このプロトコルは、マクギニスラボ、キムA.メイスとヨセフC.ピアソンの以前のメンバーと共同で開発されています。私たちは、貴重な株式を整理し、配布するための自​​分の仕事のためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターの継続的な努力に感謝します。この作品は、国立衛生研究所（R01 GM077197およびK12 GM68524）とハーバート·スターンの家族からの資金によってサポートされていました。 MTJは現在、少数の健康と健康格差の国民の協会からの研究資源のための国民の中心および認可番号8G12MD7603-27からの助成金番号5G12RR003060-26でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも少数の健康と健康格差や国立衛生研究所国立研究所の公式見解を示すものではありません。

ショウジョウバエ胚性創傷プロトコルは、5つのステップに要約することができる：（1）胚収集、（2）胚の調製（3）胚負傷（4）胚のマイクロインジェクション、および（5）胚固定。 1。胚コレクション<ol><li> 2〜3日後にeclosing、大人のハエを集め、胚収集ケージに50人の女性と25人の男性を追加します。 </li><li> 3日間、毎朝、新鮮なリンゴジュース寒天プラス酵母プレートを置きます。 （注）25℃のインキュベーターで12時間昼間のスケジュールで最適な胚収集、サイクルのためのハエ（17:00ライト「OFF」「ON」5時点灯）、女性のハエは、明サイクルの変化に対応し、光を&quot;OFF&quot; 10,11 &quot;ON&quot;ラ ​​イトから切り替え中の卵の大きな数量を堆積する。 </li><li>デイ3の午後には、ケージの新鮮なリンゴジュースを加えた酵母寒天プレートを配置し、2時間の胚を収集します。ケージに新しい酵母プレートを配置し、保存2時間の回収プレート。 </li><li>胚を熟成25℃でさらに14時間回収プレートを保管してください。 注：創傷治癒はショウジョウバエの開発中にどの段階でアッセイすることができるが、このホワイトペーパーで説明した損傷誘発性の転写レポーターは、ステージ15〜16 12の間で最適な活性を有する。後期17で、胚は簡単に成熟キューティクルを貫通し、効率的に創傷の記者をアクティブまたは創傷誘導性転写を検出するにはあまりにも古いです。収集時間とピークラボ時間中に発生する創傷時間を確保するために、我々は2時間（16:00〜18:00）のための胚のコレクションのスケジュールに従う、18:00に新しいプレートとコレクションプレートを交換し、年齢コレクション·14時間（一晩）25℃でプレート、08:00（翌日）の胚を取った。 </li></ol> 2。胚の準備注意事項：このプロトコルは、シャープで多くのツールと​​オブジェクトの使用を含むまたはGで作られた小娘。けがをしないように注意して、すべての鋭利とガラスのオブジェクトを処理します。 <ol><li>優しくプレートおよび旋回2-3 mLの水を添加することにより、絵筆を持つコレクションプレートから胚を取り出します。ナイロンメッシュとコレクションチューブにプレートから水や胚を移す。 </li><li>プラスチックシャーレプレートのキャップに漂白剤4〜5 mlを添加し、2分間の漂白剤で胚を含むコレクションチューブのメッシュカバーの端を浸し、胚の外側の卵殻を除去する。手動でコレクションチューブを漂白剤にに凝集から胚を防ぐために、数回回転させます。水10倍で胚を洗浄し、ペーパータオルの上絨毛膜を除去した胚を含むメッシュカバーコレクションチューブを乾燥させます。 </li><li>寒天プレートにナイロンメッシュから〜50胚を転送するために解剖針を使用してください。