Nous sommes reconnaissants à MM Karl-Heinz Krause et Vincent Jaquet de l&#39;aide et des conseils pour mettre en place ces protocoles, et remercions également Christoph Bauer et Jérôme Bosset de la plate-forme de bio-imagerie du PRN et le Dr Navin Gopaldass pour leur soutien technique. La recherche est financée par une subvention de DocPro du Fonds national suisse.

Une. Visualisation et de mesure qualitative de la production de ROS dans phagosomes Les perles OBG enduits doivent être préparés à l&#39;avance. Les procédures de revêtement de perles et technique de gélose sont adaptés de références publiées 5,14. <ol><li> Ajouter 1 ml de la suspension de 3,0 um billes de silice carboxylés (environ 1,8 x 10 9 billes) dans un tube de 1,5 ml, laver les billes 3 fois avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et tourbillonnement. </li><li> Remettre en suspension les billes dans 1 ml de PBS contenant 25 mg / ml de cyanamide (pour activer les perles de silice se lient de manière covalente à carboxylés préalablement marqué BSA), sur une roue incuber pendant 15 min. </li><li> Laver 3 fois avec 1 ml de tampon de couplage (0,1 borate de sodium M, pH 8,0) par rotation rapide (centrifugeuse à pleine vitesse dans un dessus de table mini-centrifugeuse pendant 5 secondes ou encore centrifuger à 2000 g pendant 1 min dans une centrifugeuse de table) et vortex pour enlever l&#39;excès de cyanamide. </li><li> Mélanger les billes lavées avec 500 ul de ctampon contenant 1 mg de OxyBurst vert (OBG) H2HFF (dihydro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA oupling, remplir le tube avec de l&#39;azote gazeux à partir d&#39;une norme gaz peut avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 14 heures (la nuit) à la température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les billes avec 2x 1 ml de tampon de trempe (250 mM de glycine dans du PBS) pour éliminer OBG n&#39;ayant pas réagi, et deux fois avec du tampon de couplage pour éliminer le tampon de trempe par rotation rapide et tourbillonnement. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de couplage contenant 50 pg de l&#39;Alexa Fluor 594 ester de succinimidyle de conjuguer à la BSA. Remplir le tube avec de l&#39;azote avant plafonnement, et incuber sur une roue pendant 1,5 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les perles 3x avec 1 ml de tampon trempe par tour rapide et vortex pour arrêter la réaction, puis lavez les perles 3x avec 1 ml de PBS par centrifugation rapide et vortex. </li><li> Enfin, la remise en suspension des billes dans 1 ml de PBS avec 2 ul de 10% p / v d&#39;azide de stockage à long terme. Mesurer la concentration des perles dans la suspension avec un hématimètre (généralement autour de 1-2 x 10 9 billes / ml), remplir le tube avec de l&#39;azote avant plafonnement, et conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> L&#39;efficacité du revêtement de la fluorescéine OBG peut être testée en contrôlant le spectre d&#39;émission en utilisant une excitation à 500 nm. Lorsqu&#39;il est oxydé par H 2 O 2 en présence de peroxydase de raifort (HRP), l&#39;intensité de fluorescence des billes oxydées, au pic d&#39;émission (538 nm), est de 11-12x plus élevée que celle des billes revêtues non oxydés. </li><li> Récolte croissance exponentielle des cellules Dictyostelium d&#39;une boîte de 10 cm de Pétri, plaque différentes densités de cellules sur 3 cm plats avec un plastique optiquement transparent ou à fond de verre, et les cultiver pendant la nuit. Choisissez les plats qui sont environ 80% de confluence de l&#39;expérience. Un protocole détaillé pour cultiver des cellules Dictyostelium a été publié le 15. </li><li> Remplacez le milieu de culture avec un milieu LoFlo (milieu de LF), incuber pendant2 heures avant l&#39;expérience, afin de diminuer l&#39;auto-fluorescence extracellulaire et intraendosomales du milieu de culture de HL5C. </li><li> En parallèle, faire fondre bacto agar 10 ml de 1,5% en milieu LF, verser l&#39;agar sur une surface plane (une plaque de verre de 10 cm x 10 cm) pour former une couche d&#39;agar environ 1 mm d&#39;épaisseur, attendre 10-15 min se solidifier. Couper la couche d&#39;agar dans 2 cm x 2 cm carrés et placer dans un milieu LF pour une utilisation ultérieure. </li><li> Pendant ce temps, préparer le disque tournant ou large microscope de champ, régler la température de la chambre de l&#39;environnement à 22 ° C et ajuster les paramètres de cette expérience. (Voir les commentaires supplémentaires dans la discussion). </li><li> Après 2 h d&#39;incubation, aspirer le milieu de la LF à partir de 3 cm plat, mais la