このプロトコルは、細胞外マトリックスへのゲートウェイです。それは複雑で、その構造はサブミクロンスケールまでです。したがって、この方法の主な利点は、その構造的完全性を保持する細胞外マトリックスを得ることを可能にし、生化学的および解剖学的分析への道を開くことである。
手順を実証します, アレハンドロ・マヨルカ・ギラニ, ラファエル・ロイテンとマリア・ラファエバ, 現在私の研究室とクリス・マドセンにあり、私の研究室にいて、ルンド大学で仕事を続けました.まず、胸郭、腹部、安楽死マウスの背中をヘアクリッパーで剃ります。70%エタノールで除菌します。
その後、マウスをポリスチレントレイに固定し、4つの端の後肢と頭と尾を伸ばします。マイクロサージャスト顕微鏡の下に置きます。マヨストレートパターンはさみを使用して、下顎領域から下腹部に流れる皮切開を行い、胸壁と腹膜を露出させるために皮下に解剖する。
その後、微小手術ハサミを使用して、胸部壁の両側の6番目の肋間空間に沿って小胸筋と小胸筋を切断する。前の切開に沿って胸骨をまっすぐなパターンはさみで切ります。その後、長い軸に沿って胸骨を切断することによって、ステロトミーを完了します。
上昇し、ピン, 胸部壁の両側は、心肺複合体を露出させます.丸い先端のマイクロ鉗子を使用して、胸腺と周囲の脂肪組織を繊細に引き離すことによって脂肪組織を切除します。そして、マイクロハサミで食道をカットします。
鋭利なマイクロ鉗子で腕頭静脈と腕頭筋を分離する。次に、左共通の頸動脈と左鎖骨下動脈を下層組織から分離し、結紮および焼灼を促進する。マイクロニードルホルダーと鋭利なマイクロ鉗子と9つの縫合糸を使用して、腕頭蓋左一般的な頸動脈および左鎖骨下動脈の出現の上にステッチを配置し、腕頭蓋静脈を焼灼する。
マイクロハサミを使用して、靭帯を切開して入り口を開きます。気管に27ゲージのカテーテルを導入し、気管支が気管支に分岐するまで繊細に押し込み、気管支を乱さないのに注意してください。6つのO縫合を使用して、気管の周りに3つのステッチを置き、カテーテルを固定します。
12番目の胸椎の高さでマウスを切り離すと、下降する大動脈は脊椎に対して前方向に走り、脊椎と一緒にここで切り離す必要があります。逆行的に大動脈をカテーテルし、大動脈弧に到達するまでカテーテルを押す。縫合線を使用して、カテーテル先端の下5ミリメートルから始まる大オルタの周りに4つのステッチを置きます。
シリコンチューブと下部コネクタを使用して、マウスをポンプシステムに接続します。1分間に200マイクロリットルで脱イオン水を15分間浸透させます。その後、灌流剤を0.5%DOCに変え、脱イオン水で希釈し、一晩浸透する。
翌日、灌流剤を脱イオン水で希釈した0.1%SDSに変更し、8時間パーフューズします。その後、脱イオン水を24時間浸透させ、SDSとDOCを洗い流し、脱細胞化された心臓と肺を胸郭に分けて切除します。
滅菌性のクライオチューブに、1%ペニシリンストレプトマイシンと0.3ミクロモルナトリウムアジ化体を摂氏4度で除解水で保存します。免疫染色を行う場合は、サンプルを6%ロバ血清と3%BSAを含むクライオチューブに一晩インキュベートしてブロックします。その後、PBSで3%ロバ血清中の一次抗体で24時間インキュベートする。
インキュベーション後、PBSTで1回1時間、サンプルを5回洗浄します。PBSで蛍光結合二次抗体を3%ロバ血清で24時間インキュベートします。その後、PBSTでの使用を繰り返します。
イオン化水を加え、直接光から4°Cの角度でサンプルを保存します。サンプルを画像化するには、ガラス底皿に入れ、2つの液滴で保存液を加湿します。目的を設定し、蛍光灯を用いてサンプルを検査します。
コンピュータ制御に切り替え、レーザーをオンにし、レーザー強度、ピンホール開口、検出器の波長、ゲイン、解像度、ズームを調整します。Z スタックの数とステップ サイズを設定し、取得を開始します。安楽死させたマウスから1つの肺葉を物品切りし、10%10で5ミリメートルのクライオ型に入れます。
約500マイルのOCT化合物で覆い、ドライアイスで凍らせます。その温度でサンプルを維持します。処理されたマウスから1つの脱細胞化された肺葉を物品物化し、最大の表面積を下にしたクライオ型に入れ、OCT化合物で覆います。
乾燥した氷の上にサンプルを凍結し、必要な場合があるまでその温度でそれを維持します。サンプルは、少なくとも12週間保存することができます。凍結組織ブロックをマイナス20°Cの5マイクロメートルセクションに切り離すためにクライオスタットを使用してください。
そして、粘着ガラススライド上のセクションを配置します。スライドを空気乾燥するまで室温に移します。スライドをPBSに簡単に浸し、続いてPBSに4%パラホルムアルデヒドを15分間浸します。
PBSで1回洗浄し、その後、1回の洗浄につき5分間蒸留水で2回洗浄します。スライドをマイヤーのヘマトキシリン溶液に10分間浸します。次に、蒸留水を流しているコープランドの瓶でスライドを10分間洗い、エオシン溶液に7分間浸します。
キシレンに数回浸します。DPX取付媒体を数滴塗布し、ガラスカバースリップを入れます。スライドをそのままにして化学フードの下で一晩乾燥させ、スライドスキャナでスキャンします。
プロトコルを正常に完了した後、心臓と肺とNX組織は細胞から解放されます。脱細胞化は、ECM足場のヘマトキシリンエオシン染色によって検証することができる。足場は新鮮な器官の寸法を保持し、その不柔軟なECM構造はそのままである。
ECM足場は透過性および軽い浸透性を増加した。電動顕微鏡ステージでこのプロトコルを使用することで、サブミクロン分解能でマウントサンプル全体の3次元タイルイメージングが可能になります。完全な均一な脱細胞化を達成するためには、目的の器官に向かって流れを避ける必要があります。
微小外科的解剖および血管の結紮は有効でなければならない。同時に、ネイティブVCM構造を維持するためにターゲット組織を尊重します。この手順に従って、足場は構造ECMタンパク質のために濃縮され、質量分析または組織工学に使用することができます。
この技術は、細胞外マトリックスの高解像度マッピングへの道を開きます。