私たちは、胚の位置合わせのコントラストや助剤を添加する寒天プレートに緑色の食品着色料を追加します。解剖顕微鏡下で、エンブリーを揃える、〜25胚の2列を作るスライド上のOSそれらはマイクロインジェクション装​​置上の穿刺針に対して直角になるように。ガス交換の目的での胚の間に小さなスペース（約1胚の長さ）のまま。 2列は離れて約5ミリメートルである必要があります。 </li><li>整列胚の上に両面接着テープでスライドを置き、慎重にスライドに緑のプレートから胚を転送するスライドを押してください。次いで、空気胚を乾燥〜25分間胚の内部の圧力を低下させ、創傷時バーストを防止する。 </li><li>さらに脱水を防ぐために、胚の上にハロカーボンオイルミックスの2〜3滴を配置します。 </li></ol> 3。胚創傷は<ol><li>注射顕微鏡ステージにおける胚のスライドを配置します。視野内の胚を見つけ、倒立顕微鏡のステージを移動練習。 注針で作業を始める前に、背腹軸に沿った胚の中央面に焦点を当てています。の効率的な創傷を可能にするために整列胚は、針装置に近い行を負傷させ始める。視野内に整列された胚の行の上端を持って、ステージを移動します。 </li><li>慎重に配置して、針ホルダ引き込ま針を固定します。スライドに向かって針を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。同じ焦点面に、胚と針の位置を合わせます。針は胚に焦点が合っていると、マイクロマニピュレータで針を移動しないでください。 </li><li>行の次の胚に移動して、根っから胚を穿刺する段階を移動します。最初の行が負傷し終わったら、スライドを移動する前の段階から持ち上げて完全に針を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用して、手動でスライド180°回転し、二行目を取った。 </li><li> （プロシージャのステップ5を参照）を室温でハロカーボンオイルの下で胚を保存し、in situハイブリダイゼーションまたは抗体染色でやっている場合、胚の固定を進める。代わりに、4〜6時間の胚を保存するハロカーボン油の下および創傷転写蛍光レポーターの可視化（代表的な結果）に進む。 注：蛍光レポーターの可視化のために、我々は50％の1 -フェノキシ-2 -プロパノール13を用いて胚を麻酔する。胚はハロカーボン油から除去し、新しいスライド上に配置されている。我々は、胚の周りにガラスビーズを置き、麻酔を数滴を追加し、胚にカバースリップを配置。 </li></ol> 4。胚のマイクロインジェクション注：我々は、プロトコルで使用するマイクロインジェクション装​​置は、アッセイ中に特定のボリュームを提供するために自動化されていない。我々はマイクロインジェクションを視覚化し、配信ボリュームを正常化しようとするソリューションに染料を追加します。あまりにも多くの溶液を胚に注入されている場合は、卵黄膜が破裂します。 <ol><li>化学溶液を加えた色素の1μlのリアからのロード針（ 例えば 0.6 H 2 O 2）。毛細血管を許可する針の先端に薬液を描画する行動。 </li><li>針を破るために、スライドとコートハロカーボンオイルミックスとエッジの角度でカバースリップを配置。角度のついたカバーガラスのエッジに焦点に取り付けられた針を持って、ゆっくりと壊れたまで針の先端間でカバースリップの端を移動します。マイクロインジェクション装​​置に圧力を適用し、化学溶液を加えた染料は、針を流出していることを確認してください。 </li><li>顕微鏡ステージ上に整列した胚を含むスライドを置きます。胚と同じ平面内針を焦点に進みます。同時に穿刺し顕微注入する薬液を加えた各胚に染める。 注：詰まっ針が頻繁に発生し、不完全なマイクロインジェクションを回避するために、新しい針を破る。鈍針の先端のようにきれいに角度のついた針の先端のように巻かれていません。