このプロトコルは、私たちの知る限り、ダイズ共生団塊からのキネティックポリソーム精製のための新しい遠心分離機ベースの金属を記載した最初のプロトコルであるため、重要です。この技術の大きな利点は、RNA-Seqと組み合わせて、共生結節などの複雑な組織に組織化された関係の研究を可能にすることです。はじめに、計量皿に約0.2グラムの無傷の結節を秤量し、それらを予冷した2ミリリットルのチューブに移します。

次に、1.2ミリリットルのポリソーム抽出バッファーを加え、サンプルを2分間解凍し、結節が完全に破壊および均質化されるまで組織グラインダーでホモジナイズします。次に、氷上でサンプルを穏やかに攪拌しながら 10 分間、またはすべてのサンプルが処理されるまでインキュベートし、摂氏 4 度で 15 分間 16 、 000 倍 G で遠心分離して破片をペレット化します。その後、上清を回収し、遠心分離工程を繰り返す。

清澄化した細胞質抽出物を注意深く回収した後、200マイクロリットルのアリコートを清潔な1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移して完全に分離します。次に、4.5ミリリットルの33.5%スクロース層を遠心チューブに注ぎ、4.5ミリリットルの12%層をP-1000マイクロピペットで注意深くゆっくりと加えます。次に、清澄化した細胞質抽出物が添加されるまでチューブを氷上に置きます。

チューブの側壁に慎重にピペッティングすることにより、スクロースクッションの上に1ミリリットルの清澄化細胞質抽出物をロードします。次に、超遠心管を予冷したバケツに移し、摂氏4度で2時間217, 874 Gで遠心分離します。残りの細胞質抽出物およびスクロースクッションを廃棄した後、ポリソームペレットを200マイクロリットルの予冷再懸濁バッファーで再懸濁する。

次に、氷上で30分間インキュベートし、次にポリソーム再懸濁液を1.5ミリリットルの予冷チューブに移してRNA抽出を進めます。サンプルを750マイクロリットルのRNA単離試薬でホモジナイズした後、室温で5分間インキュベートする。次に、200マイクロリットルの冷たいクロロホルムを加え、チューブを15秒間激しく振とうします。

次に、室温で10分間インキュベートします。相分離のために摂氏 4 度で 15 分間 12 、 000 倍 G で遠心分離し、ピンク色の有機相を乱すことなく、上部水相 500 マイクロリットルをきれいなチューブに移します。次に、375マイクロリットルの冷たいイソプロパノールと0.5マイクロリットルのRNA遊離グリコーゲンを加えます。

その後、上下にピペッティングして完全に混合します。混合物を摂氏4度で10分間インキュベートし、12, 000倍Gで15分間遠心分離します。その後、上清を捨て、RNA沈殿物を1ミリリットルの冷水、75%エタノールで洗浄する。

短時間の渦で混ぜる。次に、摂氏4度で5分間7, 500 gで遠心分離します。上清を捨て、RNAペレットを風乾する。

次いで、ペレットを50マイクロリットルのRNA遊離水に溶解し、摂氏65度で5分間インキュベートする。高感度キャピラリー電気泳動および/または2%RNA遊離アガロースゲル上の電気泳動により、RNA濃度と完全性を評価します。サンプル量を推定した後、0.1容量の3モル酢酸ナトリウム、3容量の冷エタノール、および0.5マイクロリットルのRNA、遊離グリコーゲンを追加します。

次に、それらを完全に混ぜます。キャピラリー電気泳動は、いくつかの総およびポリソーム関連RNAサンプル画分に対して実行され、汚れた外観なしに鋭いリボソームRNAバンドを示しました。ただし、RIN値は5.9〜7.5の範囲であり、無傷のサンプルに対応するため、これは反映されません。

バイオアナライザーは、全RNAサンプルとポリソーム関連RNAサンプルの両方について、電気泳動図に見られる18Sおよび25Sピークを識別できませんでした。サンプルの劣化の視覚的な兆候はありませんでした。ただし、比較のために、ほぼ完全に分解されたサンプルの結果を視覚化するためにサンプルを分析しました。

最も重要なことは、プロトコル全体を通してポリソームおよびRNA保存条件で作業することです。解析した遺伝子発現のための標準パターンのトータルおよびパーRNA画分を配列決定した後、転写および翻訳レベルで差次的発現遺伝子を同定するために使用することができる。