本研究は、NIHの助成金（PN2EY016525とP41GM103832）によって支えられてきた。 SHSは湾岸コンソーシアム（NIH認可番号T32EB009379）の学際的バイオサイエンス教育のためのWMケックセンターのナノバイオロジー学際大学院教育プログラムからの交わりによってサポートされていました。 SHSは、解剖し成長し、DRGおよび海馬細胞をガラス化し、低温電子顕微鏡およびDRGと海馬軸​​索の凍結ETデータを収集し、再構成され、チルトシリーズは色注釈付き。 MRGを切開し、MNRの研究室での海馬細胞を提供した。 SCは、チルトシリーズ注釈を支援。 SHSは、神経細胞を分析し、成長する方法についてのCWで訓練された。 SHS、WCMとトイレは実験を考案。 SHSは他の著者からの入力に原稿を用意しました。 このビデオは、TのBiozentrumの細胞イメージングとNanoAnalyticsセンター（C-シーナ）で撮影されました大学バーゼル彼。 C-シーナは、スイスのバーゼルに位置連邦工科大学チューリッヒのバイオシステムズ科学工学部門（D-BSSE）に統合されています。

1。メッキ初代神経細胞のためのEMグリッドの料理を準備する<ol><li>少なくとも25倍の倍率で光学顕微鏡を用いて金のEMグリッド上に穴あきカーボンの整合性を検討する。カーボン穴が&gt; 98％で完全な状態であることを確認してください。 </li><li>一次ニューロンをめっきするため、EMグリッドを火炎殺菌し、同時にそれらを親水性にするブンゼンバーナーを使用しています。その縁ではなく、中央グリッド面積で、EMグリッドを拾うためにピンセットを使用してください。注意：無人点灯ブンゼンバーナーを離れることはありませんし、次の手順を実行している間プラスチック部品に手袋やピンセットを使用していない。 <ol><li>ブンゼンバーナーを点灯する前に、最低限の開いた位置に空気およびガスの調整を設定します。 </li><li>ストライカー火打ち石やブタンライターを使用してブンゼンバーナーを点灯。 </li><li>背の高い、明るい青/紫の炎内の小さな青い内炎を達成するために、空気やガスの調整を変更します。内炎の先端が炎の最も熱い部分である。下のノブバーナーは、バーナーのバレルに入る空気の量を調整するためにオンにすることができるが、バーナーは、バーナー管に入るガスの量を調整するニース。空気調整を時計回りに回すと（紫の炎を生じる）空気を減少させ、反時計回り（黄色の炎を生じる）空気を向上させます。 </li><li>カーボン面を上に直面して、二度の炎をすばやく渡すことは、EMグリッドを保​​持するために金属製ピンセット（NOプラスチック部品）を使用。炭素側はより多くのマット（少ない光沢のある）を表示され、他の側よりも灰色がかった色合いのよりとなります。 </li><li>すぐにブンゼンバーナーの10cm以内に置かガラスボトムディッシュの中央にグリッド（カーボン·サイドアップ）を転送。皿当たり1のEMグリッド（ 図1）を使用します。ガンマ線照射を経由して、すなわち、予め滅菌されたガラスボトムディッシュを、のみを使用しています。 </li></ol></li><li>まだガラスボットの中にEMグリッドを維持しながら（完全なカーボン穴）グリッドの整合性をチェックするために光学顕微鏡を使用して、オム皿（汚染を回避するため）。神経細胞と接触するグリッドか何かで任意の物質を適用する場合は、無菌手順及び滅菌ピペットチップを使用しています。 </li><li>無菌手順を用いて組織培養フードでは、ペトリ皿の中央ガラス面積をじっくりと適切なコーティング物質を250μlを適用します。適切なコーティング物質は、全体のEMグリッドをカバーしていることを確認してください。 <ol><li>海馬ニューロンについては、先に説明したように19を調製したコーティング物質としてポリ-L-リジン（PLL、1 mg / mlの）を使用する。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。後根神経節（DRG）ニューロンの場合は、次のように準備し、コーティング物質として（材料および試薬の表を参照）エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物を使用しています。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。 <ol><li>ストックボトルを解凍4℃で一晩エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物</li><li>氷の上で、それらを維持することによって、すなわち、エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞、溶液を作るために使用されるすべてのコンポーネントが分泌するゼラチン状のタンパク質混合物を、寒さに保つ。 </li><li>氷の上で、1:20希釈を生じる神経基本培地で、このゼラチン状のタンパク質混合物を希釈しながら（ すなわち神経基礎の10ミリリットルにゼラチン状のタンパク質混合物の500μLを希釈）。 </li><li>除算は、1ミリリットルのアリコートにゼラチン状のタンパク質混合物を希釈し、すぐに-20℃で余分な分量を保存する</li><li> 1.4節で説明したように、ディッシュ当たり、EMグリッドごとに250μLを適用します。 </li></ol></li></ol></li><li>そのトップにシャーレをカバーし、組織培養フード内で室温で1時間（どちらかのPLLに伴う海馬の試験片について、またはDRG標本用のゼラチン状のタンパク質混合物で）インキュベートする。 </li><li> ASPI（海馬の試料の場合）すべてのPLLまたは皿から（DRG標本用）ゼラチン状のタンパク質混合物を評価する。これを行うために、組織培養フード内の真空システムを使用する。真空管に取り付け、滅菌ピペットチップを使用してください。 EMグリッドとの直接の接触を避ける。 </li><li>注意深くEMグリッドが完全にPBSによって覆われるように、各ペトリ皿の中央のガラス領域内にEMグリッドに滅菌PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を250μlを適用するために調整可能な空気変位ピペットを使用する。次に、各皿からPBSを吸引除去する。 3回繰り返します。 </li><li> EMグリッドと料理は15分間組織培養フードの下で乾燥させます。彼らは組織培養室内の光学顕微鏡でチェックすることで、完全に乾燥していることを確認してください。水分の泡がグリッドに存在しないことを確認してください。もしそうであれば、慎重に吸引次のEMグリッドにこの余分な水分を除去する。コー​​ティングされたグリッドは、ニューロンをメッキするため、すぐに使用する必要があります。 </li></ol> 2。準備およびP1EMグリッド上に一次ニューロンをating <ol><li>以前に19を説明したように、個々の細胞に海馬（または18日齢のラット胚の後根神経節）を解離させるために一次ニューロンは、まず解剖、トリプシン処理（2.5％トリプシンを使用して）粉砕物をめっきする。 <ol><li>粉末化し、特に火仕上げ先端をガラスピペットを使用することにより、個々の細胞に細胞の解離塊を記述するために神経生物学者によって使用される一般的な用語です。結果は慎重にゆっくりとピペットを介して（〜30）、上下に、複数回のセルを描画し解放することによって達成される。 </li></ol></li><li>マウスに適していますが示唆酵素（パパイン、コラゲナーゼ/ディスパーゼ）を使用するのではなく、ラットDRGニューロンを隔離する（HBSS中）0.25％トリプシンを使用するようにノートを取って、以前にDRGの切開および細胞単離24に記載された手順に従ってくださいDRGニューロン。 </li><li> （ つまり、血球計数器を用いて）単離された神経細胞の数を計算するそしてディッシュあたり50,000個の細胞/ mlの濃度を達成するために、各皿の細胞に適用する適切な体積を計算するためにこの値を使用する。適用する最大音量は250μLです。これが唯一のセントラル硝子エリア全体ではなく、お皿を埋めることに注意してください。 </li><li> 37℃のCO 2インキュベーターで30分間インキュベート皿細胞が回復して接着させる。 </li><li>ゆっくりと、EMグリッドを乱さないように注意しながら、各皿に温めメディアの1.5ミリリットルを追加。メディアの種類は、細胞型（海馬もしくはDRG）に依存する。 <ol><li>海馬ニューロン19又は使用前に37℃の水浴中で加温することにある後根神経節ニューロン24のいずれかのための適切なメディアを準備する。 CO 2インキュベーター内で一晩の料理をインキュベートする。 </li><li>海馬ニューロンの場合は、翌日のメディアを変更してください。 14日間、2日毎以降のメディアの半分を変更します。使用前に37℃ の水浴中で媒体を温める。 </李&gt; <li> DRGニューロン、解剖/メッキ、翌日、別々に、それぞれの10mMストック溶液を作製抗有糸分裂剤（ウリジン5&#39;-フルオロ-2&#39;-デオキシウリジン）とメディアの新鮮なストックを調製するために、最終的に使用それぞれについて、10μMの濃度。 DRGメディア（875μL）の半分を取り外し、抗有糸分裂薬との新鮮な培地875μlを加える。 <ol><li> DRGニューロンでは、第一週を2日おきには、別の抗有糸分裂メディアと標準のDRGのメディア間でメディアを変更する。二週間、2日ごとに標準のDRGメディアを変更。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3。 EMグリッド上に神経細胞をガラス化<ol><li>湿度室17とガラス化装置のガラス化マシンのファインポイント特殊なピンセット、長いフラットポイントピンセット、液体窒素のデュワー（S）（LN：機器、極低温に金のEMグリッドを凍結保存するためのすべての材料を準備します2）あり、coolantコンテナは、EMグリッドストレージボックス、カルシウムを含まないフィルター紙。 </li><li>ガラス化デバイスを起動します。 32℃に100パーセントと温度に湿度を設定する「コンソール」セクションでは、ゼロ秒にブロット時間を設定します。これは、ガラス化マシンの湿度室の側窓から手動ブロッティングを可能にします。 </li><li> 3用紙が積層されているように、それらを重ね、手袋とカルシウムを含まない、ろ紙を処理します。 〜2cmの長さである0.5センチメートル幅のストリップにスタックをカット。紙の一辺が0.5センチメートル×0.5センチメートル面（ 図2）を有するように90°の角度で曲がり、これら。ピンセットを使用して、中紙を取り外し、使用するまで、別のカルシウムを含まない、ろ紙の上に置きます。 </li><li>ガラス化チャンバー内のボタンホルダーにグリッドストレージボタンを配置。液体窒素で冷却液の容器の内部チャンバーを記入し、完全に蒸発するまで待ちます。目の外室を埋める液体窒素でのE冷媒容器、それが次のステップに進むための安定した温度に達するまで。冷却された室内に液体状態に凝縮した高純度ガス状のエタンと内側室を埋める。 </li><li>すぐ近くの中にガラス化室への輸送のための大規模な100ミリメートルポリスチレンディッシュに培養器からディッシュ（ES）を移動、そうでない場合。慎重に皿からのEMグリッドを選択する特殊なガラス化ピンセットを使用してください。ニューロンは、EMグリッド上に成長されている側に注意してください。位置は、次のステップのために重要ではあります。しっかりとEMグリッド上ピンセットをロックするピンセットに黒いスライドロックを使用してください。 </li><li>ガラス化マシンニューロンが離れてガラス化機械の側開口穴から、左に顔を付着した上で、EMグリッドのようにサイドにピンセットを挿入します。ガラス化機械に特化したピンセットを撤回。 </li><li>適切なホルダーに冷媒容器を置きますガラス化マシンの。それは、十分なLN 2と液体エタンで満たされるべきである。それは湿度室の底でフラッシュされるまでガラス化マシンの適切な画面のコマンドを使用して、上方向に冷媒室を上げる。 </li><li>平坦な点ピンセットで、短辺（0.5センチメートル×0.5センチメートルの面）がピンセットに対して垂直になるように、濾紙の一端を把握する。この面では（ 図2B）をブロッティングのためのEMグリッドと直接接触することになる。慎重にガラス化マシンの湿度室（ 図2A）の側穴にフィルター紙を挿入します。安定的に10秒間（側が試料から離して向いている）、EMグリッドに対する紙を開催しています。その後、紙を破棄して、すぐにガラス化マシンの自動化を使用して液体エタン中で試料をプランジ凍結。 </li><li>丁寧に一つのスロットのいずれかに凍結した水和のEMグリッドを転送グリッドストレージのボタン。皿で追加のEMグリッドのためのプロセスを繰り返します。これらの実験で使用したEMグリッドストレージ·ボタンは、複数の凍結水和EMグリッドを格納することができる。 </li></ol> 4。画像収集、処理、および注釈<ol><li> 2-D型電子顕微鏡写真および/ ​​または低用量条件下で低温電子顕微鏡を用いて神経突起の3-Dのチルト系列5を収集するように進む。 2-D画像は3-Dのチルト系列のために有用であると氷の厚さおよび可能な領域の点でグリッドの質を評価することを意図した。 <ol><li>この場合、すべての画像は/ 7程度と4.4オングストロームのサンプリングのアンダーフォーカスターゲットで20K顕微鏡の倍率で、シングルチルト液体窒素クライオ転写ホルダーを装備した200 kVの電子顕微鏡に装着4K X 4K CCDカメラを用いて収集したピクセル。 </li><li>徐々にサンプルらを傾けながら、サンプルの3D断層像を得るためには、投影画像のシリーズを取る透過型電子顕微鏡（TEM）の一つの軸オング。チルト角や他の実験的な設定を考慮すると、自動的にチルトシリーズ5を収集するために利用できる複数の異なるソフトウェアがあります。ここに示した3-Dチルト一連〜60電子/Å2の累積線量で5℃刻みで60°〜-60°の範囲にわたって半自動チルト系列取得ソフトウェア26を使用して、同じ顕微鏡で収集した。 </li></ol></li><li>以前に他のサンプル5,29について記載したように画像処理ソフトウェア21を使用して、神経突起の傾き系列を再構成する。 </li><li>最初の断層像をセグメント化し、以前に記載のように5 3-D画像処理ソフトウェアを用いた表面モデルを作成することにより、神経突起の3-Dの機能カラー·アノテーション。 </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々は、ラット胚性ニューロン（後根神経節および海馬）は金電子顕微鏡（EM）グリッド上に成長した2-DクライオEM及び3-Dクライオを用いて撮像されるそれらの神経突起のために十分に薄いガラス質氷中で凍結することができることを示してET。海馬の神経突起が以前に凍結ET 8,10,18,23を使用して画像化してきたが、市販の装置を使用して正常なレプリケーションのための十分な詳細な?...

