このプロトコルは、局所バイオメカニクス、組織アーキテクチャ、パラクリン環境およびジュスタクリン相互作用における変化が細胞表現型に及ぼす影響を判断するのに役立ちます。この技術は、従来のグラフ実験で通常生じる大規模な組織侮辱を引き起こすことなく、古典的なパラダイムと実験的発生学を探求することを可能にする。注入のための右の圧力を見つけるために,より低い注入圧力から始めて細胞の安定した流れが達成されるまで徐々に増加させることが役に立ちます。
この技術を視覚化することは、標的組織に対してどのように射出装置を配置する必要があるかを直接理解するのに役立ちます。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の2人のメンバー、トレバー・ヘンリーとカンダス・トーマスです。移植の24時間前に、標準的なプロトコルに従ってマイクロピペットプーラーにガラス毛細血管を引っ張り、毛細血管をシリダイジング剤に浸して針の外面をコーティングする。
次に、5~10マイクロリットルのシリコーン化剤をマイクロインジェクションピペットチップに積み込み、外部でコーティングされた引っ張られたガラスキャピラリーの広端にチップを置きます。ピペットチップをガラス針先端にできるだけ近づけ、針内の気泡を最小限に抑えるためにローディングピペットをゆっくりと引き込みながらシリコーン化剤を排出します。シリコン化剤をガラス針に10分間放置してから、新しいローディングピペットを使用して溶液を吸引します。
その後、一晩煙のフードで針を乾燥させます。宿主胚の調製のために、摂氏38度の加湿インキュベーターで水平に肥沃な鶏卵をインキュベートし、卵赤道に沿って各卵の平らな端部の1ミリメートル以上の直径の穿刺をするために斜め鉗子を使用する。10ミリリットルの注射器に取り付けられた18ゲージの針を穿刺に挿入し、約5ミリリットルのアルブミンを取り除きます。
そして、卵殻の上部に透明なテープを適用します。卵の上部に沿ってテーピングされた領域を斜め鉗子でスコアし、湾曲したテノトミーはさみを使用して、卵のテーピングされたセクションで約2.5センチメートルの窓をカットします。ハンブルガーとハミルトンによって確立された基準に基づいて胚を検査し、ステージングし、32ゲージ針を装備した1ミリメートルの注射器を使用して、胚の下のHBSSにインドインクの約200マイクロリットルを注入する。
その後、透明なテープで穿刺を密封し、卵を加湿されたインキュベーターに戻すためにパラフィンフィルムで窓付きシェルを密封する前に、HBSSの1ミリリットルを胚ディスクに滴下して追加します。胚がハンバーガーとハミルトンのステージ19に達したら、シリコーンコーティングされたガラス毛細血管を脱イオン水で洗い流し、毛細血管を室温で3〜4時間乾燥させます。その間に、1つの卵から無菌室温HBSSを含む100 x 15ミリメートルのペトリ皿に胚を移し、その皿をステレオ顕微鏡の下に置きます。
鉗子、胸腺切り耳切りおよびマイクロへらを用いて、胚の心臓全体を胚から分離し、心房を心臓から隔離する。1ミリリットルのHBSSを含む無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに心房組織を氷の上に置きます。ドナー組織の全てが採取されると、固定角度マイクロ遠心分離法で遠心分離により組織をペレット化する。
ドナー組織消化の場合、ペレットを1ミリリットルのプリ温め05%トリプシンEDTAで15分間、1分間に300回転で揺れるヒートブロックで15分間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、消化液を数回ピペットして、残りの組織を分解し、遠心分離によって心臓溶解物をペレットにする。別の遠心分離のためにトリプシン中和溶液の1ミリリットルでペレットを再懸濁し、その後400マイクロリットルの赤色蛍光色素溶液で再懸濁します。
摂氏37度で20分後、1回の洗浄で1~3回の洗浄で遠心分離して細胞をペレット化する。次に、フレッシュHBSSでマイクロリットル濃度あたり10〜4番目の細胞の5倍の10倍の標識細胞を再中断する。ドナー細胞のインビボ注入のために、細胞懸濁液を乾燥したシリコーン処理ガラスキャピラリーピペットにバックロードし、ピペットを圧力マイクロインジェクター装置に取り付ける。
加湿インキュベーターから注入される各宿主胚を蛍光ステレオ解剖顕微鏡下で卵ホルダーに移す。そして、ビテリン膜を開くために無菌の細かい鉗子を使用してください。心膜に5〜1ミリメートルの切開を行い、マイクロインジェクションニードルの先端が標的組織に浸透するようにマイクロインジェクターを配置します。
マイクロインジェクターは、5秒間の単一パルスを加え、圧力で100~400ヘクトパスカルの範囲を設定します。そして、細胞を圧力注入する。卵を再密封する前に蛍光シグナルを画像化して、細胞移植が成功したことを確認することが重要です。
胚はまた、この手順を文書化するために撮影することができます。すべての細胞が注入されたら、マイクロインジェクター装置を引き込み、卵をホルダーから取り出します。その後、胚に1ミリリットルの暖かいHBSSを滴下して加えます。
透明なパッキングテープで卵を密封し、卵を移植後24時間湿気のある保育器に戻します。ここで、ドナー心房筋細胞移植後の宿主胚性心臓の心臓および周囲組織が示されている。本代表的実験では、ドナー細胞を同様の段階の宿主胚のプロエピカルジウムにマイクロインジェクションした。
共焦点顕微鏡を用いた光学断面化は、プロエキカルジウム内の唯一の心筋マーカー陽性細胞が、焦点的に埋め込まれた蛍光赤陽性細胞であることを明らかにした。心臓の破裂や注射針によって引き起こされる局所血管構造が生存率の低下をもたらす可能性があるとして、レシピエント胚を過剰に操作しないように注意してください。この手順に従って、免疫染色化学を含む様々な下流アッセイを、その場面でのハイブリダイゼーションおよび細胞分類で行うことができる。
シリコーン化剤は非常に可燃性で、急性毒性です。それは常に注意と煙のフードの中に適切な個人的な保護具で処理する必要があります。
