私たちは、ヘルプと、これらのプロトコルを設定するために助言を博士カール·ハインツ·クラウスとヴィンセントジャケに感謝していて、また、それらの技術的なサポートのためにNCCR博士ナビンGopaldassのバイオイメージングプラットフォームからクリストフ·バウアーとジェローム若いアカシカの未発達の枝角に感謝します。研究は、スイス国立科学財団のProDoc助成金によってサポートされています。

1。可視化とファゴソーム内のROS生産の定性的測定 OBGコーティングしたビーズは、事前に準備する必要があります。ビーズコーティング手順および寒天オーバーレイ技術が公表された参考文献5,14から適応されます。 <ol><li> 1.5ミリリットルチューブに3.0ミクロンのカルボキシル化シリカビーズ（約1.8×10 9ビーズ）の1ミリリットル懸濁液を添加し、ビーズを迅速にスピンし、ボルテックスにより1mlのPBSで3回洗う。 </li><li> 25 mg / mlのシアナミドを含有する1mlのPBSでビーズを再懸濁し（共有結合前標識BSAに結合することがカルボキシル化シリカビーズを活性化するため）、15分間ホイール上でインキュベートする。 </li><li>ウォッシュクイックスピンカップリング緩衝液1ミリリットル（0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.0）で3倍（あるいはテーブルのフルスピードで遠心5秒トップのミニ遠心機や、テーブルトップ遠心機で1分間2000×gで遠心分離）し、過剰シアナミドを削除するためにボルテックス。 </li><li> C500μlで洗浄したビーズをミックスOxyBurstグリーン1mgの（OBG）H2HFF（ジヒドロ-2 &#39;、4,5,6,7,7&#39; - hexafluorofluorescein）-BSAを含むバッファをoupling、キャッピング前に、標準ガス缶から窒素ガスでチューブを記入し、暗闇の中で、室温で14時間（一晩）ホイール上に静置します。 </li><li>ビーズは（PBS中にグリシン250 mm）が素早く回転し、ボルテックスによりクエンチング緩衝液を除去するために、カップリング緩衝液で2回、未反応のOBGを削除し、バッファを消光1ミリリットルで2回洗う。 </li><li> BSAに結合させるためにアレクサフルオロ594スクシンイミジルエステル50μgのを含むカップリング緩衝液1ミリリットルを加える。キャッピング前に窒素でチューブを記入し、暗所で室温で1.5時間、ホイール上に静置します。 </li><li>ビーズが反応を停止させ、迅速にスピンし、ボルテックスによりバッファを消光1ミリリットルで3回洗浄し、ビーズは、迅速にスピンし、ボルテックスにより1mlのPBSで3回洗浄します。 </li><li>最後に、長期保存のためのVアジド/ wの10％の2μlのPBS 1mlにビーズを再懸濁する。 concentratioを測定血球計数器（通常は約1〜2×10 9ビーズ/ ml）で懸濁液中のビーズのnは、キャッピング前に窒素でチューブを記入し、暗闇の中で、4℃で保存する。 </li><li> OBGフルオレセインの塗着効率は、500nmでの励起を用いて発光スペクトルをチェックすることによって試験することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の存在下でH 2 O 2で酸化すると、酸化されたビーズの蛍光強度は、発光ピーク（538nmで）で、非酸化コーティングされたビーズのそれよりも11〜12倍高い。 </li><li>収穫は指数関数的に光学的に透明なプラスチックやガラス底で3センチディッシュ上の細胞の密度の異なるプレートと、一晩、それらを成長さを10cmシャーレから細胞性粘菌細胞を増殖させる。実験の約80％コンフルエントである料理を選択してください。 細胞性粘菌の細胞を培養するための詳細なプロトコルは、15を公表されている。 </li><li> LoFlo媒体（LF培地）で、培地を交換し、インキュベートHL5C培地の細胞外およびエンドソーム内の自家蛍光を低減するために、実験の前に2時間。 </li><li>並行して、10〜15待つ、約1mmの厚さの寒天層を形成するために、平坦面（×10cmの10cmの、すなわちガラス板）上に寒天を入れ、LF培地10mlに1.5％バクト寒天を溶かす分固化させる。後で使用するためのLF媒体が2cm×2センチメートルの正方形、所定の位置に寒天層をカット。 </li><li>一方、回転ディスクまたは広視野顕微鏡を用意し、22℃の環境室の温度を設定し、この実験に必要な設定を行います（議論の中で、追加のコメントを参照してください）​​。 </li><li>インキュベーションの2時間後に3 cmディッシュからLF培地を吸引するが、細胞単層は依然として媒体の薄膜によって覆われるべきである。 1.5×10 7ビーズ/ mlにコーティングされたビーズを希釈し、細胞層の上に10μlを加える。 </li><li> 1平方寒天シートを取り、余分な液体を排出ウェットキープ。そっと目を入れる細胞層の上にE寒天の正方形。それは、細胞の上に横たわっているとき寒天四角を移動しないでください。寒天重層することにより取り込みを改善する、ビーズと細胞との接触を増加させるために使用し、また、わずかに対物レンズの焦点面に良好それらを維持、細胞を圧縮する。 </li><li> 2時間以上毎に1分、皿にふたをする顕微鏡ステージ上に配置し、自動的に、赤、緑、位相チャンネルで写真を撮る。 </li><li>選択し、食作用の全体のプロセスが含まれている細胞事象に焦点を当てる。最適化された3チャンネルをマージし、専門的な画像処理ソフトを使ってムービーに写真を組み立てる。赤色および緑色チャネルにおいて選択された各ビーズの蛍光強度を定量化し、緑/赤の比は、細胞の動的ファゴソームROS産生を反映する。 </li></ol> 2。細胞内スーパーオキシド生産の定量的および中期スループット測定<ol><li> Oを収集NE 80％コンフルエントHL5C培地10ml中の細胞性粘菌の一品。 5分間850×gで遠心分離細胞性粘菌細胞は、慎重に、完全に余分なメディアを吸引除去する。 SS6.4バッファに再懸濁した細胞[ソレンセン·バッファ内の0.12のソルビトール（14.69のKH 2 PO 4および6.27のNa 2 HPO 4）、pHが6.4]、細胞をカウントし、6×10 6細胞/ mlの最終濃度に希釈する（議論の中で、追加のコメントを参照してください）​​。 </li><li> （議論の中で、追加のコメントを参照してください）​​白い不透明な96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液50μlを加える。 </li><li>必要に応じて、各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いへDHEストック（DMSO中30 mM）を希釈したDHEのSS6.4、ピペット50μlと500倍に希釈します。 DHEの最終濃度は30μmである。反応がすぐに開始されます。 </li><li>刺激または阻害剤は、特定のニーズに応じて、この時点で、または他の時点で添加することができる。 </li><li> 「トップリーディング＆＃エンドポイントを使用34、522 nm/605 nmでの蛍光励起/発光の蛍光マイクロプレートリーダーのモード、1時間、2分毎に読み取り、媒体振れ22℃で5秒/分</li></ol> 3。定量的および細胞外のH 2 O 2産生のハイスループット測定<ol><li> 2.1と2.2で説明したのと同じ手順に従ってください。 </li><li> SS6.4、渦の10ミリリットルに、HRPの株式の5μL（蒸留水に100 U / ml）を加えて希釈したHRPを準備したり、よく混ぜ、後で使用するために氷の上に維持するためにチューブを反転させる。希釈したHRP溶液は0.05 U / mlである。 </li><li>それぞれ、AURストック（DMSO中10 mMのAUR）および6.2510μMの最終濃度までSS6.4バッファに希釈したHRP溶液、および0.005 U / mlのを混合することにより、AUR反応液を調製する。例として、40の反応のための反応混合物を調製する希釈したHRPを400μlとAUR原液2.5μlのSS6.4の1600μLを混ぜる。 </li><li> AURミックス50μLを追加必要に応じて、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルにTURE。今反応が開始されます。 </li><li>刺激または阻害剤は、特定のニーズに応じて、この時点で、または他の時点で添加することができる。 </li><li> 530 nm/590 nmで蛍光励起/発光の蛍光マイクロプレートリーダーの終点「トップ読み」モードを使用し、22℃で、1時間、中ブレ5秒/分ごとに2分を読む</li></ol>

