NIH R01 CA121258、R01 CA125244、R01 CA154256、NIH / NCATS UCLA CTSIグラント番号UL1TR000124、USAMRMC W81XWH-08-1-0734、およびジョアンS.ホームズ記念研究基金によって部分的にサポートされている。 MJHとGCOはUCLAのジョアンS.ホームズ記念ポストドクトラルフェローシップからサポートされた。 www.creative-sci.com：CSM装置を創造科学的方法から得られた。レンチウイルスベクターは、CURE / P30のDK041301でサポートされているUCLA​​のベクトル·コア、から受信されました。

1.スライドさせて準備<ol><li>滅菌パウチに細胞沈降マニホールドのスライドを挿入し、オートクレーブテープで密封する。井戸のプラスチック製の堆積物を回避するために、ポーチのスライド紙側のテフロンコーティングされた側に直面しています。 </li><li> 121℃で15分間オートクレーブパウチ。 </li><li>無菌の150×15ミリメートルの滅菌ペトリ皿にバイオセーフティキャビネット及び場所内部の滅菌袋からスライドを削除します。 4スライドまで一品ごとに収めることができます。スライドの隣に35×10ミリメートルペトリ皿を置きます。加湿を提供するために、滅菌H 2 O 2〜3mlのを追加します。 </li><li>ポリ-D-リジンプレコートスライドを、100μg/ mlのウェル全体をカバーするために十分な容量を使用することによって。 RTで1時間後、この溶液を吸引し、ウェルの表面上に1×PBSをピペットでよく二回の表面をすすぐ。 </li><li>必要に応じて、より強力な腫瘍細胞の接着を確実にするために、フィブロネクチンまたは他のECM成分を追加する。十分なボリュームTHA中5μg/ mlのフィブロネクチンを追加ウェルを、室温で短時間に乾燥させないであろうトン。 <ol><li> 1時間後、残りのソリューションを吸引し、ピペッティング1X PBSで二回洗浄します。 </li></ol></li><li>腫瘍はめっきの準備ができるまでウェル上にPBSにしてください。使用して、同じ日にスライドします。 </li><li>所望の接着性の腫瘍細胞型のコンフルエントなフラスコを収穫する。 10％ウシ胎児血清（FBS）と適切に緩衝成長培地たとえば5×10 6細胞/ mlで、ダルベッコ最小必須培地（DMEM）で光学顕微鏡を再懸濁することによってトリパンブルー色素排除を使用して生存細胞を計数、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム。 </li><li>付着性細胞集団の蛍光イメージングが所望される場合、重要な蛍光色素または製造業者によって提供されるプロトコルに従って、細胞増殖色素で接着細胞集団を標識する。 </li><li>スムーズにWEL内の気泡を作成しないように注意しながらスライドの各ウェルに完全培地を10μlピペットlsは、このような均一な腫瘍細胞の付着を防ぐことができる。 </li><li>各ウェル（ 図1A）内の培地に2.5〜5.0×10 4細胞（細胞懸濁液5~10μl）を加える。腫瘍細胞のタイプおよび所望の成長の日数に応じて最適な数を調整する。より大きな腫瘍細胞または急速に成長している細胞は、最初は少ない細胞を必要とするかもしれない。細胞の均一な分布を確実にするために、上下の媒質とピペットを追加することによって、40μlの、最大ウェル容量を持参。 </li><li>全てのウェルを播種された後、腫瘍細胞は、室温で付着させ、次いで、150×15mmのペトリ皿に蓋を配置し、慎重に37℃で少なくとも24時間/ 5％CO 2の加湿インキュベーターに皿を動かす。 </li><li>毎日の培養液を変更します。慎重に単層から使用済み培地の一部をピペットで、新鮮な完全培地と交換してください。 注：蒸発するので、より多くのボリュームを取り出したよりも追加する必要があります。ウェルズは、アッセイのために準備ができても、confl細胞のuent層が存在する。これは1〜3日最初の播種後に、通常である。 </li><li>ステップ1.4で説明した単層が望まれる場合、手順2に進み、または単層からECMタンパク質を抽出するために、以下の1.13ステップのいずれかとして、PBSで軽く一回単層を洗浄します。 </li><li>完全培地中0.5％のTriton-X（v / v）の溶液を作製し、各ウェルに30μlを添加する。単分子層は、上述したように、ピペッティングにより完全培地で2回洗い、次いで、2分間フードダイジェストう。 NOTE：ECM層は光学顕微鏡（ 図2）で見ることができる。すぐにスライドを使用するか、または1〜2日間の加湿CO 2インキュベーター内で完全培地中で維持する。井戸を乾燥させないでください。 </li></ol>スライド上に非接着T細胞の2沈降<ol><li>非付着性細胞集団の蛍光イメージングが望まれる場合、そのようなCFSE、セルトラッカーレッドCMPTX、またはeFluorとして、重要な蛍光色素との非接着細胞集団を標識アッセイの前に、製造業者は、少なくとも1時間により提供されるプロトコルに従って、670。あるいは、ウイルスベクターによってコードされる蛍光タンパク質を発現するように細胞を操作する。 </li><li>上記1.2に記載されるようにオートクレーブポーチに細胞沈殿マニホールドオートクレーブ。 </li><li>生物学的安全キャビネット内のインキュベーターと場所からテフロンコーティングしたスライドを含む加湿チャンバーを削除します。 </li><li>上下にピペッティングすることによって1×PBSでウェルを洗浄し、その後、少なくとも10％血清を含む完全培地45μlを添加する。 </li><li>滅菌エンベロープからマニホールドを取り外し、慎重にスライドします（ 図1B）の底部に接触しマニホールドの最後に「フック」まで、井戸の上でスライドさせます。 </li><li>培養培地は、チャネルのそれぞれに表示されていることを確認してください。何も見られない場合は、マニホールドを脱いでも対応する、より多くの媒体を追加し、その後交換して、再度確認してください。 </li><li>各ちゃんを繰り返しステップ2.5チャンネルマニホールドの、または多数のウェルに所望される。 </li><li> 1.0-2.0×10 5 /μLを下回らない非接着細胞を再懸濁を数える。細胞の1μLを策定し、ゆっくりチャネル（ 図1C）にそれらをピペット。よく目的のそれぞれについて、これを行います。 </li><li>チャンネル内の細胞が落ち着くことができるように20〜30分間のバイオフードの内側、 すなわち 、マニホールドやスライド、セル全体ロードされた装置のままにしておきます。 </li><li>細胞を乱さないように、局所的に井戸の中央に播種し、両端に触れ、ゆっくりとまっすぐスライドから、それを持ち上げてマニホールドを取り外します（ 図1D）。 </li><li>非接着細胞が正常にうまくマニホールドチャンネルの円周内に留まるの中心で播種されたことを確認するために、各ウェルを点検。非接着細胞は、理想的にはわずか従って穏やかに細胞ペレを引き起こさないの周りにスライド移動する、単層またはECMに、互いに付着する分散させるトン。スライドをモーターボーないでください。 </li></ol> 3.蛍光顕微鏡<ol><li>沈降が確認された後に適切な実験装置では、撮像を行う。理想的には、CO 2、湿度室が装備されている顕微鏡を使用しています。低電力、 すなわち 、4X、または10Xの画像、ウェルの全体を見ることができるように、複数の画像より広い領域を撮影することを可能にする。 </li><li>画像キャプチャソフトウェアを使用してデジタル画像を取得する。明視野および/またはマルチチャネル蛍光画像化を行う。 </li><li>必要に応じて、一定の面積以上の異なるチャンネルに画像を記録する、または、加湿、37℃/ 5％CO 2インキュベーター内でスライドを維持し、手動で（ 図所望の時点で、イメージに取り出すことタイムラプスを設定長い時間点に推奨1E＆F、）。 </li></ol> 4.分析と表示<ol><li>画像編集ソフトウェアを使用して、光をマージとfl1層への蛍光増像ので、複数の細胞型およびマーカーは、同じ画像で見ることができます。ドラッグアンドプログラムに個々の色の画像ファイルをドロップして、プロンプトが表示されたときに、複数のレイヤーを持つ画像ファイルを作成するには、「レイヤーの追加」オプションを選択します。 <ol><li>より高い倍率では、取る合わせ、デジタルでよく一緒に渡って画像をステッチ。二つの画像の保存領域を見て、完全な画像が生成されるまで、他の上に一つの画像を重ね合わせることによって、ファイルの位置を合わせます。 </li></ol></li><li>個々の細胞が移動した距離を決定するためにキャプチャソフトウェアを使用して取得時に画像へのミクロンバーを追加します。 </li><li> 、様々な時点で細胞遊走を決定する蛍光T細胞凝集または経時的に広がるを定量化するために、 すなわち、イメージソフトウェア、ImageJを用いて表面強度の蛍光マップを作る。 <ol><li>表面プロットを生成するには、ステップ4.1でとレイヤーウィンドウの下に生成された層状の画像を取ること、所望のチャンネルに対応したものを除くすべてのレイヤーをオフにします。サーフェスプロットは、EMDの発現を可視化することが望まれる場合、インスタンスの場合は、このマーカーに使用するフィルタに対応する唯一の「グリーン」の層が見えるはずです。 </li><li>画像を平らにし、識別されたファイル形式で保存（ 例えば 、.pngの）とプログラムにイメージをロードします。表面プロットを生成するには、8ビットに画像の種類を変更するバックグラウンドを低減するために、必要に応じて明るさ/コントラストを変更し、「/表面プロットを分析する」オプションを選択します。 図5の画像は、「日陰」、「軸を描く」、「Oneポリゴン毎のライン」、および「滑らか」のチェックボックスをチェックすることによって作製した。 </li><li>また、時間ゼロで焦点セル預金からの半径または直径を使用して測定を行うと、異なる時間に、最も外側の点で細胞に比較します。テフロンウェルの直径は6.0 mmである。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fascin+in+the+migration+and+invasiveness+of+malignant+glioma+cells.">The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells.</a> Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).</li><li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays.">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37 (2), 208-215 (2005).</li><li>Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+in+human+astrocytoma+migration+and+proliferation+studied+in+a+microliter+scale+assay.">The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay.</a> Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).</li><li>Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+membrane+cytoskeleton+cross-linker+ezrin+in+medulloblastoma+cells.">The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells.</a> Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).</li><li>Berens, M. E., Beaudry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+monolayer+cell+migration+assay.">Radial monolayer cell migration assay.</a> Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).</li><li>Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+human+astrocytoma+migration.">Determinants of human astrocytoma migration.