정화하여 클라미디아의 trachomatis 돌연변이 균주의 클론 분리 <ol><li> 6 잘 접시의 베로 세포의 합류 단층을 설정 종자 ~ 0.4도 당 3 ML DMEM/10 % FBS에서 x 10 6 세포. 세포는 다음 24 시간 동안 균일 한 단일 층을 형성 할 수 있습니다. </li><li> 얼음에 mutagenized 클라미디아의 원액을 녹여. DMEM/10 % FBS에 희석 당 200 μL의 총 볼륨 6 X 10 배 연속 희석을 수행하고 얼음을 설정합니다. 참고 : 포함 형성 단위 세균 역가 (IFU)이 플라크 형성 단위의 좋은 추정치 (PFU)입니다. 패 10, 100 목표로 1000 PFU. </li><li> 물론 당 3 ML PBS로 두 번 베로 세포를 씻으십시오. </li><li> 6 - 잘 접시와 중복의 세균 희석 100 μl를 각 well에 3 ML DMEM을 추가합니다. 소용돌이도 혼합물을 보장하기 위해 판. </li><li> 15시 30 분 2,700 XG에 감염된 접시를 스핀 ° C 다음 가습에 37 ° C에서 알을 품다,1 ~ 2 시간 동안 5 % CO 2 배양기. </li><li> 0.54 % DMEM의 아가로 오스 (6 우물) 준비 : <ol><li> 18.9 ML 추위 2X DMEM, 4.2 ML FBS, 0.42 ML 100 배 NEAA, 0.042 ML 200 ㎍ / ㎖ cyclohexamide, 0.021 ML 50mg/ml 겐타 마이신 : 다음 성분을 추가합니다. 잘 섞는다. </li><li> 수풀을 방지하기 위해 교반, 뜨거운 멸균 1.2 % 아가로 오스 / H 2 O의 18.9 ㎖를 혼합한다. 혼합물에 열이어야합니다. 감염된 세포에 추가하기 전에 55 ° C에서 따뜻한 물을 욕조에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 접시에서 세균 현탁액을 대기음 6 ML 0.54 % 아가로 오스 / DMEM을 당에도 적용됩니다. 아가로 오스 15 분 후드 외부 실온에서 완전히 응고 할 수 있습니다. 뚜껑은 15 분 동안 바이오 안전성 후드 제거와 접시를 건조. 참고 : 생물학적 밀폐 후드에서 진동 고형화 아가을 왜곡 할 수 있습니다. </li><li> 7 ~ 10 일 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다. 플라크는 해부 현미경의 도움으로 볼 수 있어야합니다. (재플라크의 전형적인 이미지 그림 3 FER). </li><li> 사전 분리 돌연변이에 하루 씨앗 1 개 10 100 μL에 잘 당 96 - 웰 플레이트의 4 베로 세포. 세포는 24 시간 안에 합류 할 것입니다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 표시 패를 선택할 수 있습니다. 멸균 1.0 ML 장벽 피펫 팁을 사용하여 패의 플러그를 수집합니다. </li><li> DMEM 100 μL의를 Resuspend 패 10 % FBS, 400 NG / ML cyclohexamide, 50 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신과 보충. </li><li> 돌연변이 균주를 확장하려면, 베로 세포의 합류 단층에 현탁액을 오버레이. 30 분 2,700 XG, 15 ° C에서 접시를 회전. </li><li> 가습 배양기에서 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. 48 HPI 빠르면 14 일로 늦게 발생할 수있는 세포의&gt; 50 % 감염되어 수확 사채. 감염된 세포의이 금액은 충분히 가능한 박테리아가 저장 될 수 있습니다. 돌연변이 균주의 성장 속도와 감염에 차이가 있습니다. 타고난로 성장하는 균주를 느리게 할 수충분한 세포가 감염 될 때까지 에서야 이웃 세포를 다시 감염. </li><li> 감염된 세포의 삼투압 용해에 의해 사채의 압축을 풉니 다 : <ol><li> 완전히 매체를 대기음. </li><li> 멸균 물 160 μl를 추가합니다. 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 완전한 용해를 보장하기 위해 여러 번 위아래로 pipetting에 의해 세포를 중단, 교차 오염을 방지하기 위해 장벽 팁을 사용합니다. </li><li> 의 microfuge 튜브에 해물 160 μl를 전송합니다. </li><li> 배 SPG의 40 μL에 섞는다. -80에서 보관 ° C. </li></ol></li><li> 그 표현형 (들)에 대한 분석 및 화면 돌연변이. </li></ol> 3. 