この研究は、グラント契約番号HEALTH-F2-2009から241778に基づく付与数FO 315/4-下ドイツ学術振興（DFG、ドイツ研究協会）と欧州連合（EU）第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）によってサポートされていましたCF。

1。ウェルプレートに内皮細胞の播種<ol><li>コンフルエンスに達するまで、週二回（DMEM、10％FCS、50 U / mlのペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミンを含む）培地を変え、T75培養フラスコにマウス脳微小血管内皮細胞（CEND）養う。 （;フェルスターら 、2005年21,19。脳微小血管内皮細胞の生成と不死化のために、Burek ら 、2012を参照してください）。 </li><li>リン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。 PBSを削除し、2ミリリットル暖かいトリプシン-EDTA溶液で細胞をトリプシン処理。 </li><li>細胞層が分散するまで5分間または37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>細胞内に8ミリリットルの培地を追加します。細胞を分離するためにフラスコを数回タップします。 </li><li>フラスコから完全に剥離を確実にするために、顕微鏡下で細胞を表示します。 </li><li>上下切り離さ細胞と培地をピペット。渦巻細胞suspensiを混合するフラスコ上。 </li><li> 、細胞懸濁液20μlを取り血球計数装置に入れ、細胞数を数える。 </li><li>ウェルに細胞密度と種子20,000細胞/ cm 2を決定します。 </li><li> 3ミリリットル/ウェルの総体積でアテロコラーゲンプレコート6ウェル柔軟底培養プレート（57.75センチメートル2）に細胞懸濁液を移す。各ウェルには、9.62センチメートル2の面積を持っています。 </li><li>合流するまで、一週間37℃で細胞を成長させる。週2回培地を変更します。 </li></ol> 2。ストレッチ誘発性傷害に先立ち細胞分化 <ol><li>分化培地（DMEM、1％血清最低限のウシ胎児血清（ssFCS）、50 U / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含有する）を用いて細胞の培地を変える。 </li><li> 24時間37℃で細胞をインキュベートする。 </li></ol> 3。内皮細胞のストレッチ誘発性傷害<ol><li>細胞傷害コントローラデバイスをオンにします。 </li><li> 50ミリ秒までの遅延を設定します。 </li><li> 15 psiまでレギュレータ圧力を設定し、登録されたピーク圧力が安定するまで、トリガーを数回押してください。 </li><li>所望の値にレギュレータ圧力を設定します。ストレッチ傷害の様々な程度を生成するためのガイドとして、表1を使用してください。 </li><li>トレイホルダーに6ウェル柔軟底培養プレート（57.75センチメートル2）を配置します。よくセレクタが正しいよくサイズ（ すなわち大ウェル）に設定されていることを確認します。 </li><li>しっかりと優に超えるアダプタのプラグを配置します。一方、トリガーを押している間は片手でしっかりにプラグを持ってください。 </li><li>生成されたピーク圧力を記録します。 </li><li>すぐに時間の希望の長さを37℃のインキュベーターにバックプレートを置くか、または実験や評価を承継するため、直ちに使用。 </li></ol> 4。色素取り込みアッセイによってストレッチ傷害の評価<ol><li>細胞は、strだった直後染料溶液10μl：エッチングする（ステップ3.7）、細胞培養培地に細胞毒性マーカーとしての行為は（資機材の補足表をご覧ください）（ 注という染色生存能力の1 mg / mlの溶液を30μLを追加） 細胞培養培地の全ての溶液のために使用される 。 </li><li>細胞に染料を添加すると、直ちに蛍光顕微鏡下で表示します。 </li></ol> 5。乳酸脱水素酵素（LDH）リリースによってストレッチ傷害の評価<ol><li>直ちに細胞（ステップ3.7）延伸後、井戸から細胞培養培地200μlのを削除します。あなたはLDH放出のあなたの調査に含めたいすべての時点損傷後のために同じことを行う（ つまり、例えば 30分、1時間、2時間、 など 。） </li><li>任意の細胞破片を除去するために5分間遠心の最高の設定で細胞培養培地を遠心分離。