</a> Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).</li><li>Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+attachment+and+morphological+differentiation+in+a+pheochromocytoma+cell+line+and+embryonal+sensory+cells+by+the+extracellular+matrix.">Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix.</a> Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Hickey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+preclinical+study+findings+to+protocol+design:+translational+studies+with+alloreactive+CTL+for+gliomas.">Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas.</a> Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).</li><li>Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-shot,+multicycle+suicide+gene+therapy+by+replication-competent+retrovirus+vectors+achieves+long-term+survival+benefit+in+experimental+glioma.">Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma.</a> Mol Ther. 12, 842-851 (2005).</li><li>Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+a+tagged+chimeric+gammaretrovirus:+identification+of+novel+cis-acting+elements+that+modulate+splicing.">Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing.</a> J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).</li><li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+phases+of+distribution+and+tumor+targeting+by+T+cell+receptor+engineered+lymphocytes+inducing+robust+antitumor+responses.">Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).</li><li>Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-dependent+homotypic+aggregates+regulate+CD8+T+cell+effector+function+and+differentiation+during+T+cell+activation.">ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation.</a> J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).</li><li>Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+extracellular+matrix+from+sectioned+human+tissues.">3-D extracellular matrix from sectioned human tissues.</a> Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).</li><li>Prevention, C. f. D. C. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Alstergren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+directed+migration+of+murine+neutrophils+is+dependent+on+cell+surface+expression+of+CD44.">Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44.</a> Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).</li><li>Zhang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+antigen+precursor+protein+profiles+of+adult+and+pediatric+brain+tumors+identify+potential+targets+for+immunotherapy.">Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy.</a> J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

単一細胞懸濁液中の腫瘍細胞を、テフロン（登録商標）マスクされたスライドのウェルにピペットで入れた。細胞が付着させ、次いで加湿した5％CO 2、37℃インキュベーター（ 図1A）で単層を形成した。単層から派生設立単層またはECMタンパク質は、これらのアッセイ（ 図1B）のために収穫することができた。 EMDをコードするベクターを用いて重要な蛍光色?...