선택한 클라미디아 돌연변이의 전체 게놈 시퀀싱 <ol><li> 호스트 DNA 오염의 대부분 무료입니다 그라디언트 정제 사채에서 게놈 DNA를 추출합니다. 사채의 클라미디아와 정화의 대규모 문화 프로토콜은 심판에서 찾을 수 있습니다. (17). 내선 번호에 상용 게놈 DNA 정제 키트 (예 : Qiagen의 고양이. 69504)를 사용하여제조업체의 지침에 따라 2 × 10 9 박테리아에서 DNA를 ract. </li><li> 정확하게 DNA의 양을 측정하는 형광을 (큐 비트, Invitrogen의 고양이. Q32866)를 사용합니다. 정제 된 DNA를 1-5 μg은 Illumina의 시퀀싱 플랫폼이 필요합니다. 참고 : 여러 플랫폼을 Illumina/Solexa- 고체 기반의 시스템을 포함한 일련의 세균 게놈에 사용할 수 있습니다. 우리는 짧은 고밀도 생산으로 HiSeq (Illumina의)를 사용하기로 결정했습니다, 그러나 고품질 시퀀싱을 읽습니다. 같은 IonTorrent (생명 기술)와 MySeq (Illumina의)와 같은 작은 규모의 게놈 시퀀서도 적합하며, 적절한 유전체 어셈블리 25X의 최소 범위를 초과하는 시간에 4 클라미디아 게놈까지 이러한 quencing 다중화를위한 충분한보다. 일루미나 플랫폼의 DNA 시퀀싱 라이브러리의 준비 아래에 설명되어 있습니다. </li><li> 에 S220 적응 집중 음향을 사용하여 적절한 크기로 조각 DNA (Illumina의 시퀀싱 300-400 기본 쌍)제조업체의 권장 설정에 따라 (Covaris) strument. 참고 : 샘플 aerosolization에 의한 시료의 큰 손실 분무 결과로 DNA 파편. </li><li> 제조업체의 지침에 따라, 상업 건설 장비 (Illumina의 FC-102-1001)을 사용하여 게놈 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다. 라이브러리는 여러 샘플을 풀링 동시에 염기 서열 될 수있는 바코드 프라이머 (Illumina의 FC-121-1003)를 사용하여 인덱싱 할 수 있습니다. </li><li> 샘플 시퀀싱 실행합니다. 이 단계는 일반적으로 상용 서비스 또는 전용 기술 직원에 의해 운영 핵심 시설에 의해 수행됩니다. 그 절차와 권장 사항을 따르십시오. </li><li> Illumina의 읽기는 (FASTQ 형식)는 SNP / 돌연변이 식별에 이용 될 수있는, 그러한 (Biomatters) Geneious으로, 사용자 친화적 인 그래픽 사용자 인터페이스 소프트웨어를 사용하여 참조 게놈에 조립 될 수있다. 지도 돌연변이에 최소 변형 주파수 및 최소 범위에 대한 50X를 90 %로 매개 변수를 설정합니다. 오픈 원료에서같은 MAQ (18)와 BWA (19)와 같은 전자 게놈 어셈블러는,도 사용할 수 있습니다. </li><li> 생어 시퀀싱으로 돌연변이를 확인 : 생어 시퀀싱으로 정제 또는 (1시 20분) PCR 제품을 희석하여 확인 된 돌연변이 순서를 측면에서는 300 ~ 500 bp의 영역의 PCR 증폭을위한 템플릿으로 게놈 DNA를 사용합니다. </li></ol> 4. 클라미디아 재조합의 생성 참고 : 클라미디아 감염 중 DNA를 교환 할 수있는 재조합 균주의 생성 (12, 13, 20) 할 수 있습니다. 이후 두 개의 고유 한 항생제 내성 재조합 &quot;자손&quot;로 세포의 공동 감염 (12, 13) 이중 항생제 내성 선택할 수 있습니다. 우리는 돌연변이를 분리하고 공동 isogenic 변종을 생성하는이 현상을 이용했다. 따라서 돌연변이 균주 (CTL0567 (rpoB) 예를 들면 리팜핀 내성 (RIF R) H471Y) 항생제 내성 백그라운드에서 생성 된 그들은 야생형 균주 bearin에 교차 될 수있는조지아 다른 항생제 내성 대립 유전자 (예를 들어, 스펙 티노 마이신 저항 SPC (R), r01/r02에 G1197A (16SRNA 1, 2 부)). 클라미디아의 DNA 교환 및 재조합에 대한 자세한 내용은 참조 (12, 13)를 참조하십시오. <ol><li> 24 잘 접시에 성장 베로 세포의 합류 단층 위에 각 변형에서 centrifuging6 × 10 5 박테리아에 의해 야생 유형 및 클론 돌연변이 균주를 공동 감염. 