monocouche cellulaire doit toujours être recouvert d&#39;une mince pellicule de support. Diluer les billes revêtues à 1,5 x 10 7 perles / ml et ajouter 10 ul sur la couche cellulaire. </li><li> Prenez une feuille agar carré, drainer l&#39;excès de liquide mais garder humide. Placez délicatement ee agar carré sur le dessus de la couche de cellules. Ne pas déplacer le carré agar quand il est couché sur les cellules. La gélose est utilisée pour augmenter le contact entre les billes et les cellules, ce qui améliore l&#39;absorption, et elle comprime légèrement les cellules, en les maintenant mieux dans le plan focal de l&#39;objectif. </li><li> Placer le couvercle sur le plat, placez-le sur la platine du microscope, et automatiquement prendre des photos dans les canaux rouge, vert et de phase chaque 1 min pendant 2 heures ou plus. </li><li> Sélectionner et se concentrer sur les événements cellulaires qui contiennent l&#39;ensemble du processus de phagocytose. Fusionner les 3 canaux optimisés et assembler les images dans un film en utilisant un logiciel professionnel de traitement d&#39;image. Quantifier l&#39;intensité de fluorescence de chaque perles choisies dans les canaux rouge et vert, et le rapport de vert / rouge reflète la dynamique phagosome la production de ROS des cellules. </li></ol> 2. Quantitative et moyen débit Mesure de la production de superoxyde intracellulaire <ol><li> Recueillir o80% ne plat confluent de Dictyostelium dans 10 ml de milieu de HL5C. Cellules Centrifugeuse Dictyostélium à 850 g pendant 5 min, avec soin et excès du milieu aspirer complètement. Resuspendre les cellules dans un tampon de SS6.4 [0,12 M de sorbitol dans le tampon Sorensen (14,69 mM KH 2 PO 4 et 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], compter les cellules et diluer à une densité finale de 6 x 10 6 cellules / ml (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion). </li><li> Ajouter 50 pi de suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits opaque blanc (voir les commentaires supplémentaires dans la discussion). </li><li> Diluer DHE actions (30 mM dans le DMSO) 500 fois avec SS6.4, pipette 50 ul de dilution DHE dans chaque puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux si nécessaire. La concentration finale de la DHE est de 30 uM. La réaction commence immédiatement. </li><li> Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d&#39;autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques. </li><li> Utilisez le point final &quot;top lecture &amp; #34, le mode d&#39;un lecteur de microplaques à fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 522 nm nm/605, lire toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C. </li></ol> 3. Quantitatif à haut débit et la mesure de extracellulaire H 2 O 2 Production <ol><li> Suivez les mêmes étapes décrites à la section 2.1 et 2.2. </li><li> Préparer HRP dilué par addition de 5 pi de HRP actions (100 U / ml dans l&#39;eau distillée) dans 10 ml de SS6.4, vortex ou inverser le tube pour bien mélanger et garder sur la glace pour une utilisation ultérieure. La solution HRP dilué est de 0,05 U / ml. </li><li> Préparer le mélange réactionnel en mélangeant l&#39;AUR AUR magasin (AUR 10 mM dans du DMSO) et la solution HRP dilué dans du tampon de SS6.4 aux concentrations finales de 6,25 uM, et 0,005 U / ml, respectivement. Par exemple, pour préparer le mélange de réaction pendant 40 réactions, mélanger 1 600 pi de SS6.4 avec 400 pi de HRP dilué et 2,5 pi de AUR solution stock. </li><li> Ajouter 50 ul de mélange AURture dans chaque puits en utilisant une pipette à canaux multiples, si nécessaire. Maintenant, la réaction démarre. </li><li> Stimuli ou inhibiteurs peuvent être ajoutés à ce moment, ou à d&#39;autres points dans le temps en fonction des besoins spécifiques. </li><li> Utilisez le point le mode de fin &quot;haut de lecture&quot; d&#39;un micro lecteur de plaque de fluorescence, avec une fluorescence excitation / émission à 530 nm nm/590, lisez toutes les 2 min pendant 1 heure, le tremblement moyenne 5 sec / min, à 22 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Par rapport aux procédés décrits précédemment, le dosage OBG visualise dynamiquement le processus de génération de ROS phagosome au niveau de la cellule unique, au lieu de mesurer un signal moyen ROS partir d&#39;une population de cellules. Ces méthodes population moyennes ont tendance à occulter des informations critiques causés par phagocytose non synchrone. Nous avons adapté avec succès DHE et AUR essais de Dictyostelium et optimisé les protocoles. Plus important encore, nous avons précisé les...

