Biz yardım ve bu protokolleri kurmak tavsiye Dr Karl-Heinz Krause ve Vincent JAQUET müteşekkiriz, ve aynı zamanda teknik destek için NCCR bir Biyogörüntüleme Platformu ve Dr Navin Gopaldass Christoph Bauer ve Jérôme BOSSET teşekkür ederim. Araştırma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı bir ProDoc hibe ile desteklenmektedir.

1.. Görselleştirme ve Phagosomes ROS Üretim Niteliksel Ölçümü OBG-kaplı boncuklar önceden hazırlanmış olmalıdır. Boncuk kaplama prosedürleri ve ağar bindirme tekniği yayınlanmış kaynaklardan 5,14 uyarlanmıştır. <ol><li> Bir 1.5 ml tüp içine 3,0 um karboksillenmiş silis boncuklar (yaklaşık 1.8 x 10 9 boncuk) 1 ml süspansiyonu ekleyin, taneler hızlı bir dönüş ve vorteks ile 1 ml PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> 25 mg / ml siyanamit (BSA prelabeled kovalent bağlamak için karboksillenmiş silis boncuklar aktif hale getirmek için) ihtiva eden 1 ml PBS içinde yeniden süspanse boncuklar, 15 dakika boyunca bir tekerlek üzerinde inkübe edilir. </li><li> Birleştirme 1 ml tampon ile yıkayın 3x hızlı bir dönüş ile (0,1 M sodyum-borat, pH 8.0) (alternatif olarak 5 saniye boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde küçük tam hızda santrifüj ya da bir masa üstü santrifüjü içinde 1 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj) ve fazla siyanamid çıkarmak için karıştırın. </li><li> C 500 ul ile yıkandı, boncuk karıştırınOxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihidro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA 1 mg içeren tampon oupling, standart kapatma önce gaz-can nitrojen gazı ile tüp doldurmak ve karanlıkta, oda sıcaklığında 14 saat boyunca (gece boyunca) bir tekerlek üzerinde inkübe edilir. </li><li> Boncuklar (PBS içerisinde 250 mM glisin) hızlı bir dönüş ve vorteks ile söndürme tampon kaldırmak için bağlantı tamponu ile iki kez reaksiyona girmemiş obg kaldırmak ve su verme için tampon 1 ml 2x yıkayın. </li><li> BSA&#39;ya konjuge Alexa Fluor 594 süksinimidil ester, 50 ug içeren bağlama tamponu 1 ml ilave edilir. Kapatma önce azot ile tüp doldurun ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat için bir tekerlek üzerinde inkübe edilir. </li><li> Boncuklar hızlı bir dönüş ve vorteks ile 1 ml PBS ile 3 kez yıkanmış, daha sonra, taneler hızlı bir dönüş ve reaksiyonu durdurmak için girdaplanır tampon söndürülmesi, 1 ml ile 3 kez yıkayın. </li><li> Son olarak, uzun süreli depolama için v azit / ağ% 10 2 ul PBS içinde 1 ml boncuk tekrar süspansiyon. Concentratio ölçünBir hemasitometre (genellikle yaklaşık 1-2 x 10 9 boncuk / ml) ile süspansiyon içinde boncuk n, daha önce azot ile kapatma tüpü doldurmak ve karanlıkta 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> OBG fluoresein kaplama etkinliği, 500 nm&#39;de uyarma kullanılarak emisyon spektrumunu kontrol ile test edilebilir. Yaban turpu peroksidaz (HRP) mevcudiyetinde, H2O 2 yükseltgenmiştir olduğunda, emisyon tepe (538 nm) oksitlenmiş boncuk floresans yoğunluğu, nonoxidized kaplanmış boncuklar daha 11-12x daha yüksektir. </li><li> Hasat katlanarak optik şeffaf plastik veya cam alt ile 3 cm yemekleri hücrelerin farklı yoğunlukları plaka ve gecede onları büyümek, 10 cm Petri kabı Diktiyostelyum hücreleri büyüyor. Deney için yaklaşık% 80 konfluent olan tabakları seçin. Dictyostelium hücrelerin yetiştirilmesi için detaylı bir protokol 15 yayınlanmıştır. </li><li> Loflo ortamında (LF ortamı) ile kültür ortamı yerine inkübasyonaHL5C kültür ortamının hücre dışı ve intraendosomal otoflüoresanı azaltmak amacıyla, deneyden önce 2 hr. </li><li> Buna paralel olarak, 10-15 bekle, yaklaşık 1 mm kalınlığında bir agar tabakasının oluşturulması için düz bir yüzey (10 cm x 10 cm, yani, bir cam plaka) üzerine dökün agar, LF ortam içinde, 10 ml% 1.5 Bacto agar eriyik dk katılaşmaya. Daha sonra kullanmak için LF ortamda 2 cm x 2 cm kareler ve yeri içine agar tabakası kesti. </li><li> Bu arada, iplik-diski veya geniş alan mikroskobu hazırlamak 22 ° C çevre odasının sıcaklığını ayarlamak ve bu deney için ayarları yapın. (Tartışma ek açıklamalara bakınız). </li><li> Kuluçkadan 2 saat sonra, 3 cm çanak LF ortam aspire, ancak hücre ortamı hala tek tabaka ince bir film tabakası ile kaplanmış olmalıdır. 