병렬로 혼자 각 변형에 단일 층을 감염. </li><li> 44시 HPI, 감염된 세포의 삼투압 용해하여 수확 사채 : <ol><li> 완전히 매체를 대기음. </li><li> 멸균 0.4 ML을 추가하고 10 분 동안 서 보자. </li><li> 활발한 적어도 10 번 상하 pipetting하여 세포를 용해. 전송의 microfuge 튜브에 해물. </li><li> 1X 배속 SPG의 최종 농도 5 배 SPG 0.1 ㎖를 혼합한다. </li><li> 원유 해물 즉시 사용 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> 원유 EB의 플라크 50 μL은을 준비합니다D 5 아가 / DMEM에서 x 1시 10분 시리얼 희석은 재조합을 위해 선택할 수있는 적절한 항생제로 보충. (재조합의 선택에 대한 일반적인 항생제의 농도에 대한 표를 참조하십시오.) </li><li> 플라크 정화 상기 재조합 균주를 풍부. 원하는 표현형의 존재 또는 부재에 대한 점수 재조합. 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 유전자형의 목적을 위해 DNAzol 치료 (다음 섹션 참조)에 의해 재조합 균주에서 DNA를 추출합니다. </li><li> 십자가는 더욱 돌연변이를 분리하고, isogenic 변종을 생성하는 다른 항생제 내성 마커가 부착 된 균주 반복 ​​할 수 있습니다. 다른 항생제 마커가 부착 된 다른 야생형 균주에 선택한 재조합을 공동 감염. </li></ol> 표 1 : 재조합의 선택을위한 항생제 농도 : <table border="1"><tbody><tr><th> 최종 농도 </th><th> 준비 지침 </th></tr><tr><td> 200 NG / ML 리팜핀 </td&gt; <td> 25 ㎎ / 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 ML 저장 재고를 확인합니다. H 2 O와 스토리지 주식을 희석하여 200 ㎍ / ㎖ 작업 솔루션을 만들 어둠 속에서 -20 ° C에서 보관. </td></tr><tr><td> 200 ㎍ / ㎖의 메소 </td><td> DMSO에 100 밀리그램 / ML 주식을합니다. -20 ° C에서 보관 </td></tr><tr><td> 200 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신 </td><td> 100 μL 분주 물에 100 밀리그램 / ML 주식을합니다. -20 ° C.에 저장 반복되는 동결 융해를 피할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table> 5. 유전자형에 대한 재조합 균주의 게놈 DNA의 추출 참고 : 열 기반의 정화 키트도 사용할 수 있습니다. DNAzol 처리에 의한 DNA 추출의 장점은 비용입니다. <ol><li> 12 잘 접시에 성장 베로 세포의 단일 층에 1.2 × 10 5 chlamydiae를 감염. </li><li> 36-48 HPI에서 매체를 대기음 DNAzol (Invitrogen 사 10503-027)의 0.375 ML을 추가합니다. 부드럽게 세포와 피펫 리사를 교반1.5 ML의의 microfuge 튜브에 TES. </li><li> 100 % 에탄올 0.188 mL를 첨가하여 침전 DNA. 반전으로 섞는다. </li><li> 피펫 팁과 스풀링하여 DNA를 추출하고 깨끗한 튜브에 넣습니다. 또한, 펠릿 2 실온에서 분, 4 ° C, 그리고 가만히 따르다 뜨는을위한 최고 속도로 원심 분리하여 DNA. </li><li> 세척 DNA는 75 % 에탄올 1.0 ML로 두 번 침전. </li><li> 15 초 동안 에탄올을 제거한 후 공기 건조 DNA. </li><li> 0.2 ML 8 개 MM NaOH를 다음 0.1 M의 HEPES의 20.2 μL로 pH를 8.0으로 중화와 DNA를 용해. 물이나 TE로 0.5 ML의 최종 볼륨에 불러옵니다. 또는, TE 버퍼를 Resuspend의 DNA가 (DNA 침전물이 완전히 용해되지 않습니다.). </li><li> 확인 된 돌연변이를 측면에서는 300 ~ 500 bp의 영역의 PCR 증폭을위한 템플릿으로 DNAzol - 추출 된 DNA를 사용합니다. 순서는 정제 또는 생어 시퀀싱에 의해 (1시 20분) PCR 제품을 희석. </li></ol>