破損の際に非90°の角度にカバースリップを調整すると、角度のついた針の先端を製造することが最適である。 </li></ol> 5。ホルムアルデヒドFiのxation 注意事項：このショウジョウバエの固定に使用される化学物質は有害である。化学薬品を取り扱う際の個人用保護具（ 例えば 、手袋、白衣、および安全ゴーグル）を使用します。規制化学物質の廃棄のための個々の施設のガイドラインに従ってください。 <ol><li>傷に誘導される遺伝子の転写活性化が起こるために負傷した後、15、30、60、またはそれ以上の分を待ちます。注入スライドから胚を削除するには、慎重に、スライドからハロカーボンオイルミックスを排出ラックに対してスライドリーンとキムワイプで終わりをブロット。 </li><li>スライド上でヘプタンをすすぎ、ガラスペトリ皿にリンス液を洗浄するためにガラスピペットを使用してください。ヘプタンは、テープを溶解し、胚をリリースする予定。すべての胚をスライドから除去されるまで洗い流し続ける。すべての胚をスライドから除去されるまで、次のスライドに進みます。 </li><li> 20ミリリットルSCIにガラス皿からヘプタンを加えた胚ソリューションを転送ntillationバイアル。 2〜3分間バイアルを振る、ヘプタンを除去し、新鮮なヘプタン5ミリリットルを追加。 </li><li>新鮮な固定液を5ミリリットルを追加します（レシピのための試薬のリストを参照）。バイアルに蓋をし、軌道プラットフォームシェーカーに接続します。 220〜230 rpmで25分間胚を含むバイアルを横に振る。 </li><li>振盪後、インタフェースのポップで泡をしてみましょう。完全に胚を引き上げ避け、下、ピペットを用いて水相を除去します。底部層は、固定液で構成され、適切に配置されるべきである。 </li><li>メタノール5ミリリットルを追加するバイアルにキャップをして、20〜30秒間、手でよく振る、スワールやベンチの上に置きます。負傷した胚は、間に滞在し、底に沈むことはありません。 注：固定後無傷の胚の卵黄膜は、通常、メタノールと脱水工程中に破裂します。しかし、負傷した胚における卵黄膜は、すでに分割され、脱水工程は、卵黄MEMBは削除されませんRANE。手devitellinzationは固定プロトコールを完了するために必要です。 </li><li>慎重にトップヘプタン層を除去した後、新鮮な5mlのメタノールを加える。バイアルを振る、胚をシンクする必要があります。 </li><li>ガラス転移ピペットを用いてメタノールプラス胚溶液を除去し、ガラス皿にナイロンメッシュコレクションチューブに集める。 </li><li>メタノールを除去し、1×PBS溶液で胚をすすぐ。 </li><li>リンゴジュースプレートにナイロンメッシュからの胚を転送します。プレートの表面に沿って胚を広げる。 </li><li>ダブル粘着テープガラススライドに胚を移す。 1X PBSで胚をカバーしています。 注：胚が原因卵黄膜の凝集する傾向があります。リンゴジュースの場所を使用すると、凝集した胚の迅速な分離を可能にする。力から胚を除去するために適用されたときに胚を寒天プレートに沈むため、胚をプレートから除去し、両面接着テープをガラススライドに移されなければならない卵黄膜。 </li><li>慎重に卵黄膜を「POP」する解剖針で胚を押してください。胚はPBS中に沈むはずです。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに1×PBSプラス胚を転送するためにガラスピペットを使用してください。 4℃で1×PBSおよびストアとの胚をすすぐエタノールを用いて胚を脱水するために進んでください：PBSシリーズ、in situハイブリダイゼーションや免疫局在プロトコル14 で続行します。 </li></ol>