ニューロンは、下流の神経細胞と通信するために、多くの場合、非常に長い、情報および軸索を受け取るために樹状突起を工夫することにより、中枢神経系および末梢神経系の機能のために複雑な回路が必要不可欠確立。神経突起伸長は、神経突起の胚発生と神経分化やメンテナンス時の基本的な役割を果たしている批判的に神経系の機能をサポートしています。神経突起は、神経の損傷と再生だけでなく、神経系疾患で批判的に備えています。神経細胞の建築の研究では、正常および疾患脳の両方を理解することが重要である。幸いなことに、生理学的に関連する神経細胞培養系は、複雑な異種の細胞構造を再現することができますが存在する。固体実験プラットフォームの解明に基づいて、ニューロン形態の定性的および定量的分析を可能にする効果的な可視化戦略が必要とされている。特に有用なのだろうナノメートルスケールでの神経突起、軸索と樹状突起の両方を可視化するための一貫性のあるプラットフォームを提供し、詳細な方法論であること。 伝統的な電子顕微鏡検査は、それらの真の状態から試験片の歪みを誘発することができ、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒の使用を必要とする。従って、4,9,25所見の解釈を制限する-これまでに、ナノメートルスケールで最も構造的特徴付けは、このような過酷な化学物質にさらされる大きな細胞または組織に基づく。また、電子ビームの浸透のために、切片を1μm12よりも大きい厚さを示す生物または細胞の突起に必要です。最後に、神経突起の細長い特徴の面倒な定義を作り、個別のスライスのデータ·セットのコレクション、組織切片または結果を粉砕した。偶数クライオEMのために、凍結した水和試料を切片化することが可能である、本方法は、圧縮を導入ARTIF行為1。 近年では、研究者は、その後、凍結ET 8,10,18,23を使用して神経突起を可視化するために、EMグリッドとフラッシュ凍結して液体エタン中に直接海馬ニューロンを成長させる方法を学びました。しかし、このような研究は、カスタムメイドの装置10,23、または日常可視化8,18ための十分薄いガラス質氷を生成するためのブロッティング手順の欠如詳細を使用するか。例えば、ある研究では、EMグリッド10をブロッティングに30〜40秒を使用することを推奨していますが、この値は、一般的な使用のためではない最適化されたが、そのカスタムメイドプランジ凍結デバイスに固有のものです。プランジ凍結にサンプルを前に湿度を維持するためのカスタムメイドのデバイスではなく、市販の1 17を使用すると、広範囲に再現するためのハードルを提起することができます。 これらの研究は低温ETによって神経突起を視覚化する画期的なされてきたが、我々は、APを探索するためにさらに一歩撮影した神経細胞の標本（海馬および後根神経節ニューロン）の様々なクライオ-ETのplicability。さらに、当社は、最適と部分最適の結果だけでなく、1がそのような標本のためにクライオ-ETの使用中に発生する可能性のある潜在的な成果物の両方を議論する。 ネイティブに近い状態に維持し、ナノメートルスケールでの全神経突起を可視化するための詳細な方法を定義することは、超微細構造の研究を行うことがより研究者のための能力を高めるだろう。この目的のために、我々は、神経突起を可視化するために未定着、非染色ニューロンを調製するために、市販の装置を使用して効果的かつ詳細なプロトコルを記載している。これは健全な神経突起の超微細構造を詳述し、構造的な違いは、神経系の疾患モデルに存在しているかを理解するための基礎を築くために向けた重要な第一歩である。クライオETはナノメートルスケールでの3-Dで固定されていない、無染色の神経突起の機能を解決することができますので、この方法は、それが可能であることはありませんようになります神経炎アーキテクチャ12を定義するための前部。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