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M., Melian, A., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+by+UvrABC+excinuclease+is+a+step+in+the+path+to+mutagenesis+by+psoralen+crosslinks+in+Escherichia+coli.">Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis,+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).</li></ol>

공개 할 아무것도 없다.

이 유전자형과 표현형 사이의 연계를 설정으로이 방법은 유전자 분석을위한 기본 요구 사항을 충족합니다. 중요한 것은,이 재조합 DNA의 변화와 종종 비 모델 미생물의 유전자 기능의 분석 속도 제한 단계는 박테리아 유전자의 insertional 비활성화에 대한 기존의 분자 도구의 도움없이 달성된다. 하나의 중요한 단계는 패 정제 된 돌연변이 체의 클론을 보장하는 것입니다. 야생...

관련과 미국에서 연간 약 280 만 생식기 감염 (질병 통제 센터) 후유증과 같은 골반 염증성 질환, 자궁외 임신, 불임 (1)에 대한 의무 세포 내 세균 클라미디아의 trachomatis 계정. 클라미디아 균은 고유 한이 전염성하지만 비 복제 초등학교 바디 (EB) 및 비 감염성하지만, 증식하는 그물 몸 (RB) : 두 가지 형태로 구성된 이상성 개발주기 생리학. 감염 endoctyotosis (2) 다음 상피 세포에 사채의 첨부 파일이 시작됩니다. 막 바인딩 공포는 포함을라고 이내에 교환 사채는 이진 핵분열에 의해 복제 RB 형태로 분화. 중반 사이클에서, RBS 전환 당시 감염의 새로운 라운드를 시작하기 위해 세포 공간으로 추방 사채,에 때 숙주 세포 lyses (3). C. trachomatis에 있습니다이러한 세균 유전학 대부분의 연구 중심되었습니다 타겟 유전자 교체, 트랜스포존과 transducing에 파지, 표준 분자 유전 학적 도구와 일상적인 조작에 내화물, 그것은 개인의 클라미디아 유전자가 타고난 면역 회피에 기여하는 정도 불분명하다 , 영양소 수집, 개발 전환, 또는 진핵 호스트 (4) 내 병원체의 생존에 중요한 다른 프로세스. 따라서이 병원체는 임상 적 중요성에도 불구하고 저조한 특징 남아있다. 클라미디아 균의 게놈. 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 염기 서열 여러 종 biovars와 (5) (~ 1MB의) 상대적으로 작은 수 있습니다. WGS하여 비교 게놈 분석은 독성 요인의 잠재적 기능 (9, 10)에 관해서 몇 가지 정보를 제공하고 있습니다 클라미디아 종과 인간 (6-8)에 어느 정도에 그들의 적응의 진화에 독특한 통찰력을 제공하고 있습니다. 티임상 분리하여 표시 그는 유전 적 다양성은 유전자의 돌연변이가 쉽게에 대한 선택했을 아마도 때문에, 체계적으로 대부분의 독성 요소의 기능을 매핑하는 데 필요한 해상도를 제공하지 않습니다. 독성의 측정 결함, 조사 할 수있는 돌연변이의 스펙트럼을 확장 할 수있는 정의 된 분석과 함께 자연 선택, 돌연변이 유발 유전자 변이의 혼란 함을 주죠 효과없이. 화학 돌연변이는 특히 그들이 널, 조건, hypomorphic (감소 함수)를 생성 할 수 있습니다으로 유용하고, hypermorphic (함수의 이득) 대립 유전자이다. 강력한 차세대 게놈 시퀀싱 기술의 도착과 함께, 이러한 돌연변이 쉽게 식별 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 강한 협회는 앞으로 유전자 접근 방식의 적용을 가능하게하는 유전자 또는 유전 경로의 변이와 일반적인 표현형 사이에 만들 수 있습니다. 임상 균주의 게놈 시퀀스 모자이 B 밝혀etween의 혈청 형과 자주 재조합 (11)의 궤적. 재조합 경험적 증거는 두 계통에서 유전 적 기여 (12, 13)을 가지고 계시 이중 저항 재조합 자손의 두 가지 항생제 내성과 선택의 공동 감염을 통해 증명되었다. 