<ol>
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利害の対立が宣言されていません。

外部の合図にすぐに転写調節応答は、細胞がストレス、損傷、または感染を含むことができ、細胞外刺激に対する局所的な応答を調整することができます。ローカライズされた応答の不適切な制御は、傷害を修復するために有害な隣接セルへの影響だけでなく、資源の無駄を持つことができます。 ショウジョウバエの胚は、安価で容易な保守のモデル生物で、基本的な創傷治癒実験を行うための優れたシステムを提供します。他のモデル生物の研究とショウジョウバエの間のコラボレーションの可能性は、多くの生物学的な質問を探検するユニークな機会を提供します。 創傷レポーターの付加的な技術は、表皮の創傷応答経路の活性化に新しい遺伝子の寄与を試験するための効率的な方法を提供し、突然変異体の遺伝的背景を組み合わせたものである。我々は、表皮の創傷誘発性の転写レポーターがAV持って2 回目と3 回目の染色体5の両方でailable。本研究では、UAと過剰発現16のGAL4システムを使用しています。致死突然変異対立遺伝子を用いた研究のために我々は蛍光バランサー染色体、 例えばクルッペル GFP 17を使用して遺伝的背景を決定する。我々は、いくつかの遺伝的背景（ 表1）に巻かれたレポーター局在を解析した。 技術の可能性のある変更は、マイクロインジェクションおよび創傷を組み合わせることである。マイクロインジェクションは、胚への薬液を導入するために使用することができる。いくつかの化学化合物が試験されており、表皮の創傷レポーター9の活性を調節することが見出された。同時創傷およびマイクロインジェクションのこの方法は、創傷信号に応答し、直接18を創傷後の遺伝子発現変化をモニターするために使用することができるショウジョウバエ胚における細胞の数を増加させるために有用であり得る。マイクロインジェクション技術の将来の応用は、表皮創傷応答の調節のための新規な化学物質を試験するであろう。 遺伝子研究のためのモデル系として、ショウジョウバエを効率的に複雑な問題に対処するための簡単なプロトコルを幅広く提供しています。 ショウジョウバエの技術の実現可能性に関する最近の報告では、さらにショウジョウバエ研究者コミュニティの影響を拡大する手段として、血球移行19と寄生蜂感染20の使用を強調しています。傷の修復の研究に加えて、 ショウジョウバエ成虫ディスクシステム21,22と再生のための古典的なモデルを提供します。成虫椎間板再生研究やパンク/マイクロインジェクション負傷中の組み合わせの進歩は、組織修復のよく保存されたコ​​ンポーネントを発見するための優れたシステムを提供します。

マイクロインジェクション技術を用いて、 ショウジョウバエの胚の操作は、十分に確立されたアッセイの1である。表皮創傷応答レポーター法の重要性は、蛍光リポーターでパンク/マイクロインジェクションのためのプロトコルを組み合わせて、 ショウジョウバエの胚における表皮損傷に対するin vivoでの応答を視覚化することです。このメソッドの目的は、表皮の穿刺損傷に対する転写応答を制御するプロセスを調査するツールとしてショウジョウバエを使用するために科学者のより広範なセットを有効にすることです。 ショウジョウバエの単層、表皮、穿刺負傷2の後に表皮の創傷応答を研究するための簡単なシステムを提供します。 ショウジョウバエの胚は、遺伝的に創傷応答、炎症、および再上皮3を含む、創傷修復の段階を分析する堅牢なモデル系である。多くのまたはほとんどの接合体変異体はembryogenesの最後に生き残るため、これは一部にはあるで、発達パターニングが深くゆがんで行く場合でも、表皮の障壁を開発しています。 GRH-標的遺伝子ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）およびチロシンヒドロキシラーゼ（PLE）は転写的傷害4部位を中心に活性化することが確認され、よく保存された転写因子粒子の粗いヘッド（GRH）、以前のキャラクタリゼーション。 ショウジョウバエ創傷応答のためのモデル生物として哺乳動物の創傷治癒5の研究を進めるために、調査の補完的なラインを提供しています。その後の研究では、追加のショウジョウバエの創傷誘導される遺伝子を同定し、6が負傷きれいにするin vivoでの表皮創傷応答を監視するために、多くの蛍光創傷記者の「ツールキット」を開発しました。 ショウジョウバエ創傷治癒の調節に関する最近の報告では、細胞遊走を調節する多くの7,8経路の発見を可能にする、創傷閉鎖表現型に焦点を当てている。の分析を蛍光創傷記者が、私たちの研究では、表皮の傷誘導性遺伝子9の局所的な発現に必要な遺伝子の新規のセットを同定した。創傷応答レポーター方法の利点の一つは、結果は、信号が隣接セルへの損傷部位から形質導入されるかの機構により多くの洞察を提供することである。しかし、創傷応答レポーター方式のデメリットの一つは、結果が直接、創傷治癒や修復に表現型にリンクしていないということです。遺伝的および化学的な画面できれいな創傷穿刺プロトコルの広範な使用は、転写応答の新たな規制当局が特定することが負傷表皮および傷害治療の哺乳動物モデルに発見創傷治癒の翻訳を促進することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