ラジアル単層細胞遊走アッセイは、本来細胞外マトリックス（ECM）タンパク質5-7またはフィブロネクチンまたはラミニン1,2のような個々のECM成分でコーティングされたスライド上に付着した腫瘍細胞1-4の浸潤特性を測定するために開発された。技術は、ステンレス鋼、細胞沈殿マニホールド（CSM）を使用して、ウェルの中心における腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を播種関わる。沈降した後、腫瘍細胞がウェルの底に付着すると、経時的な最初の細胞集団の直径の変化は、水平運動の速度を確立するために使用した。ラジアル単層細胞遊走アッセイは、細胞のインビトロ渡り鳥の能力をアッセイするトランスウェルプレートを採用し、他の既存の方法より視覚的な利点を提供した。これらのアッセイは、イメージング8非資する。同様に、それはまた、時点の選択の自由度を多量に提供移行が、評価される時点の数に制限して、研究者が沈降した後の画像に選択することができるときだ。 移行する能力は、特に免疫療法の領域、またはどこにウイルスベクターのための送達ビヒクルとして使用することができる、非接着細胞のために重要な機能であるため、我々は、非接着性細胞の遊走を評価するためにCSMを使用するように適合ECMタンパク質に加えて、腫瘍細胞の単層上型。顕微鏡的に、または個々のECMコンポーネントの腫瘍から単離された複雑なECMに、生存腫瘍細胞単層上の非付着性細胞の遊走を可視化するという追加の利点は、このアッセイは、汎用性になる。シングル細胞外タンパク質でコーティングしたウェルを採用するアッセイは正確に細胞が生体内で通って移動したいのECM組織基質または腫瘍を反映するものではありません。 ここでは、主要なhistocompに感作、アロ反応性細胞傷害性Tリンパ球（alloCTL）を使用一方向混合リンパ球腫瘍細胞反応（MLTR）または私達の代表的な非付着性の細胞型などの混合リンパ球反応（MLR）9を使用して、複合体（MHC）タンパク質atibility。我々は両方のヒトおよびマウス由来の細胞をテストした。移行が腫瘍単層上で測定したところ、採用された腫瘍細胞は部分的に関連する標的は、MHC分子の完全なセットのエフェクター、または完全に関連する標的を、感作するために使用される細胞集団に見られるのと同じMHCタンパク質の一部を表示し、あったことエフェクターは、向かって感作されていた。いくつかの実験では、エフェクター細胞および標的細胞を区別するために、蛍光CellTrackerレッドCMPTXまたは細胞増殖色素eFluor 670を使用する。我々はまた、細胞を可視化するための追加の方法などの蛍光タンパク質のためのウイルスベクターのエンコーディングで形質導入を使用していました。特定のアッセイのために、私たちはエメラルドグリーン（EMD）蛍光タンパク質10,11をコードするレトロウイルスの複製ベクター（RRV）でalloCTLを形質導入した。 OTH用ERSは、腫瘍細胞をmStrawberryをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。 alloCTLは、腫瘍細胞単層から回収した腫瘍細胞の単層またはECMのいずれかの中心にマニホールドのチャネルを介して播種した。接着性および非接着細胞の相互作用は、光によって、および/または経時的な蛍光顕微鏡によって可視化した。ハイパワーで断片化した核を有する低電力での腫瘍細胞の単層、または腫瘍細胞の混乱は、それぞれ、溶解およびアポトーシスによる細胞傷害の指標であった。我々は、デジタル的に、単層培養上の非付着性蛍光T細胞の遊走を示す表面強度の蛍光マップを作成した。我々はまた、細胞傷害性がオーバーレイ非接着alloCTLのクラスターを形成した後に接着性神経膠腫細胞の単層に生ん留意。同様に、神経膠腫の単分子層へalloCTLからRRV-EMDの水平伝達が観察された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:239px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Teflon-masked microscope slides</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Cell Sedimentation Manifold</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 150mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 35mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">20 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:239px;">89003-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Distilled, deionized water (sterile)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-054-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Celltracker Red CMPTX</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">TrypLE