Les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) sont impliqués dans une grande variété de processus biologiques tels que la défense de l&#39;hôte, la signalisation, le développement tissulaire et réponse à la lésion, ainsi que l&#39;hypertension artérielle et du cancer. Le mécanisme de la NADPH oxydase phagosome bien étudié est dédié à la génération de ROS rapide, connu sous le burst oxydatif, pour tuer les bactéries ingérées dans les phagosomes de neutrophiles 1. En outre, les fuites d&#39;électrons comme un sous-produit de la chaîne respiratoire mitochondriale a déjà été pensé pour être responsable que d&#39;une source non réglementée de ROS. Mais récemment, il a été identifié comme un mécanisme important pour contribuer à la mise à mort intraphagosomal de bactéries dans les macrophages de souris 2. Au cours des dernières années, l&#39;amibe sociale, Dictyostelium, est devenu un modèle puissant et populaire pour étudier les mécanismes intrinsèques cellulaires de la réponse immunitaire innée. En effet, Dictyostelium et phagocytes humains partagent un niveau étonnamment élevé de conservation dans moleculales mécanismes responsables de la détection des bactéries, l&#39;engloutissement et tuer 3,4 r. Les homologues des protéines et des enzymes liées à la production ou à la détoxification des ROS, tel que NADPH oxydases, les catalases, les superoxyde dismutases, peuvent être trouvés à la fois humaine et de Dictyostelium. Comme l&#39;amibe mieux étudié, Dictyostelium présente plusieurs avantages uniques sur le système de modèle de mammifère. Ils se développent à la température ambiante sans la nécessité pour le CO 2, avec un temps de doublement de 8-10 h. Ils peuvent être facilement conservées sous forme de cultures adhérentes ou en suspension. En outre, grâce à leur génome haploïde entièrement séquencé et annoté, et à la manipulation génétique facile, Dictyostelium est devenu un modèle expérimental très attrayant organisme. Dans des études antérieures, divers dérivés chlorés et fluorés de fluorescéine (collectivement connu sous le nom OxyBurst Green, OBG) qui émettent une fluorescence après oxydation par ROS, ont été utilisés en tant que reporter ROS. Cellulaire infiltrant intérêtdérivés erified sont utilisés pour mesurer cytoplasmique ROS, alors-ou les dérivés du dextran couplés aux protéines cellulaires imperméant sont utilisés pour mesurer extracellulaire ROS. En particulier, des perles OBG BSA revêtues ont déjà été utilisés pour détecter la production de ROS phagosomale dans les cellules de mammifères 5. Cependant, l&#39;approche basée sur lecteur microplaque ne peut donner une courbe de génération de ROS moyenne d&#39;une population de cellules. Avec le présent protocole, en utilisant Dictyostelium, un phagocyte professionnel, et les conditions expérimentales optimisées, nous obtenons la phagocytose stable et efficace sans la conjugaison tout opsonine sur les billes. DHE a été utilisée dans divers systèmes modèles, tels que les neutrophiles et les macrophages de mammifères, pour détecter la production de ROS 9.6. Pendant ce temps, il ya des controverses sur la spécificité et la sensibilité de la méthode 8,10. Comme une version améliorée de Amplex Red, l&#39;intensité de fluorescence de AUR est moins sensible au pH, ce qui le rend plus approprié pour mesurerROS dans les milieux non-neutres ou faiblement acides. AUR a récemment été appliquée dans plusieurs systèmes de mammifères 11,12, mais son utilisation dans les modèles non-mammifères, qui nécessitent souvent des milieux de croissance faiblement acide, n&#39;a pas encore été signalé. En outre, il n&#39;existe pas de protocole publié à mesurer quantitativement et dynamiquement la production de ROS et la localisation dans l&#39;amibe sociale Dictyostelium. Le but du jeu présenté des protocoles est de fournir une solution simple et souple pour surveiller divers ROS et leur localisation, et en outre donner un aperçu des mécanismes cellulaires ROS-liés. Pour le dosage OBG, nous avons utilisé la microscopie en direct pour surveiller l&#39;ensemble du processus de génération de ROS phagosome après absorption de perles OBG revêtues par des cellules Dictyostelium, et proposons une nouvelle approche pour étudier le mécanisme de destruction intraphagosomal de bactéries. Nous avons optimisé moyen débit DHE et AUR essais dans Dictyostelium, pour mesurer superoxyde intracellulaireide et de H 2 O 2 extracellulaire production, respectivement, à l&#39;aide de LPS comme un stimulateur puissant de ROS. Notez que le LPS a été récemment montré pour augmenter l&#39;activité bactéricide de Dictyostelium vers bactéries phagocytées 13. En outre, le traitement par DEDTC et de la catalase a confirmé explicitement que ces deux méthodes mesurent spécifiquement différents types et localisations subcellulaires de ROS dans Dictyostelium. Enfin, le dosage OBG peut être adapté à n&#39;importe quelle cellule phagocytaire adhérente, par opsonisation en outre les perles avec des ligands pour les récepteurs phagocytaires des cellules animales. En principe, les tests DHE et AUR peuvent également être affiné pour les mesures dans une cellule adhérente ou non adhérente dans des conditions expérimentales appropriées.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) comprennent une gamme de molécules contenant de l&#39;oxygène réactif et de courte durée, qui sont dynamiquement interconvertis ou éliminées soit catalytique ou spontanément. En raison de la durée de vie courte de la plupart des ROS et la diversité de leurs sources et localisations subcellulaires, une image complète peut être obtenue que par des mesures précises en utilisant une combinaison de protocoles. Ici, nous présentons un ensemble de trois protocoles différents à l&#39;aide OxyBurst vert (OBG) revêtu perles, ou dihydroethidium (DHE) et Amplex Ultrared (AUR), de suivre qualitativement et quantitativement différents ROS dans les phagocytes professionnels tels que Dictyostelium. Nous avons optimisé les procédures de revêtement de perles et perles occasion OBG-enduits et microscopie en direct de visualiser dynamiquement intraphagosomal génération de ROS au niveau d&#39;une seule cellule. Nous avons identifié le lipopolysaccharide (LPS) de E. coli comme un puissant stimulateur de la production de ROS dans Dictyostelium. En outre, nous Dtemps réel eveloped, essais à moyen débit utilisant DHE et AUR à mesurer quantitativement dismutase intracellulaire et H 2 O 2 de production extracellulaire, respectivement.