따라서, 공동 감염 설정 야생형과 돌연변이 균주 간의 유전 적 교환은 화학적으로 유도 된 돌연변이의 분리가 관찰 된 표현형에 이르게 영향을받는 유전자를 찾아 낼 수 있습니다. 여기에서 우리는 화학 돌연변이, WGS, 감염된 세포 내에서 DNA 교환 (14) (그림 1)에 대한 시스템을 기반으로 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl methanesulfonate (EMS) </td><td>Sigma</td><td>M0880</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexamide</td><td>Sigma</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin </td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and 0.901 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (PBS+MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water (sterile, tissue culture grade)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids (NEAA) </td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td><td>Lonzo</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>Genomic DNA purification kits</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Life Technologies</td><td>10503-027</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mM NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-well tissue culture plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemical safety hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological safety hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&gt;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&gt;Dissection microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer (Qubit)</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

클라미디아의 trachomatis, 성병 및 안구 감염의 병인 에이전트, 재조합 DNA와 가난 때문에 실험 변환에 해당 다루기 힘듦을 특징으로 남아있다. 우리는 C에서 유전자 분석을 수행 할 수있는 방법을 개발 분자 유전 학적 도구의 부족에도 불구의 trachomatis. 우리의 방법이 포함됩니다 : I)를 빠르게 별개의 표현형과 유전 정의 된 돌연변이의 포괄적 인 라이브러리를 생성하는 화학 돌연변이, ii)에서 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)가 기본 유전 병변을지도하고 변이 유전자 (들) 사이의 연결을 발견하고.. 일반적인 표현형;. 돌연변이 야생형 박테리아와 포유 동물 세포의 공동 감염을 통해 재조합 균주의 III는) 생성. 따라서, 우리는 유전자형과 표현형 사이의 인과 관계를 확립 할 수 있었다. 화학적으로 유도 된 유전자 변이와 WGS의 결합은 상호 유전자형 - 표현형 협회에게 우리말을 설정하려면LD는 유전자 분석에 현재 어려운 의학 및 환경 중요한 미생물의 큰 목록에 광범위하게 적용합니다.