神経突起、樹状突起と軸索の両方が、神経細胞間の電気的インパルスの伝導を可能にする神経細胞の細胞プロセスである。神経突起の構造を定義すると、これらのプロセスは、シナプスのコミュニケーションをサポートする材料や信号を移動させる方法を理解することが重要です。電子顕微鏡（EM）は、伝統的に、神経突起内の超微細構造の特徴を評価するために使用したが、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒への曝露は、構造を歪ませることができる。重要な満たされていない目標は、成果物の影響を受けていない構造的な評価を可能にする手順の製剤である。ここでは、成長していると低温電子断層撮影法（クライオ-ET）との試験に続いて、電子顕微鏡グリッド上の別の一次ニューロンのフラッシュ凍結全体の神経突起のための詳細かつ再現性のあるプロトコルを確立している。この技術は、ASSEを容易にする、ナノメートル分解能での凍結、水和した神経突起の3次元視覚化を可能にするその形態学的差異のssment。我々のプロトコルは、後根神経節（DRG）神経突起とそのネイティブに近い状態での海馬神経突起の可視化の前例のないビューが得られます。このように、これらの方法は、通常の神経細胞と神経疾患の影響を受けたものの両方の神経突起上の今後の研究のための基盤を作成します。

クライオET経由凍結イメージング、光学顕微鏡像の前には、神経細胞が成長しているのEMグリッドの注意が必要です。神経突起は、互いにかなりの重複せずにはっきりと見えるはずです。 図3Aのカラーボックスは、ズームインされる神経突起グリッドの格子を横切って延びている図3Bのより高い倍率を表示するために領域を表す。各グリッド正方形は、神経細胞とその...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K ビュー.  Baylor College of Medicine. 超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。 

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

神経科学

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

の調製<em&gt;ショウジョウバエ</emための&gt;中央ニューロン<em&gt;その場で</em&gt;パッチクランプ

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

GLUT4 タンパク質デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス一次視床下部ニューロンにおける人身売買のライブ映像

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

プライマリ マウス神経細胞も見逃せません組み立て済みプラスチック製マイクロ流体チップの使用

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

主マウス中脳ニューロンにおける自発的Ca2+ フラックスとその下流効果の定量化

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...