この方法は、心臓の異なる生理学的および発達段階における細胞外マトリックスの影響に関する心血管分野の重要な質問に対処するのに役立つ。この技術の主な利点は、両方のタイプの組織に同様の脱細胞化法を適用することによって、胎児と成体細胞外マトリックスの比較分析を可能にすることである。したがって、この方法は、異なる文脈で細胞外マトリックスの研究を促進する癌患者からの外科的切除などの他の器官に適用され成功している。
まず、氷冷PBSで胎児と成人のマウスの心臓をすすぐ。その後、組織を解剖顕微鏡の下に置き、まっすぐ小さなはさみを使用して、大人のマウスの心臓から心房、右心室、およびセプタを取り除きます。左心室を新しいペトリ皿に移し、左心室の自由な壁を2ミリメートルの厚い縦方向のストリップに分けます。
一貫した脱細胞化効率のためには、同種サイズの成体マウス左心室外植を使用することが不可欠である。2 x 2ミリメートルのグリッドを使用してストリップをさらに小さな組織断片にミンチする前に、湾曲した先端を持つメスと鋸歯状のピンセットを使用して乳頭筋を取り除きます。すべての組織がみじん切りにされたら、外植を覆うのに十分なPBSで作品を簡単にすすいだ。
そして、胎児の心臓と成人心臓組織の破片を、チューブ当たり最適な切断温度またはOCT化合物の250マイクロリットルを含む個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。次いで、乾燥氷で心臓組織サンプルを凍結し、マイナス80°Cで貯蔵するためにイコペンタンを冷却した。凍結保存組織を脱細胞化するには、凍結したサンプルを、外植体を完全に覆うのに十分なPBSを含むペトリ皿に入れます。
OCTが溶けた後、PBSの新しいペトリ皿にサンプルを水没させ、1回の洗浄ごとに60 RPMで10〜15分間シェーカーでサンプルを3回洗浄します。最後の洗浄の後、滅菌24ウェル組織培養プレートの各ウェルに働く低張性緩衝液を1ミリリットル加え、細かい鉗子を使用して各ウェルに1つの断片を移す。プレートを摂氏25度で18時間インキュベートし、165 RPMで165 RPMで1回のPBSを1回洗浄します。
最後の洗浄後、調製したばかりのドデシル硫酸ナトリウムまたはSDS溶液をそれぞれウェルに1ミリリットル加え、摂氏25度で24時間インキュベーションします。翌日、1回の洗浄ごとに1ミリリットルの低張着洗浄バッファーで3回の20分間の洗浄でサンプルをすすぐ後、37°Cで3時間のインキュベーションのために各ウェルに1ミリリットルのDNase処理溶液を添加します。インキュベーションの終わりに、脱細胞化されたサンプルはゼラチン様の一貫性を失うはずです。
その後、組織断片を1回のPBSで1ミリリットルで3回洗浄し、1回の洗浄につき20分間、室温と60RPMで1ミリリットルの新鮮なPBSで一晩洗浄します。細胞残骸を脱細胞化組織からの除去を評価するために、翌朝、室温で2.5〜3時間の間、1ウェルあたり0.03%のエオシン水溶液を補った、作りたての10%式中性バッファーの1ミリリットルでサンプルを修正する。インキュベーションの終わりに、サンプルを1つのPBSを1回の井戸で洗浄します。
そして、使い捨てビニール標本金型を使用して、製造業者の仕様に従って細胞化された断片を細胞化処理ゲルの細胞化に封入します。次に、カプセル化断片を埋め込みカセットを生検処理に移す。そしてエタノール、イソパラフィン性脂肪族炭化水素溶液および2つの56°Cのパラフィン出現で連続した30分のインキュベーションを通してパラフィン埋め込みのためのサンプルを処理する。
2番目のパラフィンが出現した後、サンプルをパラフィンブロックに取り付け、ミクロトームを使用して3マイクロメートルの厚いセクションを得る。次に、ヘマトキシリンとエオシンとマッソンのトリクロム染色を標準的なプロトコルに従って染色することにより、脱細胞化効率を検証します。一晩PBSを振盪して洗浄した後、調製したDPBSを500マイクロリットル加え、各足場にアンホテリシンB1%抗生物質溶液の1ミリリットル当たり2.5マイクログラムを添加する。
そして、摂氏4度で1〜7日間サンプルを保管してください。細胞を装着する前に、抗生物質を添加した500マイクロリットルの細胞基底培地にDPBS溶液を交換してください。そして、37°Cで1時間足場をインキュベートします。
インキュベーションの最後に、顕微鏡を使用して、足場あたり96ウェルプレートの1つのウェルの中央に4マイクロリットルのDPBSドロップを追加します。そして、薄いストレートピンセットを使用して、1つの脱細胞スキャフォールドを各ドロップの上部に移動させます。吸引によって余分なDPBSを取り除き、足場が折り畳まれたりしわが寄っていないか確認します。
足場が端で乾燥したら、各足場の上に関心のある細胞の単一の細胞懸濁液をゆっくりと座らせる。胚性18日目の脱細胞化組織は、非常に半透明な構造を特徴とし、一方、成体外植は半透明から白色の外観を示す。ヘマトキシリンとエオシンおよびマッソンのトリクホーム染色は、多孔質メッシュ存在により効率的な細胞除去を確認する。
核物質は、脱細胞化後、移植時に望ましくない炎症反応を引き起こさないようにするために不可欠な非操作組織と比較して約99.8%減少する。座った足場の中の細胞の生存率は、カルセイン染色によってインビトロ培養中に監視することができる。足場をまたぐ細胞の再集団化および分布の末端解析は、中央のバイオスキャフォールド部のこれらの代表的な画像で観察されるパラフィン処理の後に行うこともできます。
そこで、この技術は、胎児および成人マウスの心臓だけでなく、他の組織からの細胞外マトリックスの生理活性特性の探査における研究者のための道を開いた。
