私たちは、優れた技術支援のために氏クリスティーヌA.冬を感謝したいと思います。この作品は、NINDS学内研究プログラム、NIH（Z01 NS002610）の基本神経科学プログラムによってサポートされていました。

ここに記載されたアプローチは、特定の機器、ツールとソフトウェアを使用して開発されました。 Labsは、同じ実験を使用することはできませんので、アプローチは、可能な限り一般化されています。 1。急速凍結彼らは凍結の瞬間に生きている細胞であったように定量的に拡散性組織成分と化学元素の分布を保持する方法で、細胞または組織の1）「低温固定」：後述する分析方法は、極低温のためのアプローチに絶対に依存していると、2）TEMで画像化及び分析に適した超薄凍結切片の調製。これらの技術は、ここで簡単に説明しますが、他の研究室では、これらの手順を再現するために必要な詳細はこの記事の範囲を超えています。興味のある読者は、優れた最近の記事を9,14と呼ばれている。 注意：このセクションでは、液体石鹸の使用が記載されている引火性が高いと爆発する可能性あるefiedエタン;適切な予防措置が取られるべきである。また、オペレータは、液体窒素に精通している必要があります（LN 2）保護白衣、メガネ、そしてcryoresistant手袋など安全上の注意、。注：ここでは全体を通して、（鉗子など ）凍結した検体を処理するために使用されるすべてのツールは、偶発的な融解を避けるために、使用前に、LN 2で予冷されている必要があります。 カバースリップ上で培養した細胞<ol><li> LN 2冷却された中央ウェル中に-160℃で気体状エタンを凝縮して、デバイスを凍結思い切って準備します。マークに記入し、ピボットアルミ蓋、使用しないときによくカバーしています。 </li><li>濾紙ウェッジを用いて、薄い水性フィルムに、実験的に適切な条件下で培養された細胞のプラスチック製カバースリップブロット。組織に触れないようにするために、端からブロット、試行錯誤によって決定理想的な残留フィルムは、できるだけ薄いではないので、目組織表面の乾燥を蒸発させて可能にするためにある。 </li><li>クランプ鉗子でエッジカバーグラスを持ち、迅速に手動で、または重力駆動のプランジャーを用い、液体エタン中に浸す。 </li><li>長期保存容器にカバースリップ所望の数を操作するのに十分な大きさ、LN 2の近くの発泡スチロールのボールに凍結したカバーガラスを配置します。 LN 2の下で押収しないアルミスクリューキャップ缶を推奨します。 </li></ol>培養された脳スライスの急速凍結<ol start="5"><li>解剖顕微鏡下で、ビューと邪魔されず、まだ培養膜インサートに付属器官型海馬スライスを、向けます。黒シャーピー型ペンと写真でスライスのエッジ付近の膜上の基準マークを配置します。 </li><li>それでも、顕微鏡下で、約切り出す。正方形を中心とした個々のスライスに5×5ミリメートルの膜の正方形。スライスに触れたりmembranを曲げないE。 </li><li> （後述）cryoultramicrotomeに合うように作られたカスタム設計されたアルミニウム製ディスク上に、直径寒天パッドに¼によりクッション性の膜サポートスライスを、マウントします。急速に空気圧でカスタマイズされた「スラム凍結」装置を用いて、LN 2冷却型サファイアブロックに対してそれを推進することでスライスを凍結。 </li><li>培養細胞について記載したようにストレージに移動します。 </li></ol> 2。凍結切片注意点は：正常に超薄切片のドライカットのリボンを生産する、簡単で論理的ながら、訓練、忍耐とかなりの練習が必要です。 <ol><li> -135℃にcryoattachmentとクールな装備cryoultramicrotomeを焼く</li><li>約に凍結されたカバースリップをカット。シャープ、予備冷却メスを用いて3×3ミリメートルの正方形。培養物は、標準的な3に、粘性のある液体」cryoglue」に（エタノールの午前1時06分混合し、2 -プロパノール11）を上にして作品を埋め込 ​​むミクロトーム試料チャックに適合するように設計直径のアルミニウムピン。培養表面上にcryoglueが漏れないようにしてください。 -160℃で≤するcryobox温度を下げることによってcryoglueを固める<ul class="lalpha"><li>凍結した脳スライスの場合は、しっかりとネジカラーを用いてカスタムメイドの試料チャックに直接ディスクを添付します。 </li></ul></li><li>約に-スライスのカバーガラス片または識別された領域の例えば 、細胞が豊富な地域-凍結した検体の選択された領域をトリミング。ダイヤモンドのトリミングツールを使用して250×250程度のブロック面と〜100μmの深さ。 </li><li> カリフォルニア州での薄い切片のドライカットのリボン。-160℃のreferencs 4、9に記載されて本質的に、35°のダイヤモンドcryoknifeを使用。切削速度とナイフ逃げ角を経験的に決定され、良好な出発点は、9°で0.4〜0.6ミリメートル/秒である。水和された部分の公称厚さ、 すなわち標本アドバンス、Iの項では、主に圧縮のために、実際には1.5-2.0倍厚いが、一般的には80n​​mだ。満足の切片化のため、静電気防止用器具が不可欠です。ナイフエッジからデバイス0.5〜1センチメートルのイオン化の先端を置き、セクション満足なリボンが生成されるまで、出力電力を調整します。 </li><li>木製アプリケータースティックに（エポキシで）まつげを接着することによってまつげプローブを準備します。このようなプローブを使用し、100メッシュの銅グリッドを折り畳み、背後にある作業用の棚に折りインジウム箔封筒に載っ上にキャストグロー放電を行うと、炭素被覆PIOLOFORMの支持フィルム上にナイフの背面からピックアップし、転送部ナイフ。冷間プレスツールでグリッドと封筒の上半分には、を押します折り重なり。 </li><li>アルミ便利グリッドボックスとストアへの転送包まれたグリッドが、ステップ1.4で説明することができます。 </li></ol> 3。電子顕微鏡の試料のクライオトランスファー EPMAのコア測定器この研究室で120 kVので作動し、低温顕微鏡のために装備、つまり、クリーンな真空、試料面積anticontaminator、2K X 2Kの高感度デジタルカメラやクライオトランスファー試料ホルダーに設計された分析電子顕微鏡がある。両方の低·高倍率モードで顕微鏡のアライメントおよび動作条件を事前に確認して、理想的≤10 -7トル、満足なカラム真空を確認する。必要に応じてチューンアップする。 <ol><li> cryoholderのデュワー部品の真空断熱が十分であることを確認します。必要に応じてポンプ。 </li><li>顕微鏡ステージ内で高真空下にある間、その最低温度、少なくとも-160℃までcryoholderを冷却、そのコントロールボックスにホルダーを接続するケーブルを取り外す。オペレータおよび顕微鏡表面にこぼれるLN 2を最小化するためにホルダーを取り外す前に、角度計45°時計回りに傾けます。 </li><li>一体型絶縁するを冷却することによりベンチトップcryoworkstationを準備160℃〜≤Dカップ</li><li>転送（quickly!）クライオワークステーションに顕微鏡から冷却cryoholder。保有者の霜シールドを撤回。 </li><li> LN 2 cryoworkstationの作業テーブル上のストレージと場所からグリッド·サンドイッチの下で取得します。ホルダの試料ウェルについての保持リングは、テーブル上に置かれる。 </li><li>インジウム封筒を開き、cryoholderの検体ウェルに囲まれた折りたたみグリッドを移動します。提供スパナツールを使用して、保持リングとグリッドを確保し、霜シールドを閉じます。 </li><li>迅速cryoworkstationからcryoholderを削除して、顕微鏡のエアロックに挿入し、可能な限り迅速に、ポンピングシーケンスを通過。挿入時に、カラム真空の中断を最小限に抑えるがあるはずです。 </li><li> 0°チルト角度計を返します。再接続してreenergizeコントロールボックスを、試料温度が150℃≤であることを確認</li><li>のデュワーを補充試料ホルダーと真空と温度が完全に回復することができます。 </li></ol> 4。セクションの視覚的な調査<ol><li>試料を露出し、電子ビームをオンにするホルダーの霜シールドを後退させる。 </li><li>視覚的には低倍率、通常は250倍、低照度での試料を評価する。 図1に示されるように、セクションでは、薄くて滑らかで、折り畳まれていないか、または重複し、平らで十分に支持膜に付着してもよく、一般的には、グリッド·バーで隠さないようにしてください。 </li><li>必要に応じて選択した部分を撮影しています。 （注：凍結した水和の項では、ビーム誘起損傷を非常に受けやすいことから、ビーム露光を最小限に抑えます。）選択したセクションの座標を保存するために自動化されたデジタルゴニオステージを使用してください。 </li></ol> 5。セクションの凍結乾燥<ol><li>凍結乾燥切片を約するホルダ温度を増加させることによって-100°C〜30分間。 </li><li>下の-160℃以下にホルダーを再冷却。 </li><l私は&gt;イメージングの前に、熱サイクルおよび/または振動ピックアップに像ドリフトを避けるためにcryoholder制御ユニットと、物理的に切断コントローラーケーブルをオフにしてください。 </li></ol> 6。細胞およびオルガネラのイメージング凍結乾燥されたセクションの構造の画像は、約で得られる。 -160°Cのような低用量、適切なソフトウェアによって制御さ2kのX 2kのスロースキャンCCDカメラを用いてデジタル的に記録されたゼロロス像。 <ol><li>こんにちは-MAGモードでEMをアクティブにします。 </li><li>選択したセルや場所、以前に記録し、保存した高品質のセクションへの関心の細胞内の領域（TIFFのように、 図2を参照）〜2000 xで選択した画像。 （注：乾燥した切片は、現在実質的に壊れにく​​く、電子ビームによる損傷を受けにくい。 </li><li> X線分析のための関心領域（ROI）を選択するために画像を評価する。このステップは、必要に応じてEMをオンにすることができる場合には、オフラインで行うことができるオフし、室温まで温めた試料。 </li></ol> 7。 X線スペクトルの取得 X線スペクトルは、最小エネルギー分散型X線（EDX）検出器、関連するパルスプロセッサエレクトロニクスと互換取得および表示ソフトウェアからなるいくつかの商用またはカスタム設計されたX線分析装置のいずれかを用いて記録することができる。 （このラボで使用されるシステムは、 表1に記載されている。） <ol><li> 、コラム（必要な場合）にEDX検出器を挿入する対物絞りを撤回し、浮遊放射開口部を挿入し、センタリングにより、X線取得のためのEMを構成します。試料の霜汚染が回避される最低温度にcryoholderを調整するが、少なくとも-100℃以下の</li><li>ホルダの検出器に向けて20°に傾けます。 </li><li>広視野撮像条件の下で、一方がindividuaのマトリックスを分析しようとすると仮定しLのミトコンドリアは、分析のためのミトコンドリアを選択するフィールドの中央に移動し、焦点を当てています。 </li><li> 100 nmのスポットにスポットモード（一部の顕微鏡にちょうど第二凝縮フォーカスを用いたビームを集束）に移動し、CAにビーム電流を大きくしてください。3 NA（ファラデーカップまたは類似で測定した）。 </li><li>スペクトル取得ソフトウェアを起動し、表示モニターにライブの時間を表示することができます100秒の買収を、開始します。記録されたスペクトル（ 図2）を保存します。業界標準のEMSA形式が好ましい。 </li><li> EMをシャットダウンして（オフライン）分析ワークステーションに複数のスペクトルのファイルを転送します。 </li></ol> 8。 X線スペクトルの解析定性分析 EDXスペクトル（ 図2、挿入図）は、本質的なエネルギー対のX線強度のX-Yプロットである。スペクトルはTの元素組成についての定性的および定量的な情報が含まれていますピークの「特徴」エネルギーは強度がその要素の量を反映しながら、そのピークを生じさせる要素を識別するという点で、彼は、ボリュームを分析した。特徴的なピークは「連続体」、ゆっくりと変化する背景の上に乗っている。 （ 図2伝説がさらにEDXスペクトルの顕著な詳細を説明します。）全体の周期表のピーク多様体のエネルギーは、要素のよく知られた電子構造、自動的にコンポーネントを識別し、データベースへのため、すべてのEDXソフトウェアリンクによって定義されています分析対象。生理的な文脈では、EDX分析に非常に適している一般的な関心の要素は、NA（1.04 keVの時のKα）、P（2.01 keVの）、K（3.31 keVの）、およびCa（3.69 keVの）が含まれています。 <ol><li>スペクトル中の主要な要素を識別するために利用可能なソフトウェア·データベースとピーク·マッチング·ルーチンを活用。生体試料中のNa、Mgを、P、S、CL、K、およびCAのピークを見つけることを期待しています。 （注意：最後の2つの要素が重なって！） </li></ol>定量分析 EDXスペクトルの定量分析は、同定されたピークの積分面積を抽出し、この濃度値を変換することからなる。生物学的分析のために、確立されたアプローチは、（上記および図2で定義された）連続体の強度が分析され、ボリュームの乾燥質量に比例するという事実を利用するホールピーク/連続法4,7,10、ある。既知の組成の標準のスペクトルの同じ比率と比較した場合、これにより、ピーク面積/連続面積の比は、標的細胞区画中の濃度を特定する。このアプローチは、一般的ミリモル/ kg乾燥重量として表される重量当たりのモル単位での濃度を、提供することに注意してください。このユニットは珍しいとELが説明されているように解釈のため、例えば、ミリモル/ Lの湿重量またはモル/ mgタンパク質に付​​加的な変換が必要な場合があります4,10を sewhere。 <ol start="2"><li> Z = 10〜20（0.5〜4.0 keVの）との間の生物学的エレメントのピーク面積（及び誤差推定値）を抽出する、 すなわちナトリウム、およびMg、P、S、Clで、K、およびCa、解析ソフトウェアに組み込まれたフィッティングルーチンのいずれかを使用して（特に4脚注、 表1を参照）。このラボでは、シンプレックスまたは複数の最小二乗フィッティングを使用しています。このフィッティングは、KおよびCaのピークの間のオーバーラップをします（ 図2を参照） を解決するには十分注意が必要であることに注意してください。 </li><li> 1.45から1.61 keVの連続体を統合する。代替的な干渉のない領域を使用することができる。 </li><li>標準との比較により、ピーク/連続比および濃度を計算します。分析を通じてエラーを伝播する。 </li><li>生物学的変動を反映して平均値を推定するために、標準的な統計ソフトウェアや数式を使用してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+consequence:+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction,+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases.">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

著者らは、利害の衝突を報告していません。

ここに提示電子顕微鏡ベースの分析法をNa、K、P、および特にカルシウムを含む生物学的関心のあるいくつかの要素の検出、同定、および定量を可能にする。これらの分析は、急速凍結検体から調製した凍結切片の高品質の画像における関心構造を検索し、同定する能力により、すなわち 、内オルガネラ、解像度、細胞内で実施することができる。染色は、組織要素の位置を定量的に?...

カルシウムイオンはシナプス伝達および遺伝子発現などの多様などの通常のプロセスにおいて重要な役割を果たして、間違いなく生物学において最も重要かつ汎用性の細胞シグナリングエンティティである。一方、カルシウムは、細胞死にも同様に重要である。特に、カルシウム、規制緩和が行程の神経損傷の重要な要因であり、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患3,5。このように、カルシウムが細胞内でどのように分布しているかを定量的に理解することが非常に重要であり、これはどのように生理学的または病態生理学的刺激、以下の変更。溶液中の遊離又は基質に結合 - - 及び細胞内カルシウム濃度は、刺激の結果として数桁にわたって変化し、この目標は、カルシウムを動的つの物理状態との間で分配されるという事実によって複雑になる。 FRの分析に利用可能ないくつかの高度な方法論がありますが細胞内カルシウムをEE、定義された細胞内区画中の総カルシウム濃度の決定は、現実的に一つのアプローチ、すなわち、電子プローブマイクロアナライザ（EPMA）に制限される。 EPMAは、透過型電子顕微鏡（TEM）に結合するX線分析技術である。 TEMの電子銃は（詳細な技術レビューのための参考文献7,4を参照）は、対象の細胞内領域に静止し、サブミクロンの電子プローブを集束し、電子の衝突の結果として放出素子特有のX線を収集し、分析する。 EPMAの利点は、単一の細胞小器官レベルの解像度とsubmillimolar感度があります。しかし実際には、EPMAは、試料調製および分析のための専門cryotechniquesや計測が必要です。ここでは、EPMAを用いた細胞内カルシウムの測定のための適切なツール、技術および器具が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムは、特別のIです神経変性疾患におけるミトコンドリアのカルシウム過負荷果たしている重要な役割の都合nterest。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

この記事では、電子プローブ微量分析（EPMA）として知られている技術を用いて、細胞内の元素含有量の定量的測定のための適切なツール、技術および機器が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムが原因ミトコンドリアカルシウム過負荷が神経変性疾患で果たす重要な役割の特定の焦点となっています。方法は、X線の分析に基づいて試料の電子ビームの相互作用によって電子顕微鏡（EM）で生成された。電子顕微鏡標本における拡散元素の天然分布を維持するために、EPMAは、超薄凍結切片の調製に続いて​​組織の「低温固定」を必要とする。培養細胞または器官型スライス培養物の急速凍結は、液体エタン、またはそれぞれ、冷たい金属ブロックに対して凍結により凍結スラムプランジによって行われる。凍結切片名目上80膜厚は、CAでダイヤモンドナイフを用いたドライカットされます。 -16076 Cは、炭素/ PIOLOFORM被覆銅グリッド上にマウントされ、専門cryospecimenホルダを用いて低温EMにcryotransferred。 ≤-160℃、低電子線量で視覚的な調査と位置マッピングした後、凍結した水和凍結切片を凍結乾燥〜30分間-100℃である。乾燥した凍結切片のオルガネラレベルの画像は、スロースキャンCCDカメラおよび分析のために選択された関心対象の細胞内領域を用いて、低用量で、記録される。静止した、集束高輝度電子プローブによりROIをから出射X線はエネルギー分散型X線（EDX）関連する電子機器によって処理分析計、およびX線スペクトルとして提示することによって収集される、すなわち、エネルギー対のX線強度のプロット。追加のソフトウェアは容易に：彼らの「特性」のピークエネルギーと指紋による元素成分の1）の識別、およびピーク面積/背景の抽出による2）定量分析。本稿では、典型的な例証2の例で締めくくりEPMAアプリケーション、ミトコンドリアのカルシウム分析は、虚血耐性の基礎を明らかにした興奮毒性損傷し、別のメカニズムに重要な洞察を提供している1。

脳細胞は通常、虚血状態下で起こる病的な神経伝達物質の放出の結果として、興奮毒性損傷を維持する。 EPMAはカルシウムを大量に隔離する神経細胞のミトコンドリアの能力は、損傷のメカニズムの基礎となる方法を発見する重要でした。 図3の電子顕微鏡写真は、急速に興奮毒性刺激（100μMNMDA）へ30分間曝露した後に凍結培養海馬ニューロンの凍結乾燥した凍結切片におけるミ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis at JoVE.com

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。

電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K ビュー.  National Institutes of Health. 本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。 

ビデオ: Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

動作げっ歯類の可動シリコンプローブによるニューロンの大規模なレコーディング

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

マウスの脳、青斑核の局在

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.