上清を除去し、後続のステップのためにこれを使用しています。 </li><li>一度HAVEは、ステップ5.1を終えて、あなたは、調査LDHアッセイキット（資機材の補足表を参照してください）​​に含まれる溶解液を用いて細胞を溶解したい様々な時点で持っていると思います必要なサンプルをとっている。 </li><li>キットに付属の96ウェルプレートの各ウェルアッセイきっとに含まれるアッセイ培地100μlを入れて。 </li><li>アッセイキットに含まれている96ウェルプレートの二つの平行ウェルに無細胞の細胞培養培地100μlを入れて。 </li><li> 30分間37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li> 492 nmの吸光度を読んでください。 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. 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利害の衝突は宣言されていない。

星状細胞、神経細胞、グリア細胞および大動脈内皮細胞8、9、22のためのin vitroでの機械的損傷の影響が研究されているおよび方法が確立されている。それでも、培養脳内皮細胞における延伸損傷のin vitroモデルにおいて知られてない今日まで、ただし、存在しない。細胞の機械的な環境は6精密に制御することができるので、外傷の細胞モデルは、動物モデル上の貴重な利点を提供する。したがって、培養内皮脳細胞を用いたストレッチ損傷を介し外傷のin vitroモデルにおいて 、そのような提案プロトコルプレゼントが有用になるかもしれないものと血液脳関門（BBB）モデルとして作用する。 このプロトコルはCEND細胞の使用、私たちの研究室で確立されたB​​BBのモデルになります。 BBBの内訳は、しばしばTBI患者で文書化され、TBIはしばしば浮腫形成23、24になることがBBBの混乱にリンクされているので、このメソッドはPRESここで取得済み具体的にTBIに関連BBB試験の実施に用いることができる。 このモデルでは、セルに適用されるどのくらいストレッチ損傷の程度の世話をすることが重要である。できるだけ多くの細胞がどのような場合には負傷しているように、かつ適用される圧力のどんな量では、内皮細胞に影響を与えることが怪我の程度は他の細胞タイプからずっと大きく異なる。大動脈内皮細胞は星状細胞または混合グリア細胞9よりも損傷を伸ばすことがより耐性がある。他の細胞型と比較して、さらに、それらは損傷後のより迅速に修復する。したがって、脳内皮細胞、特にCEND細胞、伸張損傷の量が多いための損傷の高度を生成するために必要とされる。一つは、 表1に示す対応する圧力を印加することによって、所望の程度の損傷を達成することができる。 CENDセルの場合、しかし、深刻な怪我は、歪みに対する耐性のために好ましい。実施LDHアッセイは示した伸縮度が増加するなど、よりLDH、上清中に分泌される。対照的に、伸張損傷の少量を与えられた細胞は、細胞を制御する同様の量のLDHを生成した。プロトコルで述べたように、一媒体の量の増加または減少がウェルに印加されるピーク圧力の違いにつながる可能性があるため、適切な量の媒体が使用されていることを注意しなければならない。 45 psiの圧力が印加されるときに、空のウェルが3.8 psiでの平均値をレジスタたとえば、流体のウェルを含有する5ミリリットルの4.0 psiでの平均のピーク圧力を登録する。そのため、生成されるピーク圧力が所望の量に対応することを確実にするために十分にコントロールの上にトリガーを数回プッシュするのが最善です。 我々の実験では、生存、細胞膜の透過性への伸張の影響を決定するために使用される染色。我々が使用する柔軟な底培養プレートの光学系は、VIすることを可能にEW直接顕微鏡下で染色された細胞。しかし、一つは直接ストレッチ損傷後の免疫標識の研究を実施したい場合、困難が生じることがあります。まず、プレートのサイズ及び厚さは、いくつかの顕微鏡観察プラットフォームの問題を引き起こすことがある。第二に、井戸の可撓性膜の光学系は、表示をクリアするには支障があります。 上記の制限にもかかわらず、記載された手順は、BBBのインビトロでの機械的損傷のモデルとして使用することができる。外傷性脳損傷は（TBI）2すなわちコンポーネント、、虚血や外傷を伴う。虚血、低血圧や脳の結果として得られた重篤な血液の損失があった場合の例でTBI後の脳への酸素供給制限を膨潤させる二次的損傷として生じ得る。これは、傷害25の瞬間に開始の連続した病理学的プロセスを表す遅延、非機械損傷とみなされます。低酸素症の発生上げ装置重度の外傷性脳損傷は、一般的な26です。酸素グルコース欠乏（OGD）は、現在、in vitroでのモデルの虚血に使用されているメソッドです。このように、ストレッチの後に細胞に二次的な侮辱としてOGDに細胞をさらすことは虚血に続くTBIの発生率を模倣することができます。したがって、のin vitroモデルで私たちの現在を改善するためのTBIとできるだけ近く実際のTBIに、それは、生体内で発生するようなパターンを、将来的に我々はまた、ストレッチ傷害と組み合わせOGD採用する。