ショウジョウバエ胚は、両方とも厳しい外部環境から内部の細胞を保護するだけでなく、細胞の恒常性を維持するのに役立つ堅牢な表皮層を現像する。ガラス針で穿刺損傷は生きている胚または幼虫に局在レポーターシグナルで可視化することができる傷の転写レポーターを活性化し、迅速な表皮、創傷応答を誘発する直接的な方法を提供する。パンクやレーザー損傷はまた、創傷部位に血球の動員を促進する信号を提供する。胚を穿刺サイトから血リンパの即時漏れを最小限に油媒体中に注入されると、このような負傷の胚の90％以上が成人期まで生き残るように驚くべきことに、後期胚における重度（根っから）穿刺損傷はまれにしか、正常な胚発生を破壊しない。傷手順はAG上胚の手動アラインメントを含むショウジョウバエの胚の顕微操作を、必要としませんARプレートやスライドを顕微鏡に整列胚の移植。 ショウジョウバエ上皮創傷応答アッセイは、創傷治癒、ならびに創傷治癒を促進する潜在的な化学的化合物をスクリーニングする方法を促進する生物学的機能の種々の遺伝的要件をテストするための迅速なシステムを提供する。短いライフサイクルと簡単に培養ルーチンは、 ショウジョウバエの強力なモデル生物にする。 ショウジョウバエクリーンな創傷治癒には保存された調節を見つけるための優れたシステムを提供し、調査中である方法で、自然免疫応答、、で、表皮再生応答を調整するために表示されますショウジョウバエや哺乳動物の表皮創傷に共通するメカニズム。