1.5 x 10 7 boncuk / ml &#39;ye seyreltilir kaplı boncuklar ve hücre tabakası üzerine 10 ul ekle. </li><li> Bir kare ağar levha alın, aşırı sıvı drenaj ama ıslak tutun. Yavaşça inci koymakHücre tabakanın üstünde e agar kare. Bu hücreleri üzerinde yatarken ağar kare hareket ettirmeyin. Agar kalıbı böylece alımını arttırır, boncuk ve hücreler arasındaki teması geliştirmek için kullanılabilir ve aynı zamanda hafifçe amaç odak düzleminde daha tutarak, hücreleri sıkıştırmaktadır. </li><li> , Yemeğin üzerine kapağını yerleştirin mikroskop sahne üzerine yerleştirin ve otomatik olarak, kırmızı, yeşil ve faz kanallarda fotoğraf çekmek 2 saat ya da daha uzun süre her 1 dk. </li><li> Seçin ve fagositoz tüm süreci içeren hücresel olaylara odaklanır. Optimize 3 kanal Birleştirme ve profesyonel görüntü işleme yazılımı kullanarak bir film haline resimleri bir araya. Kırmızı ve yeşil kanallarda seçilen her boncuk floresan yoğunluğu ölçmek ve yeşil / kırmızı oranı, hücrelerin dinamik phagosomal ROS üretimini yansıtır. </li></ol> 2. Hücre içi süperoksit Üretim Kantitatif ve Orta-verimlilik ölçümü <ol><li> O toplayınne% 80 konfluent HL5C ortamı 10 ml Dictyostelium&#39;un tabak. 5 dakika dikkatlice ve tamamen aspire aşırı ortam için 850 xg santrifüj Diktiyostelyum hücreleri. SS6.4 tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücreleri [Sorensen tamponda 0.12 M sorbitol (14,69 mM KH 2 PO 4 ve 6.27 mM Na 2 HPO 4), pH 6.4], hücrelerin sayısı ve 6 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir son yoğunluğa seyreltilmiş (tartışma ek yorumlara bakınız). </li><li> (Tartışmada ek açıklama bakınız), saydam olmayan, beyaz bir 96 yuvalı plakanın her oyuğuna hücre süspansiyonu, 50 ul ekle. </li><li> Gerekirse her bir çok kanallı pipet kullanarak içine DHE stokları (DMSO içinde 30 mM) ile seyreltildi DHE SS6.4, pipet 50 ul ile 500 kat seyreltilir. DHE nihai konsantrasyonu, 30 uM&#39;dir. Reaksiyon hemen başlar. </li><li> Uyarılar veya inhibitörleri özel ihtiyaçlarına göre bu noktada ilave ya da başka bir zaman noktalarında edilebilir. </li><li> Son nokta &quot;üst okuma &amp; # kullanın34, 522 nm/605 nm fluoresans uyarım / emisyon ile bir floresan mikroplaka okuyucu, şekli, 22 ° C&#39;de, 1 saat, orta çalkalama 5 saniye / dakika boyunca her 2 dakikada bir okuma </li></ol> 3. Kantitatif ve hücre dışı Yüksek Verimli Ölçüm H 2 O 2 Üretimi <ol><li> 2.1 ve 2.2 &#39;de açıklandığı gibi aynı adımları izleyin. </li><li> SS6.4, girdap 10 ml HRP stoklar 5 ul (damıtılmış su içinde 100 U / ml) eklenerek seyreltilmiş HRP hazırlayın ya da iyice karıştırın ve daha sonraki kullanım için buz üzerinde tutmak için tüp ters. Seyreltilmiş HRP solüsyonu 0,05 U / ml &#39;de olduğu. </li><li> Sırasıyla AUR stok (DMSO içinde 10 mM AUR) ve 6.25 uM nihai konsantrasyonlara SS6.4 tampon seyreltilmiş HRP solüsyonu ve 0.005 U / ml karıştırılarak AUR tepkime karışım hazırlayın. Bir örnek olarak, 40 reaksiyonlar için reaksiyon karışımı hazırlamak için seyreltilmiş HRP 400 ul ve AUR stok çözeltisi 2.5 ul SS6.4 1600 ul karıştırın. </li><li> AUR karışımı 50 ul ekleGerekirse her zamanda bir çok kanallı pipet kullanarak içine Ture. Şimdi reaksiyon başlar. </li><li> Uyarılar veya inhibitörleri özel ihtiyaçlarına göre bu noktada ilave ya da başka bir zaman noktalarında edilebilir. </li><li> 530 nm/590 nm&#39;de floresan uyarma / emisyon ile bir floresan mikro plaka okuyucu bitiş noktası &quot;üst okuma&quot; modunu kullanın, 22 ° C&#39;de, 1 saat, orta sallamak 5 sn / dk boyunca her 2 dakikada okumak </li></ol>

