著者は、このプロトコルの開発に彼らの助けのための再生医療ウェイクフォレスト大学に感謝します。我々はグレートオーモンドストリート病院慈善財団エウジェニオリッタ（スイス·ジュネーブ）、医学研究評議会、英国の外科医のロイヤルカレッジ、スパークス小児医療チャリティー、英国英国外務省/からの補助金によって支援を認める米国は、Cellコラボレーション賞、ミタル研究基金幹。また、母子保健研究所で小児外科部門の得られた組織工学研究室の改修助成金のために王立協会/ウォルフソン財団に感謝したいと思います。 PDCとSEがグレートオーモンドストリート病院子供チャリティでサポートされています。

1。ラット腸のアイソレーション<ol><li> 1％の抗生物質/抗真菌剤（シグマ、英国）（PBS / AA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（Sigma社、英国）の1 Lの溶液を調製する。 2チューブを蠕動ポンプ（マスターフレックスL / S可変速度）を取り付け。さらに15分間、PBS / AAに続く最高速度で15分間の蠕動ポンプの管を通って70％エタノール（エタノール）を実行します。 </li><li> （英国では、動物の下に内務省ガイドライン（科学的処置）法1986）地元の動物、ガイドラインおよび承認に従って、CO 2吸入と頸椎脱臼により約250〜350グラムの成体SDラットを安楽死させる。 </li><li>使用前に手術器具をオートクレーブ。 70％エタノールを用いた動物の腹部にスプレーして拭く。 </li><li>明確な手術野を確保するために、腹部にxifo恥骨開腹切開を行う。 </li><li> 70％エタノールを噴霧し、ペーパータオルの上に動物の右側に小腸に骨抜き。ターク細胞外マトリックス（ECM）の組織変性の脱水を避けるように連続的にPBS / AAで腸を濡らす電子医療。 </li><li>腸に向けた大動脈から90°の角度で発生する上腸間膜動脈（SMA）の位置を確認します。大動脈からのSMAに入り、すぐに血管の壁を引き裂く回避するために、針を撤回する27のGカニューレを使用してください。 SMAにカニューレのプラスチックチューブを進め、縫合糸（ビクリル5/0）を使用して固定します。 </li><li> PBS / AAの1ミリリットルを注入することによって、カニューレ挿入を確認してください。カニューレを解除するように、SMAに大動脈近位および遠位を切開する春のはさみを使用してください。 </li><li>大腸を切開するときに糞便の漏れを回避するために、S状結腸の遠位端に回盲接合部と1つの近位端の上の一（シルク5/0）縫合糸の結び目を配置する。その後、2ノット間の端子回腸および結腸をカットし、大腸を取り外します。 </li><li>空腸、十二指腸接合部Aで腸をカットNDそれは腹部と持っている可能性のある結合組織の接続から腸を解放。 </li><li> PBS / AAをペトリ皿に小腸を転送します。プラスチック製パスツールピペット（LSL研究所消耗品）で、腸の近位部分にカニューレを挿入し、縫合糸で固定します。それは60ミリリットルの注射器のルアーロック（BD Plastipak）が収まるようにピペットを切った。腸管腔は糞やゴミを除去するために、PBS / AAの60ミリリットルで2回洗浄します。 </li></ol> 2。脱細胞化方法論<ol><li>三方活栓に血管カニューレを接続します。これは、取り扱いを容易にする血管樹上の張力を最小にし、チュービングからの気泡の除去を可能にする。 </li><li> 0.6ミリリットル/時間でマスターフレックスL / S可変速度ローラーポンプを通して脱イオン水（抵抗率18.2MΩ/ cm）の実行を開始します。気泡が前に腸管腔コックを接続するチューブ内に存在しないことを確認してください。いくつかの気泡がステップからのルーメン内に存在してもよい1.9、脱細胞化プロセスを損なう可能性がある。ポンプの速度を変化させ、先端から気泡出口を確保するために慎重にピンセットで組織を処理します。高速が血管ツリーを破損する恐れがありので、このプロセスが終了するまで、血管にカニューレを接続しないでください。 </li><li>脱細胞化の次の工程は4℃で行われるため、低温室に装置を転送する低温は、組織の分解を最小限に抑えながら細胞の除去を可能にする。あふれソリューションを収集する容器にペトリ皿を置きます。 0.6ミリリットル/時で24時間、腸管腔、脱イオン水で血管樹（抵抗率18.2MΩ/ cm）で両方を灌流。最初の1時間は、すべての接続が安全であることを確認するため、定期的に装置をチェックし、漏れが最小であり、気泡は、腸内に存在しない。 </li><li>脱イオン水を用いた治療の24時間後、残りのステップであるように、冷蔵室の外に脱細胞化装置を移動室温（RT）で行う。 </li><li>脱イオン水中の4％溶液300mlを調製するためにデオキシコール酸ナトリウム（Sigma社製、UK）を秤量する。それは経口及び眼刺激性であるように、吸引フード下デオキシコール酸ナトリウムを秤量する。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合します。溶液は1ヶ月まで4℃で維持することができる。 </li><li>デオキシコール酸ナトリウムを純水解決策を変更し、接続を確認し、任意の気泡を除去し、0.6ミリリットル/ 4時間時間で灌流。 </li><li>デオキシコール酸ナトリウムおよびDNase-Iとの相互作用を避けるために、30分間、PBS / AAとのデオキシコール酸ナトリウムの段階の洗浄に続いて。 </li><li>デオキシ-I（DNアーゼI、Sigma）を秤量し、1M塩化ナトリウム、pH7.4中2000 KU液250ミリリットルを用意。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混合します。このソリューションは、使用直前に調製する必要があり、保存することができません。 </li><li> 0.6ミリリットル/時の速度で、室温で3時間、DNアーゼIで灌流。 </li><li> DNアーゼ-I工程に続いて、転送組織培養フードに足場や皿や楽器を変更してください。これは、無菌操作を使用することが提案されている。 </li><li>脱細胞化ソリューションのすべての残党が削除されるように30分間、PBS / AAで洗浄する。新しいシャーレに足場を置き、UV架橋剤（Spectroline、米国）に転送。 2滅菌サイクルを実行します。 3日ごとに5％のPBS / AAに格納し、ソリューションを変更します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction:+an+observational+study.">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li><li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue.">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li><li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+a+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li><li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. 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Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa.">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li><li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding.">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li><li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine.">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li><li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+matrices,+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method,+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells.">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li><li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li><li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+lung+engineering.">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).</li><li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration.">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li><li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