外傷性脳損傷は（TBI）は、世界中の死亡の主要な原因の一つである。約1000万人がTBIそれ主要な保健医療問題1することで、毎年影響を受けます。これにより、in vivoおよび TBIのin vitroモデルは、その種々の機構2,3,4を研究するために設立され、開発されている。TBIのより良い理解は、患者の治療を改善し、関連する死亡率、罹患率およびコストを削減することができます。 in vivoおよびin vitro法の両方で利用する脳損傷のための多くのモデルが存在する。vivoモデルでは頭部外傷の実際のイベントを模倣することができます。しかし、 生体内の状況での複雑さに起因し、興味のある組織へのアクセシビリティが2に限定となります。与え傷害の結果として、個々の細胞の生理反応を理解する上で、細胞がその全身作用から隔離されていることが重要である個々の応答5を阻害したり、変更することがあります。細胞の機械的な環境は6精密に制御することができるので、このような理由から、外傷の細胞モデルは、動物モデル上の貴重な利点を提供する。 損傷のこのような方法によって誘導される変化を決定するために細胞または組織への機械的負荷の使用を用いるインビトロ系が開発されている。例えば、細胞への機械的損傷の影響を研究するための方法は、星状細胞、神経細胞、グリア細胞および大動脈内皮細胞7,8,9のために確立されている。 10、我々 は我々のモデルのために使用するものと同一の圧力制御装置を採用したげっ歯類とヒトのアストロサイトの反応性の研究のために確立されたin vitroでの外傷モデルである 。同様の方法は、マウスの脳微小血管内皮細胞（bEnd3）11と皮質ニューロンとして12,13と同様、脳endothでストレッチを通して怪我を誘発するために適用された生まれたばかりの子豚からelialセル14。デバイスはメカニカルストレッチ傷害10を生産するだけでなく、それによって文化の底部を変形させる。それは、細胞上の空気の加圧により培養細胞時に怪我を負わせる。この圧力は、それによって細胞を伸ばして、細胞が成長してその上に膜をそらすことができます。ストレッチ種々の程度は、（ &quot; すなわち &quot;低&quot;、中等度&quot;又は&quot;重度）に応じて空気圧パルス持続時間と強度を設定することによって達成することができる。延伸誘起損傷するこの方法は、 インビボ17.78外傷と相関している。また、傷害のこの方法は、細胞外環境の正確な制御を可能にし、容易に再生することができる。 同様のアプローチがbEnd3を含む他の多くの脳細胞タイプに使用されてきたが、我々のモデルは、マウス脳微小血管内皮細胞の使用（CEND）が生成させるという点で有利である我々の研究室である。この細胞株は、血液脳関門（BBB）を十分に相応しいモデルである。BBBモデルとして用いるin vitro細胞培養物において、それらの透磁率画面として機能するのを可能にする特性を有するべきである。 インビトロ細胞モデルの BBB透過性の予測因子であるための一つの重要な基準は、それが生理的に現実的なセル構造15を有しているべきであるということである。 bEnd3細胞は、培養16で独特の紡錘のような扁平な形態を表示するにもかかわらず、彼らはむしろフィブリンゲル17の正規管状構造より嚢胞のような空洞を形成することにより、それらはin vitroで不規則な形態形成挙動を示す。さらに、細胞は胚及び新生マウスに注入したとき、彼らはなく、新生児および若年マウスにおける胚性マウスに致死急速に増殖する腫瘍を誘導した。従って、正常な内皮細胞増殖、遊走、および分化を支配するつまたは複数のプロセスが変更またはeliminatされていることが示唆されているこの細胞株18編一方、内皮細胞およびBBBマーカー発現、生体および傍細胞磁束測定の形態学、免疫細胞化学的評価は、我々のBBBモデルCENDが実際BBB 19の適切なモデルであることを示している。 in vivoでの脳内皮は2,000-5,000Ωcmの2に至るまでの経内皮電気抵抗（TEER）と非常にタイトな透過性によって特徴付けられる。