この方法に示す結果を得るために、緑色蛍光タンパク質（GFP）のオープンリーディングフレームは、 ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）からのプロモーター/創傷誘導性エンハンサー配列に融合されたDsRedは、（ チロシンヒドロキシラーゼから創傷エンハンサー配列に融合されているPLE）4,6。ライブショウジョウバエ胚において、蛍光創傷レポータータンパク質の成熟は、最適な4-6十分なタンパク質の蓄積のための時間を視覚化することを可能にする創傷後時間、だけでなく、蛍光状態15に酸化する蛍光タンパク質のための時間です。レポーター局在を観察するために、化合物蛍光顕微鏡で十分である。レポーター局在の高倍率を観察するために、共焦点顕微鏡は、複数の光学切片の最大投影（ 図1）を生成するために最適である。 ショウジョウバエの胚のin vivoイメージング共焦点は、RAによって複雑になる胚のPIDうねり。 。胚の完全なビューは、20X対物レンズを得ることができ、創傷部位の拡大図は、40X対物レンズを用いて得ることができる。表皮創傷レポーター局在の上面図は、連続する101μmの光学切片を用いて画像化することができる。表皮創傷レポーター局在の横図40は、連続1μmの光学切片を用いて画像化することができる。 標準的な遺伝子交差方法を使用して、それが遺伝子変異を創記者を組み合わせることが可能である。本論文で提示つの例は、 フロティリン-2（FLO-2）であり、なぜなら機能喪失（P因子の挿入で生成ヌル対立遺伝子）および機能獲得（過剰発現は全ての細胞に遍在する表現で生成される）の変異株FLO-2フロー-2遺伝子産物は、レポーター9 Ddcに巻か-GFPの局在化を阻害するのに必要かつ十分で実証する（ 図2Aおよび2B）。マイルを使ってcroinjectionプロトコルは、薬液のsuperactivatesの導入や、創傷記者の局在を阻害するか否かを試験することが可能である。化学的に負傷した胚を同時に負傷し、1％トルイジンブルー染料および可溶化化合物の1:4の比を注射した。トルイジンブルー色素は、体腔内に注入される可溶化化合物の視覚的確認を可能にした。対照胚は、化学せずに、1％トルイジンブルー色素と溶質の1:4の比を含む壊れた針で負傷した。両方の薬液がグローバルに十分であるので、この論文で提示つの例は、DDC-GFPの局在9（ 図2Cおよび2D）レポーター創傷活性化、過酸化水素（H 2 O 2）、メチル-β-シクロデキストリン（MβCD）である。過酸化水素（H 2 O 2）2 O M.メチル-β-シクロデキストリン（MβCD）0.6は1メートルに可溶化したHで希釈した3 mmまでのNaOH。胚の固定プロトコールを用いて、創傷部位の周囲の、ローカライズされたドメインに巻か応答遺伝子の転写活性化を検出することができる。本論文で提示一例DDCはとPLE転写物4,6,9（ 図3Aと図3B）を検出するためにRNAプローブのin situハイブリダイゼーションである。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> 図1。 DDC-GFP及びPLE-DsRedのは、（B）は（A）DDC-GFP巻かレポーターのトップビュー。負傷野生型の胚で記者ローカリゼーション。明と蛍光像を巻か PLE-DsRedのトップビューは、レポーターを取った。全ての画像は、20X対物レンズで、ライカSP2共焦点顕微鏡で収集した。矢印は、創傷部位をマーク。 [データ]パネルの破線Sは、胚の輪郭をマークします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> 図2。遺伝的変異体背景や化学微量注入した胚。明と負傷フロティリン-2（FLO-2）変異胚の蛍光画像におけるDDC-GFP巻かリポーターの局在。（A）の機能喪失FLO-2 {KG00210}の変異体、すべての表皮細胞全体のレポーター活性の膨張（B）の機能獲得フロー-2（アルマジロ-GAL4、UAS-Flo2）変異体、すべての表皮細胞全体のレポーター活性の阻害。（C）過酸化水素（H 2 O 2 ）ソリューションマイクロインジェクション、REPの拡大すべての表皮細胞全体orter活動。（D）メチル-β-シクロデキストリン（MβCD）ソリューションマイクロインジェクション、すべての表皮細胞全体でレポーター活性の拡大。全ての画像は、20X対物レンズで、ライカSP2共焦点顕微鏡で収集した。矢印は、創傷部位をマーク。データパネルの破線は、胚の輪郭をマークします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> 図3。創傷応答遺伝子のRNA転写物の検出。傷ついた野生型の胚におけるin situハイブリダイゼーション及びRNAの検出における蛍光画像。DDC（A）及びPLE（B）RNA転写物は、創傷部位の周囲に蓄積する。全ての画像コレクション1だった20Xの目的とライカSP2共焦点顕微鏡、上のテッド。矢印は、創傷部位をマーク。データパネルの破線は、胚の輪郭をマークします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="表1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> 表1。表皮の創傷応答記者の概要。4創傷応答記者（DDC、PLE、MSN、KKV）の挿入は、2番目と3番目の両方の染色体上に用意されています。創傷応答レポーターのすべては、 野生型の背景（ 例えば 、 &quot;ローカル&quot;表現型）の穿刺損傷部位の周囲の表皮細胞の限られた数の蛍光遺伝子（GFPまたはDsRedの）を活性化。DdcにおよびMSN創傷応答記者が探しGRHを必要とするfluorescenの活性化穿刺損傷（ 例： &quot;none&quot;に表現型）の後にCE遺伝子。創傷記者はすべて、穿刺損傷（ 例えば 、 &quot;グローバル&quot;表現型）後の蛍光遺伝子の局在のためにFLO-2が必要です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

非常に後期ショウジョウバエの胚の胚性表皮は、急速な刺し傷応答解析のためのin vivoのシステムを提供し、哺乳動物モデルへの変換のための創傷治癒の研究を進めるために遺伝子操作や化学マイクロインジェクションの治療と組み合わせることができます。

マイクロインジェクションアッセイをキズや<em&gt;インビボ</em&gt;表皮の局在は、応答記者傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.3K ビュー.  The City College of New York. 非常に後期ショウジョウバエの胚の胚性表皮は、急速な刺し傷応答解析のためのin vivoのシステムを提供し、哺乳動物モデルへの変換のための創傷治癒の研究を進めるために遺伝子操作や化学マイクロインジェクションの治療と組み合わせることができます。 

ビデオ: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

生物工学

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

パラメータ化拡張期充満フォーマリズムを経由Transmitral流れの運動学的モデルベースの​​解析によるグローバル拡張期機能の定量化

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

定量的、皮膚が創傷管理のためのコンフォーマルスキンのような電子システムの作製と評価

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

アン<em&gt;インビトロ</emマウス椎間板の&gt;器官培養モデル

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...