この実験のセットアップで最も困難なステップは、SMAのカニューレ挿入し、無菌性の確立と維持を必要とする。壁を破壊することなく、げっ歯類ではSMAにカニューレを挿入することにより、容器のサイズと位置に非常に困難な場合があります。代替的に、縫合糸は、SMAにプラスチックカニューレを導く、遠位大動脈自体のカニューレ挿入に続いて、前のSMA原点を近位大動脈の周りに配置されてもよい。脱細胞化中に乏しいカニューレの配置と高流量の組合せは、血管アクセスを失うことを生じ得る。無菌性は、小腸に存在する細菌叢の量に起因する大きな課題となっている。収穫後、PBS / AAで洗浄することは非常に重要であり、糞便や破片の兆候は、内腔から除去されなければならない。無菌性が達成された場合には、UV殺菌、次のインキュベーターにDMEMでファルコンチューブ内の足場の一部を配置する指標である必要があります。際に細菌のコロニー形成のため、メディアはその色が赤から黄色に回しでpHが変化します。これに対処するため、他のUVサイクルが助言だけでなく、PBSで洗浄は抗生物質/抗真菌剤を高濃度に含有している。 血管および静脈アクセスの両方に足場を得ることが可能変更は下大静脈（IVC）と同様に、SMAにカニューレを挿入することであろう。静脈および血管の側から脱細胞化は、すべての3つの解決策を断続的に試みるべきである。連続的な脱細胞化は、両側の正の圧力を有することによって毛細管を破裂することがある。 長年にわたり、in vitroおよびin vivo 6,9,12 に異なる細胞足場の組み合わせを使用して、腸のTEの取り組みの数があった。仕事の大部分はI型コラーゲンでコーティングした管状6,7,13,22不織布95％PGA-5％PLGA足場材を用いて行われた。腸では、次の種まき上皮オルガノイド単位（OU）およびマウスの大網への移植の期間、彼らはその後tubularizedすることができ、内側に外側上皮に対する筋肉に嚢胞を形成している。しかし、これらの足場の設計において、多孔性とシンプルさは、このようなバイオリアクターのいるようなインビトロ環境における人工腸の大部分を生成するために許可していません。さらに、さらに、受信者に接続することができ先天的血管網の欠如は、臨床、翻訳のために、この足場の使用を制限する。 PGA-PLGA足場を用いた実験に加えて、他のグループは、腸管の複雑さを複製しない、どちらもコラーゲンやSIS足場を、使用している。 SISは、特に腸組織工学の唯一の以前公開された方法論であり、機械的安定性を提供し、リードしながら、細胞増殖を促進するための脱細胞化スカフォールドの能力を実証し、150以上の医療現場で使用されている無免疫原性応答にING。しかし、適切なマクロとマイクロアーキテクチャの欠如は、腸のTE目的9-11,23のための「使用中悪い結果につながっている。 我々が説明した脱細胞化手法の利点は、腸の幹細胞ニッチで再増殖のための適切な環境を表すような管腔陰窩 - 絨毛アーキテクチャとして微視的特性の保存が含まれる。巨視的局面では、階層的な血管網の存在はTE-21腸の全ての層に栄養と酸素の供給を可能にし、受信者に添付ファイルを有効にします。しかも、コラーゲン、エラスチンおよびglyocosaminoglycansなどのECM成分のメンテナンスは、機械的特性だけでなく、細胞増殖および分化を導くだけでなく、重要な役割を有している。最も重要なことは、脱細胞化方法論の能力は、大規模にスケールアップする同じ特性を維持しながらr個の組織はTEの臨床的翻訳のために重要な特徴である。 血管網との自然な腸のマトリックスの開発は、ホストに接続することができ、人工腸の大きなセグメントを作成することができます。