Express (optional)</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Tumor cell culture media (e.g. DMEM)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">AIM-V serum-free media</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">12055-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:203px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:239px;">FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">SPOT Advanced</td>
			<td style="width:203px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td style="width:239px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:239px;">354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td>
			<td style="width:203px;">Crosstex</td>
			<td style="width:239px;">SCXS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Cell Proliferation eFluor 670</td>
			<td style="width:203px;">eBioscience</td>
			<td style="width:239px;">65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radial mobility and cytotoxic function of retroviral replicating vector transduced, non-adherent alloresponsive t lymphocytes

まず、蛍光標識、非接着性ヒトまたはマウスエフェクター免疫細胞の運動性を測定するために、細胞外マトリックスタンパク質に付​​着した腫瘍細胞の半径方向移動を測定することが報告され、ラジアル単層細胞移動アッセイの新規適応を報告する。この技術は、ステンレス鋼製マニホールドと10ウェルテフロンスライドが局所的にコンフルエント腫瘍細胞単層または細胞外マトリックスタンパク質のいずれかを用いて調製したウェルに非接着T細胞を堆積するために使用する。光および/またはマルチチャネル蛍光顕微鏡は、経時的にエフェクター細胞の移動および動作を追跡するために使用される。蛍光色素および/または蛍光の導入遺伝子のためのコードは、示差的イメージングのための細胞型を標識するために使用されるウイルスベクター。この方法は、スライドチャンバー、寒天またはトランスウェルプレートを利用して、水平または垂直の遊走/浸潤を追跡するインビトロアッセイにおいて同様の型と区別される。アッセイは、詳細な撮像データをbを可能にする特定の蛍光マーカーで区別異なる細胞型で集めE;細胞（ すなわち 、形質導入し/形質導入された）であっても、特定の亜集団を監視することができる。表面強度の蛍光プロットが移行細胞型に対応する特定の蛍光チャネルを使用して生成される。これは、特定の時間に非接着性免疫細胞の移動性の良好な視覚化を可能にする。それは同様に、標的細胞へのエフェクターのようなウイルスベクターの細胞毒性または転送などの他のエフェクター細胞機能の証拠を収集することが可能である。したがって、この方法は、研究者が微視的に様々な種類の接着性細胞を示差的に標識され、非接着性の細胞間の相互作用を記録することができる。このような情報は、機能の視覚的な証拠は、癌治療のためのそれらの使用の前に腫瘍標的細胞に所望される生物学的に操作されまたは活性化免疫細胞型の評価に特に関連し得る。

蛍光タンパク質をコードするウイルスベクターに加えて使用することができ、または代わりに、蛍光染料。ウイルス形質導入は、運動性アッセイの前に行われるべきである。接着性および非接着性細胞型の両方の差動標識することができる。形質導入のためのプロトコルが使用されるベクターのタイプに依存する。ここでは、12に記載のプロトコルを用いたアッセイに先立って?...

Watch this Scientific Journal Video about Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes at JoVE.com

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K ビュー.  UCLA David Geffen School of Medicine. We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality. 

ビデオ: Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...