スケーリングは発達システムの普遍的かつ基本的な属性の1つですが、基礎となるメカニズムは多くの臓器や組織では理解されていません。このビデオで紹介するゼブラフィッシュのサイズ縮小技術は、動的スケーリングプロセスの基礎となるメカニズムの理解を深めます。ゼブラフィッシュを操作する利点は、ライブイメージング、遺伝学、および定量分析を行うことが容易です。
当社の技術は、特殊な機器や集中的なトレーニングなしで適用することは非常に簡単です。胚の健康は、この技術の成功の鍵です。若い魚を親として使用し、コリューションを取り除くことによって損傷を最小限に抑えるように注意してください。
また、黄身の創傷の大きさで遊び、何個の細胞が取り除かれるかも分かります。私たちが使用する胚は非常に若く壊れやすいので、転送と切り刻み時には非常に慎重に取り扱う必要があります。同時に、開発の適切な時間枠で手順を実行できるように、高速である必要があります。
視覚的なデモンストレーションは、より小さな胚を効果的に生成する方法の良い感覚を与えることができます。胚の切り刻みのためのワイヤーループを作るために、ガラス毛細血管を通して長さ20センチメートルの硬く、非腐食性のステンレス鋼線を供給し、上部に小さな1ミリメートルの長さのループを作ります。明確なマニキュアの小さな液滴をクラス毛細血管の先端に置き、毛細管とワイヤーループの間に所定の位置に保持し、胚に損傷を与える可能性があるため、ループ部分にマニキュアを取得しないようにします。
そして、それを乾燥させます。ラボテープを使用して、ガラスの毛細管を木の箸にループに取り付け、工具の箸部分が後で水に浸かないように、約2.5センチメートルのガラスキャピラリーを箸の向こうに伸ばします。プラスチック製のヘラを使用した100ミリメートルガラスペトリ皿では、底部の中心付近に2%メチルセルロースの約0.5ミリリットルを薄く均等に約0.5ミリメートルの厚さに広げます。
約30ミリリットルのリンジャー溶液を皿の側面に注ぎ、残りの皿に広げ、メチルセルロースを覆います。以前に脱絨毛化した胚を256細胞の2%メチルセルロースの1つのK細胞ステージに置き、胚が側に向かっていることを確認する。ブラスラを切り刻むには、ワイヤーループを使用して動物の棒の近くで動物の植物軸に垂直に切断し、ブラストドラム細胞の約30〜40%を切り落とします。
その後、そっと一緒に端をタップして、残りのセルが戻ってくるのを助けます。黄身の場合は、取り付けられたワイヤーを使用して卵膜をニッキングして植生ポールの近くで小さな傷を作り、卵黄が数分間にじみ出し、治癒します。黄身がにじみ出なくなったら、ピペットを使って同じ皿の中で胚をメチルセルロースの外に移動させ、回復します。
すべての胚に対してブラスラと黄身のチョッピングを繰り返し、胚が回復する間、皿を30分間邪魔しません。次に、ガラスピペットを使用して、新鮮な3分の1のRingerの溶液を含む以前に調製された35ミリメートルのガラス皿に胚を移し、イメージングを続行する前に完全な回復を可能にするために28.5°Cインキュベーターに入れます。ブラスラと黄身で2段階の切り刻みを行った後、胚はサイズ差以外の対照胚と比較して、発達段階全体で一見正常な全体的形態を示した。
一方、ブラストラのみの切り刻まれた胚は、特に初期段階で独特の形態を示した。エピボリーの間に、胚は収縮し、インデントされた外観を有していた。以下のスマイト段階では、正中構造が多くの軸レベルで平坦化していることが判明した。
後の段階では、中脳や後脳などの黄身に隣接する体構造は、比較的大きな黄身からの緊張の増加に起因して、比較的平坦な形状を示した。スマイト形成のタイムラプスイメージングは、コントロールおよびチョップド胚の両方において、後の段階で形成されたスマイトのサイズが初期段階のものと比較して小さかることを示した。また、スマイト形成段階を通じて、切り刻まれた胚は対照的な胚のものよりも小さいスマイトを有していた。
2段階の切り刻み技術を膜mCherry注入胚に対して行った場合、受精後20時間での脊髄の画像化は、サイズ低下による神経管高の減少を示した。2ステップの切り刻みは、より小さいが、それ以外の場合は高効率で正常な胚を得るために非常に重要です。ブラストラから細胞を切り落としながら黄身をみじん切りにしないことを覚えておくことが重要です。
黄身の場合は、内容がにじみ出るように小さな傷を作ります。そして、黄身膜は適切な緩衝液で自然に治癒します。刻んだ胚は迅速に回収できるため、任意の方法または分析を正常胚に適用することができ、サイズ縮小方法に従って行うことができる。
この技術のシンプルさと汎用性は、誰もがゼブラフィッシュの任意の組織や臓器のスケーリングの問題を研究するためにこの技術を導入することができるように非常に強力です。私たちは、この技術を使用すると、研究者は以前に手つかずだった様々なシステムのスケーリングの問題に取り組むことができると信じています。我々はすでに、スマイトのスケーリングと神経管のパターニングにおいて重要な発見を行っています。