La génération de ROS dans les phagosomes peut être visualisé qualitativement et de façon dynamique par microscopie (S1 du fichier). La fluorescence rouge émise par Alexa Fluor 594 est insensible au pH et reste constante dans le milieu de phagosome, tandis que l&#39;oxydation de OBG augmente sa fluorescence dans le canal vert. Les spectres d&#39;émission de oxydé in vitro et non oxydés OBG perles revêtues sont comparées sur la figure 1B, montrant une augmentation sign...

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Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives.

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K vues.  University of Geneva.  Nous avons adapté un ensemble de protocoles pour la mesure d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui peuvent être appliqués dans différents modèles cellulaires amibes et de mammifères pour les études qualitatives et quantitatives. 

Vidéo: Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

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Biologie

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Résonance de spin électronique Micro-imagerie d&#39;espèces vivantes pour la cartographie d&#39;oxygène

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositif de récupération d&#39;échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Génération de signalisés et Mutants dans Modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Rongeur de travail Modèle de coeur pour l&#39;étude de la performance myocardique et la consommation d&#39;oxygène

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualiser les premiers stades de la phagocytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Stimulation de niches de cellules souches et régénération tissulaire dans la peau de souris par photogénération commutable d’espèces réactives de l’oxygène dépendantes de la protoporphyrine IX in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...