組織工学（TE）は免疫抑制および臓器不足の問題をバイパスして、臓器移植への治療選択肢を提供します。 TEは最近、両方の大人3,4と子供5に、例えば膀胱1、尿道2、気管などの臓器に代えて、クリニックに成功したアプリケーションを持っていた。 組織工学臓器を構築することは、適切な細胞と足場の組み合わせを必要とする。足場は、天然由来（ 例えば、コラーゲン）を用いて調製及び合成（ 例えば、ポリ-L-グリコール酸、PLGA）することができる材料、または天然の器官および組織の脱細胞化することにより得られる。腸TEのためにこれまで使用されている足場は、主に6-13（ポリ-L-グリコール酸およびポリ乳酸）脱細胞化（小腸粘膜下組織）または合成のいずれかであった。これらの生体材料は、マクロおよびマイクロアーキテクチャの両方で非常に単純である組織工学、腸が臨床的に翻訳される場合には理想的ではないかもしれません。腸に最適な生体材料は、を支援するために、腸壁の層と腔側に絨毛-クリプト軸を反映するために、ホストの血液供給に接続することができ先天的血管樹、異なる特性を持つ階層型管状の壁を持っている必要があります上皮幹細胞による再増殖。 脱細胞化は、元のアーキテクチャ14を維持しながら、全体の器官から細胞を除去することによって足場を生成する新規な方法論である。これは、臓器の構造を複製するだけでなく、細胞外マトリックス（ECM）を助ける細胞増殖および分化の中に埋め込まれた化学的手がかりを含まないだけでなく、足場は既に、既存のが好ましい。 2008年に死体気管に、患者自身の細胞を播種し、14を脱細胞化し、若者にメイン左気管支を置き換えるために移植した<sup&gt; 3。それ以来、グループの数は、大小の動物の心臓15、肝臓16,17、および肺18〜20のための脱細胞足場の生産を報告している。 我々はまた、小腸脱細胞足場21を生成するために、同じ方法論を適応している。本明細書に記載された方法の目的は、このような血液供給、元の組織、ならびに腸管腔における陰窩 - 絨毛軸の微視的構造の巨視的特性を維持脱細胞化された腸の行列を生成することである。我々は、この方法論は、最終的に脱細胞化の効率を改善する他の器官のために採用することができると考えている。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