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Daha önce anlatılan yöntemler ile karşılaştırıldığında, deney OBG dinamik yerine hücre popülasyonundan bir ortalama ROS ölçüm sinyalinin, tek hücre düzeyinde phagosomal ROS üretim süreci görüntüler. Bu tür nüfus ortalama yöntemleri nonsynchronous fagositozu nedeniyle kritik bilgilerini gizlemek için eğilimindedir. Biz başarıyla Dictyostelium&#39;un için DHE&#39;nin ve AUR tahlilleri uyarlanmış ve protokolleri optimize. En önemlisi, biz bu iki deneylerle ölçülen türleri ve R...

Reaktif oksijen türleri (ROS) bu tür bir ev sahibi savunma, sinyalizasyon, doku gelişimi ve yaralanmaya yanıt olarak, hipertansiyon ve kanser gibi biyolojik süreçlerin çeşitli katılmaktadırlar. Iyi çalışılmış phagosomal NADPH oksidaz makine nötrofillerin phagosomes 1 yutulur bakterileri öldürmek için, oksidatif patlama olarak bilinen hızlı ROS üretimi, adamıştır. Buna ek olarak, mitokondriyal solunum zinciri, bir yan ürün olarak elektron kaçak önce sadece ROS düzensiz bir kaynak için sorumlu olduğu düşünülmektedir. Ancak, son zamanlarda, bu fare makrofaj 2 bakteri intraphagosomal öldürülmesine katkı önemli bir mekanizma olarak tespit edilmiştir. Son yıllarda, sosyal amip, Diktiyostelyum, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının hücre içsel mekanizmaları incelemek için güçlü ve popüler bir model haline gelmiştir. Nitekim, Diktiyostelyum ve insan fagositlerdir Molecula içinde korunması bir şaşırtıcı derecede yüksek paylaşmakbakteriler, yutulmasına algılama ve 3,4 öldürmekten sorumlu r makine. Proteinler ve bu NADPH oksidazlar, katalazlar, süperoksit dismutazlar olarak ROS üretimi veya detoksifikasyon ile ilişkili enzimlerin homologları, insan ve Dictyostelium hem de bulunabilir. En iyi incelenmiş amip gibi, Dictyostelium memeli bir model sistem üzerinde birçok benzersiz avantajlar sağlar. Bunlar, 8-10 saat arasında bir ikiye katlanma süresi ile, CO2 için gerek kalmadan, oda sıcaklığında büyümesi. Kolaylıkla yapışkan ya da süspansiyon kültürleri olarak tutulabilir. Buna ek olarak, onların tam sıralı ve açıklamalı haploid genom için, kolay ve genetik manipülasyon sayesinde, Diktiyostelyum çok cazip bir deneysel model organizma olmuştur. Önceki çalışmalarda, ROS ile oksidasyon, sonra flüoresans yayarlar (toplu olarak OxyBurst Green, obg olarak da bilinir) çeşitli klorlu fluoresein ve türevleri, flüorlanmış bir ROS muhabir olarak kullanılmıştır. Hücre-permeant esthücre-geçirgen olmayan dekstran-veya protein-birleştirilmiş türevleri, hücre dışı ROS ölçmek için kullanılır ise erified türevleri sitoplazmik ROS ölçmek için kullanılır. Özellikle, OBG BSA ile kaplanmış boncuklar daha önce memeli hücrelerinde 5 phagosomal ROS üretimini tespit etmek için kullanılmıştır. Ancak, mikroplaka okuyucu-temelli yaklaşım sadece hücrelerin bir nüfus bir ortalama ROS nesil eğrisini verebilir. Mevcut protokol ile Diktiyostelyum, profesyonel phagocyte ve optimize edilmiş deney şartları kullanılarak, biz boncuklar üzerine herhangi opsonin conjugating olmadan istikrarlı ve verimli fagositozisi edinin. DHE ROS üretimi 6-9 tespit etmek için, memeli nötrofiller ve makrofajlar gibi çeşitli model sistemlerinde, kullanılmıştır. Bu arada, yöntem 8,10 özgüllüğü ve duyarlılığı üzerinde bazı tartışmalar vardır. Amplex Red, AUR ölçmek için daha uygundur, pH, daha az hassas olan bir floresan yoğunluğunun geliştirilmiş bir versiyonu olarakNonneutral ya da zayıf asidik çevrelerde ROS. AUR Geçenlerde birkaç memeli sistemlerinde 11,12 tatbik edilmiştir, ancak oldukça sık zayıf asidik büyüme ortamı gerektirir memeli olmayana modeller, kullanımı