نحن ممتنون لالدكاترة كارل هاينز كراوس وفنسنت JAQUET طلبا للمساعدة والمشورة لإعداد هذه البروتوكولات، ونشكر أيضا كريستوف باور وجيروم Bosset من منهاج Bioimaging من NCCR والدكتور نافين Gopaldass للحصول على الدعم التقني. ويدعم هذا البحث من خلال منحة ProDoc من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

1. التصور والقياس النوعي للإنتاج ROS في Phagosomes وينبغي إعداد حبات OBG المغلفة مقدما. يتم تكييفها حبات إجراءات طلاء وتقنية تراكب آغار من المراجع المنشورة 5،14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل تعليق 3.0 ميكرون حبات السيليكا carboxylated (حوالي 1.8 × 10 9 حبات) في أنبوب 1.5 مل، تغسل حبات 3x أخرى مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق زيادة ونقصان سريع وvortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend والخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 25 ملغ / مل سياناميد (لتنشيط حبات السيليكا carboxylated لتساهميا ربط prelabeled BSA)، واحتضان على عجلة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X مع 1 مل من العازلة اقتران (0.1 بورات الصوديوم M، ودرجة الحموضة 8.0) من خلال الدوران السريع (أجهزة الطرد المركزي بسرعة كاملة في أعلى الجدول الطرد المركزي لمدة 5 ثوانى صغيرة أو بدلا من أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة في أعلى الجدول الطرد المركزي) و vortexing للإزالة سياناميد الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج الخرز غسلها مع 500 ميكرولتر من جoupling العازلة التي تحتوي على 1 ملغ من OxyBurst الأخضر (OBG) H2HFF (ثنائي هيدرو-2 &#39;، 4،5،6،7،7&#39; hexafluorofluorescein) BSA، وملء الأنبوب مع غاز النيتروجين من معيار الغاز يمكن قبل متوجا، و احتضان على عجلة لمدة 14 ساعة (بين عشية وضحاها) في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 2X مع 1 مل من التبريد العازلة (250 ملي glycin في برنامج تلفزيوني) لإزالة غير المتفاعل OBG، ومرتين مع العازلة اقتران لإزالة المخزن المؤقت التبريد عن طريق زيادة ونقصان سريع وvortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من العازلة اقتران يحتوي على 50 ميكروغرام من اليكسا فلور 594 succinimidyl استر لتصريف لجيش صرب البوسنة. ملء الأنبوب مع النيتروجين قبل متوجا، واحتضان على عجلة ل1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 3x أخرى مع 1 مل من العازلة تدور التبريد السريع وvortexing للوقف رد الفعل، ثم تغسل حبات 3x أخرى مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق زيادة ونقصان سريع وvortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، resuspend والخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 2 ميكرولتر من 10٪ ث / ت أزيد للتخزين على المدى الطويل. قياس concentratioن من الخرز في التعليق مع عدادة الكريات (عادة حوالي 1-2 × 10 9 حبات / مل)، وملء الأنبوب مع النيتروجين قبل متوجا، وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كفاءة الطلاء من فلوريسئين OBG يمكن اختبارها عن طريق التحقق من طيف الانبعاث باستخدام الإثارة في 500 نانومتر. عندما تتأكسد بواسطة H 2 O 2 في وجود الفجل البيروكسيداز (HRP)، كثافة مضان من الخرز أكسدة، في ذروة الانبعاثات (538 نانومتر)، هو 11-12X أعلى من حبات المغلفة nonoxidized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا المتنامية باطراد Dictyostelium من طبق بتري 10 سم، لوحة كثافات مختلفة من الخلايا على 3 سم مع الأطباق البلاستيك واضحة بصريا أو أسفل الزجاج، وتنمو عليها بين عشية وضحاها. اختيار الأطباق التي هي حوالي 80٪ متموجة للتجربة. وقد تم نشر بروتوكول مفصلة لزراعة الخلايا Dictyostelium 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال مستنبت مع LoFlo المتوسطة (LF المتوسطة)، واحتضان ل2 ساعة قبل التجربة من أجل تقليل تألق ذاتي خارج الخلية وintraendosomal من مستنبت HL5C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في موازاة ذلك، تذوب 10 مل 1.5٪ في المتوسط ​​bacto أجار LF، صب أجار على سطح مستو (أي لوحة من الزجاج 10 سم × 10 سم) من أجل تشكيل طبقة أجار حوالي 1 مم، وانتظر لمدة 10-15 دقيقة ليصلب. قطع طبقة أجار إلى 2 سم × 2 سم مربع ومكان في LF المتوسطة لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، وإعداد الغزل القرص أو المجهر حقل واسع، تعيين درجة حرارة الغرفة البيئية عند 22 درجة مئوية، وضبط الإعدادات لهذه التجربة. (انظر تعليقات إضافية في المناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة من الحضانة، نضح المتوسطة LF من 3 سم الطبق، ولكن لا يزال ينبغي أن تغطي أحادي الطبقة الخلية عن طريق طبقة رقيقة من المتوسط. تمييع حبات المغلفة إلى 1.5 × 10 7 حبات / مل، وإضافة 10 ميكرولتر على طبقة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ ورقة واحدة أجار مربع، واستنزاف السوائل الزائدة ولكن يبقى الرطب. وضع بلطف عشره أجار مربع على أعلى من طبقة الخلايا. لا تتحرك الساحة أجار عندما يكذب على الخلايا. يتم استخدام تراكب آغار لزيادة الاتصال بين الخلايا والخرز، وبالتالي تحسين امتصاص، وأيضا الكمادات قليلا