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	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

前述の方法に比べて、OBGアッセイは、動的に代えて、細胞の集団からの平均ROSシグナルを測定する、単一細胞レベルでファゴソームROS生成の過程を視覚化する。このような人口の平均化の方法は非同期食作用によって引き起こされる重要な情報を不明瞭にする傾向があります。我々が正常に細胞性粘菌にDHEとAURアッセイを適応とプロトコルを最適化した。最も重要なことは、我々はこ?...

活性酸素種（ROS）は、宿主防御、シグナル伝達、組織の発達および損傷に対する反応、ならびに高血圧症および癌などの生物学的プロセスの様々に関与している。よく研究ファゴソームNADPHオキシダーゼの機械は、好中球&#39;ファゴソーム1で摂取細菌を殺すために、酸化的バーストとして知られている急速なROS発生、に捧げられています。また、ミトコンドリア呼吸鎖の副産物としての電子の漏れが以前はROSの規制されていない元の原因であると考えられていた。しかし、最近では、マウスマクロファージ2中の細菌の死滅intraphagosomalに貢献する重要な機構として同定された。近年では、社会的なアメーバ、 細胞性粘菌は 、自然免疫応答の細胞本来のメカニズムを研究するための強力かつ人気の高いモデルとなっています。実際、 細胞性粘菌と人間の食細胞はmoleculaにおける保全の驚くほど高いレベルを共有細菌は、飲み込みを感知して、3,4を殺すための責任のR機械。このような、NADPHオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、などのROS産生や解毒に関わるタンパク質や酵素のホモログは、人間と細胞性粘菌の両方に記載されています。最もよく研究され、アメーバのように、 細胞性粘菌は、哺乳類のモデル系に比べていくつかのユニークな利点を提供します。それらは、8〜10時間の倍加時間で、CO 2を必要とせずに室温で成長する。それらは容易に付着または懸濁培養物として維持することができる。また、彼らの完全に配列決定し、注釈付きの半数体ゲノムに、かつ容易に遺伝子操作のおかげで、 細胞性粘菌は非常に魅力的な実験モデル生物となっています。 これまでの研究では、活性酸素による酸化後に蛍光を発する（総称OxyBurstグリーン、OBGとして知られている）フルオレセインの様々な塩素化およびフッ素化誘導体は、活性酸素のレポーターとして使用されてきた。細胞透過性EST細胞非透過性デキストラン又はタンパク質結合誘導体は、細胞外ROSを測定するために使用される一方erified誘導体は、細胞質のROSを測定するために使用される。特に、OBG BSA-コーティングされたビーズは、既に哺乳類細胞5ファゴソーム内ROS産生を検出するために使用されてきた。しかし、マイクロプレートリーダーベースのアプローチは、細胞の集団からの平均ROSの生成カーブを与えることができる。現在のプロトコルでは、 細胞性粘菌 、専門の食細胞、および最適化された実験条件を使用することにより、我々は、ビーズ上に任意のオプソニンを結合させることなく、安定的かつ効率的な食作用を得る。 DHEは、ROS産生6-9を検出するために、そのような哺乳動物好中球およびマクロファージなどの種々のモデル系において使用されている。一方、メソッド8,10の特異性と感度をある程度の論争があります。アンプレックスレッドの改良版として、AURの蛍光強度を測定することがより適してpHに対する感度が低い非中性または弱酸性的環境におけるROS。 AURは最近、いくつかの哺乳類系11,12が、非常に多くの場合、弱酸性増殖培地を必要とする非哺乳類モデルにおけるその使用に適用されている、まだ報告されていない。また、定量的かつ動的な社会アメーバ細胞性粘菌におけるROS産生および局在を測定するための公表プロトコルがありません。 プロトコルの提示組の目標は、様々なROS及びそれらの局在をモニタリングすることが容易で汎用性の高いソリューションを提供し、さらにROS関連の細胞機構への洞察を与えることである。 OBGアッセイのために、我々は、 細胞性粘菌細胞によるOBG被覆ビーズの取り込み後のファゴソームROS生成のプロセス全体を監視するために、ライブ顕微鏡を用いて、細菌のintraphagosomal死滅の機序を研究するための新しいアプローチを提供した。我々は、細胞内superoxを測定するために、 細胞性粘菌媒体スループットDHEとAURアッセイを最適化した強力なROS刺激剤としてLPSを使用して、それぞれIDEおよび細胞外のH 2 O 2の生産、、。 LPSが最近貪食細菌13に向けて細胞性粘菌の殺菌活性を増加させることが示されたことに注意してください。また、DEDTCおよびカタラーゼを用いた治療は、明示的にこれらの2つの方法を具体的に、異なる種類や細胞性粘菌におけるROSの細胞内局在を測定することを確認した。最後に、OBGアッセイは、さらに、動物細胞の食作用性受容体のリガンドでビーズをオプソニン化することにより、任意の接着性食細胞に適合させることができる。原則として、DHEおよびAURアッセイはまた、適切な実験条件下で任意の接着性または非接着性の細胞で測定用に微調整することができます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylated silica beads</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>ForMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyanamide</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ibidi &amp;mu;-Dish 35 mm, high</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Bottom made of optically clear plastic</td></tr><tr><td>MatTek dish 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Bottom made of a glass coverslip</td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>White 96 well plate</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