成功した組織工学は、in vitroまたはin vivoで適切な細胞を有する足場の組合せを含む。足場は、合成または天然由来の組織/器官に由来することができる。後者は、脱細胞化と呼ばれる技術を用いて得られる。脱細胞化は、物理的、化学的、および酵素的方法の組合せを含み得る。この技術の目的は元の組織のマクロおよびマイクロアーキテクチャを維持しながら、すべての細胞の痕跡を除去することである。 腸組織工学はこれまでネイティブ臓器の複雑なアーキテクチャを複製しない比較的単純な足場を使用しています。この論文の焦点は、ラット小腸のための効率的な脱細胞化技術を説明することである。小腸の単離血管の接続の維持を確実にするように記載されている。ウコン細胞を除去する化学的および酵素的ソリューションの組み合わせ足場の管面に絨毛-クリプト軸を維持し、STも着手している。最後に、適切な特性のために製造足場の評価が議論されている。

成功した脱細胞（ 図1）されると、足場は、天然の腸のいずれかのような巨視的な外観を持っているはずですが、半透明の壁（ 図2A）で。マクロアーキテクチャの保存は、血管ツリーの開通によって明らかである。染料はSMAカニューレを介して注入される場合には、足場全体に均等に分散し、毛細管ツリー（ 図2B）に達するべきである。足場は、核と細胞質材料、DNA定量キットと簡単な組織学的分析を用いて評価することができるものがあってはならない。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（H＆E）は、小腸層（ 図3A）を維持しながら、核と細胞質の物質が存在しないことを証明する必要があります。具体的には、内腔側に絨毛および陰窩の維持は、走査型電子顕微鏡（ 図4）は、次のは明らかである。 A例えば、コラーゲン、エラスチンおよびグリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分の保全も予想されるべきである。例えば、マッソントリクローム染色は、足場（ 図3B）にそのまま結合組織が ​​表示されます。 <img alt="図1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> 図1。実験計画脱細胞化手続きのタイムライン、PBS / AA：抗生物質-抗真菌を含むリン酸緩衝生理食塩水、NaDeoxy：デオキシコール酸ナトリウム、RT：室温、DNアーゼI：デオキシ-I <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> 図2。足場macroscopiC特性で落札脱細胞（A）後のラット小腸の肉眼的外観。ロッソポンソーSMAを通して染料の注入は、完全な血管網（B）を示しています。SMA：上腸間膜動脈は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> 図3。 。組織学H＆E（A）とMT（B）の染色は、結合組織構造の維持と細胞物質が存在しないことを示し、H＆E：ヘマトキシリンおよびエオシン、モンタナ：マッソンの三重。スケールバー：100μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 </P&gt; <img alt="図4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> 図4。 。電子顕微鏡走査電子顕微鏡は、足場内腔に保存絨毛-クリプトアーキテクチャを示し、スケールバー：100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

記事では、ラットの腸から無細胞マトリックスを製造するための方法論を説明します。腸の足場の導出は、細胞生物学および薬物検査幹、組織工学における将来の用途のために重要である。

ナチュラル無細胞腸基質の産生のための脱細胞化の方法論

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K ビュー.  University College London. 記事では、ラットの腸から無細胞マトリックスを製造するための方法論を説明します。腸の足場の導出は、細胞生物学および薬物検査幹、組織工学における将来の用途のために重要である。 

ビデオ: A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

生物工学

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

逆方向に加圧ポーチ内全体の人間の心の decellularization

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

分離と全体ブタ膵臓の Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲルを製造

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

コンビナトリアルプラグ製造のためのマイクロ流体デバイスの構築

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

著者スポットライト:Precision Oncologyにおける計算アプローチと実験的アプローチの統合

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

コンビナトリアルプラグ製造のための二層マイクロ流体デバイス

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...