من الخلايا، وحفظ لهم أفضل في المستوى البؤري للهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء على طبق، ووضعه على المسرح المجهر، والتقاط الصور تلقائيا في قنوات الأحمر والأخضر ومرحلة كل 1 دقيقة لمدة 2 ساعة أو أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد والتركيز على الأحداث الخلوية التي تحتوي على كامل عملية البلعمة. دمج الأمثل 3 قنوات وتجميع الصور في الفيلم باستخدام المهنية برامج معالجة الصور. قياس كثافة مضان من كل حبات مختارة في قنوات الأحمر والأخضر، وسوف نسبة أخضر / أحمر تعكس ديناميكية phagosomal ROS إنتاج الخلايا. </li></ol> 2. القياس الكمي والمتوسطة مرت من بين الخلايا الأكسيد الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع سشمال شرق 80٪ طبق متموجة من Dictyostelium في 10 مل من HL5C المتوسط. خلايا الطرد المركزي في 850 x ج Dictyostelium لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية تماما المتوسطة الزائدة. Resuspend الخلايا في المخزن SS6.4 [0.12 M السوربيتول في المخزن سورنسن (14.69 ملي KH 2 PO 4 و 6.27 ملي نا 2 هبو 4)، ودرجة الحموضة 6.4]، عد الخلايا وتمييع لكثافة النهائي من 6 × 10 6 خلية / مل (انظر تعليقات إضافية في المناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من لوحة بيضاء غير شفافة 96 كذلك (انظر تعليقات إضافية في المناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع DHE الأسهم (30 ملم في DMSO) 500 أضعاف مع SS6.4، ماصة 50 ميكرولتر من المخفف DHE في كل بئر باستخدام ماصة الأقنية إذا لزم الأمر. تركيز النهائي من 30 ميكرومتر DHE هو. يبدأ رد فعل على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محفزات أو مثبطات يمكن أن تضاف في هذه المرحلة، أو في نقاط زمنية أخرى وفقا لاحتياجات محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نقطة نهاية &quot;رأس القراءة &amp; #34؛ طريقة قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية، مع مضان الإثارة / الانبعاثات في 522 nm/605 نانومتر، وقراءة كل 2 دقيقة لمدة 1 ساعة، هزة متوسطة 5 ثانية / دقيقة، في 22 درجة مئوية. </li></ol> 3. الكمي وقياس إنتاجية عالية من خارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع نفس الخطوات كما هو موضح في 2.1 و 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد HRP المخفف عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من الأسهم HRP (100 U / مل في الماء المقطر) في 10 مل من SS6.4، دوامة أو عكس الأنبوب لتخلط جيدا والحفاظ على الجليد لاستخدامها لاحقا. الحل هو في HRP المخفف 0.05 U / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط التفاعل اور عن طريق خلط الأوراق المالية اور (10 ملي اور في DMSO) والحل HRP المخفف في عازلة SS6.4 إلى تركيزات النهائي من 6.25 ميكرومتر، و0.005 U / مل، على التوالي. كمثال، لإعداد خليط التفاعل لمدة 40 ردود الفعل، ومزيج 1600 ميكرولتر من SS6.4 ب 400 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية المخفف و 2.5 ميكرولتر من محلول المخزون AUR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من مزيج اورتلح في كل بئر باستخدام ماصة الأقنية إذا لزم الأمر. الآن يبدأ التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محفزات أو مثبطات يمكن أن تضاف في هذه المرحلة، أو في نقاط زمنية أخرى وفقا لاحتياجات محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نقطة وضع نهاية &quot;القراءة أعلى&quot; من مضان قارئ لوحة صغيرة، مع مضان الإثارة / الانبعاثات في 530 نانومتر nm/590، وقراءة كل 2 دقيقة لمدة 1 ساعة، هزة متوسطة 5 ثانية / دقيقة، في 22 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center.">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2013:+integrating+multiple+Dictyostelid+species.">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li><li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst.">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li><li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals.">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2 (2008).</li><li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods.">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li><li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays.">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay.">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li><li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles.">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li><li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle.">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells.">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li><li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosomes+and+Phagosomes.">Autophagosomes and Phagosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 445, 317-328 (2008).</li><li>Amir, Y., Edward, O. -. A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