活性酸素種（ROS）のいずれかを動的に触媒的または自然に相互変換又は排除される反応性短命の、酸素含有分子の範囲を含む。最もによるROS及びそれらのソースおよび細胞内局在の多様性の短い寿命のために、全体像は、プロトコルの組み合わせを用いて注意深く測定することによって得ることができる。ここでは、OxyBurstグリーン（OBG）を使用して、三つの異なるプロトコルのセットをコーティングしたビーズ、またはジヒドロエチ（DHE）を提示し、アンプレックスUltraRed（AUR）は、定性的および定量的な細胞性粘菌などの専門食細胞内の様々な活性酸素を監視すること。我々は手順をコーティングビーズを最適化し、動的単一細胞レベルでintraphagosomal ROS生成を可視化するOBGコートビーズとライブ顕微鏡を使用していました。我々は、 大腸菌からリポ多糖（LPS）を同定細胞性粘菌におけるROS生成のための強力な刺激として大腸菌 。また、我々は、dはリアルタイム定量的にそれぞれ、細胞内および細胞外スーパーオキシドH 2 O 2産生を測定するためDHEとAURを用いて媒体スループットアッセイをeveloped。

ファゴソーム内ROSの発生を顕微鏡（ ファイルS1）により定性的にかつ動的に視覚化することができる。アレクサフルオロ594により放出された赤色の蛍光はpH非感受性であり、OBGの酸化はグリーンチャンネルでその蛍光を増加させながら、ファゴソーム環境では一定のまま。 インビトロでの発光スペクトルは、酸化されて非酸化OBG被覆ビーズは、酸化後の強度の有意な増加?...

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Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

我々は、定性的および定量的研究のための様々なアメーバおよび哺乳動物細胞モデルに適用することができる反応性酸素種（ROS）の測定のためのプロトコルのセットを適合。

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K ビュー.  University of Geneva. 我々は、定性的および定量的研究のための様々なアメーバおよび哺乳動物細胞モデルに適用することができる反応性酸素種（ROS）の測定のためのプロトコルのセットを適合。 

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

がん研究

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

がんの生産と活性酸素種の検出（ROS）

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

医学

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

生化学

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. Thiols are especially important for illuminating the redox status of cells via their reduced dithiol and oxidized disulfide ratios. Engineered cysteine-containing fluorescent proteins open a new era for redox-sensitive biosensors. One of them, redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP), can easily be introduced into cells with adenoviral transduction, allowing the redox status of subcellular compartments to be evaluated without disrupting cellular processes. Reduced cysteines and oxidized cystines of roGFP have excitation maxima at 488 nm and 405 nm, respectively, with emission at 525 nm. Assessing the ratios of these reduced and oxidized forms allows the convenient calculation of redox balance within the cell. In this method article, immortalized human triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231) were used to assess redox status within the living cell. The protocol steps include MDA-MB-231 cell line transduction with adenovirus to express cytosolic roGFP, treatment with H2O2, and assessment of cysteine and cystine ratio with both flow cytometry and fluorescence microscopy.