돌연변이에 노출 세균 세포의 죽음으로 인해 아마도, 세균없는 표시 함유로 연결됩니다. 일반적으로 혈청 형 LGV-L2 완전히 48 시간 게시물 감염에서 감염 세포를 용해되지만, 돌연변이와 치료&gt; 90 시간이 사이클을 확장 할 수 있습니다. 흠의 약 10 %를 회복 할 것으로 예상된다. 우리의 실험에서, 감염 베로 세포 치료 컨트롤에 비해 전염성 자손의 회복에 99 % 감소했다 20 MG / ML EMS로 처리. 돌연변이 ?...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다.

앞으로 유전 접근<em&gt; 클라미디아의 trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K 조회수.  Duke University Medical Center.  우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다. 

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High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

연구

유전학

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient clearance or persistence of the pathogens may lead to ascending infections of the upper genital tract and are supposed to cause chronic inflammatory damage to infected tissues 1,2. As a consequence, severe clinical sequelae like pelvic inflammatory disease (PID), tubal occlusion and infertility may occur 3,4. 
Most of the research with C. trachomatis has been conducted in epithelial cell lines (e.g. HEp-2 cells and HeLa-229) or in mice. However, as with cell- culture based models, they do neither reflect the physiology of native tissue nor the pathophysiology of C. trachomatis genital tract infections in vivo 5. Further limitations are given by the fact that central signaling cascades (e.g. IFN-&gamma; mediated JAK/STAT signaling pathway) that control intracellular chlamydial growth fundamentally differ between mice and humans 6,7. We and others therefore established a whole organ fallopian tube model to investigate direct interactions between C. trachomatis and human fallopian tube cells ex vivo 8,9.
For this purpose, human fallopian tubes from women undergoing hysterectomy were collected and infected with C. trachomatis serovar D. Within 24 h post infection, specimen where analyzed using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) to detect Chlamydia trachomatis mediated epithelial damage as well as C. trachomatis inclusion formation in the fallopian tissue.

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

We describe an ex vivo infection model for visualisation of direct interactions from bacterial pathogens with human fallopian tube cells. The whole organ tissue model was established to investigate C. trachomatis induced pathology to the female fallopian tube under "life-like" conditions.

조사를위한 인적 나팔관 모델<em&gt; C. trachomatis</em&gt; 감염

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

의학

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

면역학 및 감염병학

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard manufacturing. To achieve an effective protein-based subunit vaccine, the protein antigen often needs to adopt a native-like conformation. This is particularly important for pathogen-surface antigens that are membrane-bound proteins. Cell-free methods have been successfully used to produce correctly folded functional membrane protein through the co-translation of nanolipoprotein particles (NLPs), commonly known as nanodiscs. 
This strategy can be used to produce subunit vaccines consisting of membrane proteins in a lipid-bound environment. However, cell-free protein production is often limited to small scale (&lt;1 mL). The amount of protein produced in small-scale production runs is usually sufficient for biochemical and biophysical studies. However, the cell-free process needs to be scaled up, optimized, and carefully tested to obtain enough protein for vaccine studies in animal models. Other processes involved in vaccine production, such as purification, adjuvant addition, and lyophilization, need to be optimized in parallel. This paper reports the development of a scaled-up protocol to express, purify, and formulate a membrane-bound protein subunit vaccine. 
Scaled-up cell-free reactions require optimization of plasmid concentrations and ratios when using multiple plasmid expression vectors, lipid selection, and adjuvant addition for high-level production of formulated nanolipoprotein particles. The method is demonstrated here with the expression of a chlamydial major outer membrane protein (MOMP) but may be widely applied to other membrane protein antigens. Antigen effectiveness can be evaluated in vivo through immunization studies to measure antibody production, as demonstrated here.

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

This protocol describes using commercial, cell-free protein expression kits to produce membrane proteins supported in nanodisc that can be used as antigens in subunit vaccines.

앞으로 유전 접근

요약

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