بالمقارنة مع الأساليب المذكورة سابقا، وفحص OBG يتصور حيوي في عملية phagosomal الجيل ROS على مستوى خلية واحدة، بدلا من قياس متوسط ​​إشارة ROS من السكان من الخلايا. مثل هذه الأساليب السكان المتوسط ​​تميل إلى حجب المعلومات الهامة التي تسببها البلعمة nonsynchronous. نحن تكييفها بنجاح...

وتشارك أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في مجموعة متنوعة واسعة من العمليات البيولوجية مثل الدفاع المضيف، إشارات، وتطوير الأنسجة واستجابة لإصابات فضلا عن ارتفاع ضغط الدم والسرطان. تحرص مدروسة phagosomal NADPH آلات أوكسيديز إلى جيل ROS السريع، والمعروفة باسم انفجار الأكسدة، لقتل البكتيريا بلعها في phagosomes العدلات &#39;1. بالإضافة إلى ذلك، تسرب الإلكترونات كمنتج ثانوي من السلسلة التنفسية الميتوكوندريا كان يعتقد في السابق أن تكون المسؤولة الوحيدة عن مصدر غير المنظم من ROS. لكن في الآونة الأخيرة، تم التعرف عليه باعتباره آلية هامة للمساهمة في قتل البكتيريا intraphagosomal في الضامة الماوس 2. في السنوات الأخيرة، والاميبا الاجتماعية، Dictyostelium، أصبح نموذجا قوية وشعبية لدراسة آليات الجوهرية خلية من الاستجابة المناعية الفطرية. في الواقع، Dictyostelium والبالعات الإنسان مشاركة على مستوى عال من المستغرب من الحفظ في البيولوجياص الأجهزة المسؤولة عن البكتيريا الاستشعار عن بعد، مما أسفر عن مقتل والإحاطة 3،4. وhomologs من البروتينات والإنزيمات المتصلة بالإنتاج ROS أو إزالة السموم، مثل oxidases NADPH، catalases، dismutases الفائق، يمكن العثور عليها في كل من الإنسان وDictyostelium. كما الاميبا أفضل درس، Dictyostelium يقدم العديد من المزايا الفريدة على النظام النموذجي الثدييات. أنها تنمو في درجة حرارة الغرفة دون الحاجة إلى CO 2، مع مضاعفة الوقت من 8-10 ساعة. أنها يمكن أن تبقى بسهولة كما الثقافات ملتصقة أو تعليق. بالإضافة إلى ذلك، بفضل تسلسل الجينوم بالكامل والمشروح بهم فرداني، والتلاعب الجيني سهلة، أصبح Dictyostelium نموذج تجريبي جذابة للغاية الحي. في الدراسات السابقة، ومختلف المشتقات المكلورة والمفلورة من فلوريسئين (التي تعرف باسم OxyBurst الأخضر، OBG) التي تنبعث مضان بعد الأكسدة التي كتبها ROS، وقد استخدمت كمراسلة ROS. خلية نفيذ بتوقيت شرق الولايات المتحدةوتستخدم المشتقات erified لقياس حشوية ROS، في حين تستخدم ديكستران أو مشتقات البروتين يقترن خلية impermeant لقياس خارج الخلية ROS. على وجه الخصوص، وقد تم بالفعل استخدام الخرز OBG BSA المغلفة للكشف عن إنتاج ROS phagosomal في خلايا الثدييات 5. ومع ذلك، يمكن أن النهج القائم على قارئ صفيحة ميكروسكوبية تعطي فقط بلغ متوسط ​​منحنى الجيل ROS من السكان من الخلايا. مع هذا البروتوكول، وذلك باستخدام Dictyostelium، وهو بلعمية المهنية، وتحسين ظروف تجريبية، ونحن الحصول البلعمة مستقرة وفعالة دون أي التصريف طاهية على الخرز. وقد استخدم DHE في نظم نموذج مختلف، مثل العدلات الثدييات والضامة، للكشف عن إنتاج ريوس 6-9. وفي الوقت نفسه، هناك بعض الجدل حول خصوصية وحساسية الأسلوب 8،10. بوصفها نسخة محسنة من Amplex الأحمر، وكثافة مضان من اور هي أقل حساسية لدرجة الحموضة، مما يجعله أكثر ملاءمة لقياسROS في الأوساط الحمضية أو nonneutral ضعيفة. وقد تم تطبيق اور مؤخرا في عدة أنظمة الثدييات 11،12، ولكن لم يتم الإبلاغ عن استخدامها في نماذج nonmammalian، والتي في كثير من الأحيان تتطلب وسائط النمو حمضية ضعيفة، حتى الآن. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك بروتوكول لنشر كميا وحيوي قياس إنتاج ريوس والتعريب في الاميبا الاجتماعية Dictyostelium. الهدف من مجموعة قدمت من البروتوكولات هو توفير حل سهل وتنوعا لرصد مختلف ROS والتوطين، وإعطاء مزيد من ونظرة ثاقبة الآليات الخلوية المرتبطة ROS-. لفحص OBG، استخدمنا المجهر الحية لمراقبة العملية برمتها من الجيل phagosomal ROS بعد امتصاص من الخرز OBG المغلفة من قبل خلايا Dictyostelium، وقدمت نهجا جديدا لدراسة آلية القتل intraphagosomal من البكتيريا. قمنا الأمثل المتوسطة الإنتاجية وDHE اور المقايسات في Dictyostelium، لقياس superox داخل الخلايابيئة تطوير متكاملة وخارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج، على التوالي، وذلك باستخدام LPS باعتبارها ROS مشجعا قويا. نلاحظ أن LPS وقد تبين مؤخرا لزيادة النشاط جراثيم من البكتيريا المبتلعة Dictyostelium نحو 13. بالإضافة إلى ذلك، مع العلاج DEDTC والكاتالاز أكد صراحة أن هاتين الطريقتين تحديدا قياس أنواع مختلفة وتعريب التحت خلوية من ROS في Dictyostelium. أخيرا، يمكن تكييفها مقايسة OBG إلى أي خلية أكلة ملتصقة، من خلال مزيد من opsonizing الخرز مع يغاندس لمستقبلات البلعمية من الخلايا الحيوانية. من حيث المبدأ، يمكن للDHE واور المقايسات أيضا يكون على ما يرام ضبطها لقياس في أي خلية ملتصقة أو غير ملتصق تحت ظروف تجريبية مناسبة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