henüz rapor edilmemiştir. Buna ek olarak, nicel ve dinamik sosyal amip Diktiyostelyum ROS üretim ve yerelleştirme ölçmek için yayınlanmış protokol yoktur. Protokoller sunulan kümesinin amacı çeşitli ROS ve yerelleştirme izlemek için kolay ve çok yönlü bir çözüm sağlamak ve daha fazla ROS ile ilgili hücresel mekanizmaları içgörü vermektir. OBG deneyi için, Dictyostelium hücreler tarafından OBG-kaplı tanelerin alımından sonra phagosomal ROS kuşağın tüm süreç izlemek için canlı mikroskobu kullanılır ve bakteri öldürme intraphagosomal mekanizmasını incelemek için yeni bir yaklaşım sağlanmaktadır. Bu hücre içi superox ölçmek için, Dictyostelium &#39;da orta verim DHE ve AUR tahlilleri optimizegüçlü bir ROS uyarıcı olarak LPS ile sırasıyla ide ve hücre dışı H 2 O 2 üretimi,. Son zamanlarda LPS fagosite bakteriler 13 doğru Dictyostelium bakterisit aktivitesini artırdığı gösterilmiştir dikkat etmek gerekir. Buna ek olarak, DEDTC ve katalaz ile tedavi açıkça bu iki yöntem özellikle farklı türde ve Dictyostelium&#39;da ROS hücre içi lokalizasyonu ölçmek olduğunu doğruladı. Son olarak, OBG deneyi daha da hayvan hücrelerinin fagositik reseptörleri için ligandlar olan boncuk opsonizing ile, herhangi bir yapışkan fagositik bir hücre için adapte edilebilir. İlke olarak, DHE ve AUR deneyler ayrıca ince ayarlı uygun deneysel koşullar altında herhangi bir yapışkan ya da yapışkan olmayan hücre ölçümler için olabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Reaktif oksijen türleri (ROS) dinamik olarak birbirlerine ya da katalitik olarak ya da kendiliğinden ortadan reaktif ve kısa ömürlü oksijen-içeren moleküllerin, bir dizi ihtiva eder. Nedeniyle çoğu ROS ve kendi kaynakları ve subselüler yerleşimlerin çeşitliliğinin kısa yaşam süreleri için, tam bir resim sadece protokolleri bir arada kullanırken dikkatli ölçümler elde edilebilir. Burada, bir OxyBurst Yeşil (OBG) kullanarak üç farklı protokoller kümesi kaplı boncuklar, ya dihydroethidium (DHE&#39;nin) sunmak ve Amplex ultrared (AUR), nitelik ve nicelik gibi Dictyostelium&#39;da gibi profesyonel fagositlerin çeşitli ROS izlemek için. Biz dinamik tek hücre düzeyinde intraphagosomal ROS üretimi görselleştirmek için boncuk kaplama prosedürleri ve ikinci el OBG kaplı boncuklar ve canlı mikroskopi optimize edilmiş. Biz E&#39;den lipopolisakkarid (LPS) tarafından tanımlanan Dictyostelium&#39;da ROS üretimi için güçlü bir uyarıcı olarak coli. Ayrıca, developed gerçek zamanlı kantitatif olarak, sırasıyla, hücre içi ve hücre dışı H süperoksit 2 O 2 üretimi ölçmek için DHE ve AUR kullanılarak orta verimlilik gösteren deneyler.

Phagosomes ROS nesil mikroskobu (Dosya S1) ile niteliksel ve dinamik görülebilir. Alexa Fluor 594 tarafından yayılan kızıl flüoresans pH-duyarlı ve obg oksitlenmesi yeşil kanal içindeki floresan artar, phagosomal ortamda sabit kalır. In vitro emisyon spektrumu oksitlenmiş ve nonoxidized OBG-kaplanmış boncuklar oksidasyon sonra yoğunluğunda önemli bir artış gösteren, Şekil 1B karşılaştırılmaktadır. Canlı etkinlikleri vizüalizasyon, iki kanal alımın...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Görüntüleme.  University of Geneva.  Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır. 

Video: Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Biyoloji

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Miyokard Performans ve Oksijen Tüketimi İnceleme Kemirgen Çalışma Kalp Modeli

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Miyokard Performans ve Oksijen Tüketimi İnceleme Kemirgen Çalışma Kalp Modeli

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması