シナプス前カルシウムレベルの推定は、シナプス伝達を研究する上で重要なタスクです。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です。提示されたローディング技術の主な利点は、染色が目的の細胞に対してのみ行われたことである。
カルシウムの非過渡性を記録する方法は、非常に優れた時空間分解能を提供します。提示された登録方法は、共焦点顕微鏡を使用して高速周期プロセスを登録する必要がある神経生理学者にとって有用であり得る。ローディング技術で最も難しいステップは、ピペット内に神経を保持することです。
ピペットの直径は完全にフィットしていなければならないので、いくつかのものを作ります。プロトコルのすべてのステップを知ることは複雑であり、それらのそれぞれを示すことは大いに役立ちます。エラストマーでコーティングされたペトリ皿に細いステンレス鋼のピンでわずかに伸ばして長挙筋組織を固定することから始め、筋肉が完全に覆われるまでリンゲル溶液を皿に追加します。
次に、マイクロピペットプーラーを使用して、細胞内記録用の微細な鋭利な先端を持つマイクロピペットを準備します。内部フィラメントのない毛細血管を使用してください。テーパーを研磨剤で刻んだ後、マイクロピペットチップを切り離し、チップを直径約100マイクロメートルまで開いたままにします。
次に、内径が80マイクロメートルから12マイクロメートルに縮小するまでチップをファイアポリッシュします。完了したら、シリコンチューブを片側に取り付け、針のないシリンジを充填ピペットの反対側に取り付けます。実体顕微鏡で、神経幹が別々の神経枝に変わる場所を見つけます。
ワックスを使用して充填ピペットをペトリ皿に置き、ピペットチップを神経の上になるまで動かします。細かいハサミで筋線維に近い神経を切り、長さ約1ミリメートルの神経断端の小片を残します。次に、神経をつまむことなく、リンゲル溶液で神経断端を充填ピペットの先端に吸引します。
完了したら、充填ピペットからシリコンチューブを取り外します。その後、長いフィラメントを備えたシリンジを使用して、色素装填溶液を描画します。次に、ローディング溶液を含むフィラメントチップを充填ピペットに挿入し、混合物を神経断端に放出し、続いて神経製剤を室温で暗所で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、神経製剤を新鮮なリンゲル溶液ですすぎ、ガラスビーカー中の50ミリリットルのリンゲル溶液で摂氏25度で2時間処理します。共焦点顕微鏡では、神経製剤をシリコンエラストマーコーティングされた実験チャンバーに取り付け、わずかに伸ばしてスチール製のマイクロニードルのセットで固定します。次に、リンゲル溶液で製剤を広範囲にすすぎます。
チャンバーに吸引電極を取り付けます。準備チャンバーを顕微鏡ステージに取り付けた後、入口と出口の継手をチャンバーに配置します。重力流駆動システムの電源を入れて、調製物から余分な溶液を取り除きます。
完了したら、刺激吸引電極を電気刺激装置に接続し、刺激後に筋肉の収縮が発生することを確認します。次に、灌流システムに10マイクロモルのd-ツボクラリンを含むリンゲル溶液を満たし、灌流吸引ポンプをオンにして灌流を開始します。レーザー走査型共焦点顕微鏡またはLSCMソフトウェアで、電気生理学および取得モードを選択してイメージングパラメータを設定します。
ジョブメニュー設定で、顕微鏡同期パルスで刺激装置をトリガーするトリガー設定を選択し、トリガーアウトオンフレームフィールドをOUT1チャンネルに設定します。スキャンモードを1, 400ヘルツのスキャン周波数でXYTに切り替えます。ズーム係数は、ピンホールが完全に開いた状態で6.1である必要があります。
シーケンシャル、トランスパス、双方向 X モードがオンになっていることを確認してから、フレームを形成するための最小時間を 52 ミリ秒に設定し、生のビデオのフレームを 20 フレームで収集します。アルゴンレーザーの励起波長を488ナノメートルに設定し、出力電力を8%に設定します。パラメータが設定されたら、ライブモードボタンを押して、色素がロードされた神経終末のライブプレビューを取得します。
ライブモードでは、関心領域またはROIを検索して、最適なフォーカスを取得します。次に、刺激装置の遅延を前の値に対して2ミリ秒少なくシフトし、データ収集ソフトウェアを実行して、各シーケンスを前のシーケンスから2ミリ秒シフトして26シーケンスを取得します。キャプチャしたビデオを処理するには、Leica Application Suite XまたはLAS Xソフトウェアを実行し、作成したプロジェクトを開きます。
次に、[エクスポート]をクリックして名前を付けて保存し、フレームをTIF形式で宛先フォルダーに保存します。次に、ImageJソフトウェアを実行し、ファイル、インポート、および画像シーケンスをクリックします。開いている画像シーケンスウィンドウで、宛先フォルダーを選択し、最初のフレームを開きます。
シーケンスオプションから、開始画像フィールドに移動し、最初のフレームのフレーム番号を1に設定します。次に、インクリメントフィールドで、OKをクリックする前に、最初の信号記録のフレーム数と同じ値を設定します。ステッチされた最初のフレームの生成されたファイルを別のフォルダーに保存するには、ファイル、保存、およびフォルダータブを順番にクリックします。
開始画像フィールドに対応するフレーム番号を設定して、19フレームの手順を繰り返します。すべての画像が取得されたら、ファイル、インポート、および画像シーケンスをクリックして、開始画像フィールドと増分フィールドで1つを選択します。すべてのフレームが時間分解能を上げてつなぎ合わされた最終的なビデオを見ることができます。
次に、ビデオファイルをTIF形式で保存します。ステッチされたビデオを分析するには、画像、スタック、ツール、スタックソーターをクリックします。次に、分析、ツール、ROIマネージャーに移動します。
以前に保存したTIFファイルをImageJウィンドウにドラッグアンドドロップし、画像を展開して見やすくします。画像の視覚化を改善するには、画像をクリックして調整し、明るさのコントラストを自動に切り替えます。ROIを描画し、ROIマネージャーに付加価値を与えることで、背景を神経終末の近くに設定します。
次に、詳細とマルチメジャーをクリックして背景を計算します。平均値をコピーしてスプレッドシート プログラムに貼り付けます。次に、平均値を計算します。
次に、計算された平均値をスタックから減算し、処理、メイン、および減算をクリックします。取得した値を入力し、神経終末の周囲に多角形の線でROIを描画してから、ROIマネージャーに追加します。神経終末の過渡強度を測定するには、詳細タブとマルチ測定タブをクリックします。
次に、平均強度値をコピーしてスプレッドシートプログラムに貼り付け、信号の平均オフセットを計算します。信号値を平均オフセット値で割ります。得られた値から1を引き、次に100%を掛け、続いてカルシウム過渡グラフをプロットして振幅を決定します。
神経調製物に染料を装填した後、シナプスの大部分は神経断端の近くに位置し、十分なレベルの蛍光を示した。画像処理後、所望の空間的および時間的分解能を有するカルシウム過渡性が得られた。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、神経を切断した後の最初の数分で、神経断端を色素含有溶液に入れる必要があることです。
この方法は、さまざまな染料や薬物を運動ニューロンにロードするために使用できます。登録のプロトコルは、CNS製剤中の樹状突起および棘中のカルシウムを評価するのに有用であり得る。私たちの技術は、優れた空間的および時間的分解能でカルシウムシグナルを登録することを可能にします。
カルシウム過渡現象の研究は、神経伝達物質の放出とシナプス可塑性の調節を研究する上で強力なツールです。