تشمل أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) مجموعة من، المحتوية على الأوكسجين الجزيئات المتفاعلة وقصيرة الأجل، والتي interconverted أو القضاء عليها إما بشكل عفوي أو حفاز حيوي. ويرجع ذلك إلى فترات حياة قصيرة لمعظم ROS وتنوع مصادرها وتعريب التحت خلوية، ويمكن الحصول على صورة كاملة إلا من خلال قياسات حذرا باستخدام مزيج من البروتوكولات. هنا، فإننا نقدم مجموعة من ثلاثة بروتوكولات مختلفة باستخدام OxyBurst الأخضر (OBG) المغلفة الخرز، أو dihydroethidium (DHE) وAmplex UltraRed (اور)، لمراقبة النوعية والكمية ROS مختلفة في البالعات المهنية مثل Dictyostelium. نحن الأمثل حبات إجراءات طلاء وتستخدم حبات OBG المغلفة والمجهري الحية لتصور حيوي intraphagosomal الجيل ROS على مستوى خلية واحدة. حددنا عديد السكاريد الشحمي (LPS) من E. القولونية باعتباره مشجعا قويا لتوليد ROS في Dictyostelium. بالإضافة إلى ذلك، فإننا دeveloped الوقت الحقيقي، المقايسات المتوسطة الإنتاجية باستخدام DHE واور لقياس كميا الفائق داخل الخلايا وخارج الخلية H 2 O 2 الإنتاج، على التوالي.

توليد ROS في phagosomes يمكن تصور نوعيا وبشكل حيوي بواسطة المجهر (S1 ملف). مضان أحمر المنبعثة من اليكسا فلور 594 هو الرقم الهيدروجيني حساسة ويبقى ثابتا في البيئة phagosomal، في حين أكسدة OBG يزيد مضان في قناة خضراء. أطياف انبعاث أكسدة في المختبر وتتم مقارنة nonoxidized الخرز ...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System at JoVE.com

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

نحن تكييفها مجموعة من البروتوكولات لقياس أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) التي يمكن تطبيقها في مختلف النماذج الخلوية الاميبا والثدييات للدراسات النوعية والكمية.

كشف، تصور وQuantitating الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية في النظام النموذجي الاميبا

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  University of Geneva.  نحن تكييفها مجموعة من البروتوكولات لقياس أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) التي يمكن تطبيقها في مختلف النماذج الخلوية الاميبا والثدييات للدراسات النوعية والكمية. 

Video: Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

جيل وتنقية، وتوصيف الأنواع الغازية خلية البروتين DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

جيل المحددة والمسوخ Markerless في أنواع السيانوبكتيريا نموذج

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

القوارض العمل نموذج القلب لدراسة أداء عضلة القلب واستهلاك الأوكسجين

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

تصور المراحل المبكرة من البلعمة

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.