This protocol describes the assessment of subcellular compartment-specific redox status within the cell. A redox-sensitive fluorescent probe allows convenient ratiometric analysis in intact cells.

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

生物学

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

免疫・感染学

ジヒドロエチジウムを用いた肝臓がん細胞における新規ROS定量

High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS production plays a central role in the spatial and temporal modulation of normal cellular functions such as proliferation, signaling, apoptosis, and senescence. In contrast, chronic ROS overproduction is responsible for a wide spectrum of diseases, such as cancer, cardiovascular disease, and diabetes, among others. Quantifying ROS levels in an accurate and reproducible manner is thus essential to understanding normal cellular functionality. Fluorescence imaging-based methods to characterize intra-cellular ROS species is a common approach. Many of the imaging ROS protocols in the literature use 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) dye. However, this dye suffers from significant limitations in its usage and interpretability. The current protocol demonstrates the use of a dihydroethidium (DHE) fluorescent probe as an alternative method to quantify total ROS production in a high-throughput setting. The high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, was used to measure and quantify the ROS production. This study was conducted in three hepatocellular cancer cell lines - HepG2, JHH4, and HUH-7. This protocol provides an in-depth description of the various procedures involved in the assessment of ROS within the cells, including - preparation of DHE solution, incubation of cells with DHE solution, and measurement of DHE intensity necessary to characterize the ROS production. This protocol demonstrates that DHE fluorescent dye is a robust and reproducible choice to characterize intracellular ROS production in a high-throughput manner. High throughput approaches to measure ROS production are likely to be helpful in a variety of studies, such as toxicology, drug screening, and cancer biology.

著者スポットライト:肝細胞株における細胞内ROSレベルのハイスループット測定

This protocol describes a novel method to quantify intracellular reactive oxygen species (ROS) using dihydroethidium (DHE) as a fluorescence dye probe using a high-throughput screening approach. The protocol describes the methods for quantitative assessment of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the three different hepatocellular carcinoma cell lines.

ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価

Reactive oxygen species (ROS) play a key role in the regulation of cellular metabolism in physiological and pathological processes. Physiological ROS ...

生物工学

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the modification of proteins, lipids, and DNA, which finally may lead to alteration in cellular function and cell death. Therefore, it is beneficial for cells to increase their antioxidant defense in response to detrimental insults, either by activating an antioxidant pathway like Keap1/Nrf2 or by improving redox scavengers (vitamins A, C, and E, &#946;-carotene, and polyphenols, among others). Inflammation and oxidative stress are involved in the pathogenesis and progression of retinopathies, such as diabetic retinopathy (DR) and retinopathy of prematurity (ROP). Since M&#252;ller glial cells (MGCs) play a key role in the homeostasis of neural retinal tissue, they are considered an ideal model to study these cellular protective mechanisms. In this sense, quantifying ROS levels with a reproducible and simple method is essential to assess the contribution of pathways or molecules that participate in the antioxidant cell defense mechanism. In this article, we provide a complete description of the procedures required for the measurement of ROS with DCFH-DA probe and flow cytometry in MGCs. Key steps for flow cytometry data processing with the software are provided here, so the readers will be able to measure ROS levels (geometric means of FITC) and analyze fluorescence histograms. These tools are highly helpful to evaluate not only the increase in ROS after a cellular insult but also to study the antioxidant effect of certain molecules that can provide a protective effect on the cells.

Here, we propose a systematized, accessible, and reproducible protocol to detect cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in M&#252;ller glial cells (MGCs). This method quantifies total cellular ROS levels with a flow cytometer. This protocol is very easy to use, suitable, and reproducible.

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

要約

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遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

がんの生産と活性酸素種の検出（ROS）

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

血管のCaの可視化^{2 +}パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量

ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価

ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価

ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量