細胞の医薬品、傍細胞厳密さと堅さに脳の微小血管のバリア性の研究のために考慮されるべきである。細胞は50〜100Ω·cmで2 20に至るまでTEERを呈するように、ほとんどの脳毛細血管内皮細胞（BCEC）では、これは保存されません。不死化脳内皮細胞ラインbEnd3は大きくない15 2Ωcmで60以上のTEER値を生成する。含む培地でCEND細胞のコントラスト分化に血清ディスプレイを削減300-500Ωcmで2 19,21に至るまでTEER値。 現在までに、培養された脳血管内皮細胞の伸張傷害のin vitroモデルで不足している。したがって、こちらのモデルとして培養脳血管内皮細胞という行為を用いたストレッチ傷害を通じて外傷のin vitroモデルにおいて有用であることが証明されるかもしれない。このプロトコルでは、脳細胞、BBBの特に脳微小血管内皮細胞は、TBIの間に受け取った実際の影響を模倣することができるin vitroモデル提示。このモデルの主な利点は、細胞ならびに細胞外環境に適用される損傷の量を容易に実験的なセットアップを容易に再現性を可能にする正確な方法で制御することができることである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

高い死亡事件が原因でどちらが優れ、それに関わる根本的なメカニズムは、治療に有用である理解することができるようになる方法は、外傷性脳損傷（TBI）によってもたらされる。 生体内で 、この目的のために利用可能なin vitro法の両方があります。それはTBI中に発生するようにin vivoモデルでは実際の頭部外傷を模倣することができます。しかし、in vivoでの技術で細胞生理学レベルでの研究のために悪用されることはない可能性があります。彼らは操作のための細胞や細胞外環境への容易なアクセスを提供するので、したがって、in vitro法では、この目的のために、より有利で ​​ある。 我々のプロトコルは、脳微小血管内皮細胞におけるTBI用いストレッチ傷害のin vitroモデルにおいて提示する。これは、可撓性底ウェルで培養した細胞に加えられる圧力を利用する。加えられた圧力を容易に制御することができ、低速から重度の範囲であることが損傷を作り出すことができる。ネズミ我々の研究室で生成された脳微小血管内皮細胞（CEND）したがって、同様の手法を用いる他のシステムに利点を提供する血液脳関門（BBB）のために十分に相応しいモデルである。加えて、この方法の簡略化のために、実験的なセットアップが容易に複製される。したがって、このモデルはBBBでTBIに関与する細胞および分子機構を研究に用いることができる。

私は、6ウェルフレキシブル底培養プレートをプレコートしたコラーゲン（57.75センチメートル2）上で培養した細胞は、細胞のストレッチャー装置を使用して、延伸損傷の様々な程度に供した。傷害に細胞を施した後、それらを細胞形態への伸張によって誘発される損傷の影響を顕微鏡下で調べた。これは、ストレッチの程度が大きいほど、セルの歪みの程度が大きいことも観察された細胞（ 図1）に適用したことが観察された。 図1Aに示すように、傷害に供されなかった対照細胞は、細胞膨潤や歪みの兆候ことなく、規則的な形状の血管内皮細胞（CEND）が表示されます。延伸時に怪我を適用した（ 図1B-D）、変形を光学顕微鏡下で観察することができる。 3.5-4.5 psiの間のピーク圧力で厳しく細胞を伸ばした後、CEND細胞は顕著ではないと、引っ込ん腫れや変形が登場<html>できる間隙。加えて、延伸損傷の程度が増加染み生存の取り込み（100 nMの最終濃度）（ 図2）に増加した。生存能力は、使用される染色は、細胞の細胞膜の完全性が損なわれたときに透過になり、健康な細胞への透過性染料である。染料は、それ故に、対照細胞のほとんどから除外した延伸細胞（ 図2B-D）と比較して、細胞の少ない（ 図2A）染色した。その他の細胞がストレッチ傷害の増加度合いと緑蛍光を発し。 傷害の生化学的マーカーとして、乳酸脱水素酵素（LDH）の放出酵素はまた、製造業者の指示に従って調べた。 図は、増加するセルストレッチ損傷が増加LDH放出を引き起こした3に示す。 928/50928fig1.jpg &quot;幅=&quot; &quot;500px /&gt; 図1。正常対負傷細胞の光学顕微鏡検査（A）通常延伸コンフルエント細胞単層はistightly満員と伸長。細胞は、それらが少ないコンパクトな表示され1.8-2.0ψ（ すなわち低伸張）のピーク圧力パルスを印加することによって延伸されたとき、スペースが矢印（B）で示される。細胞が適度に2.5-3.0ピーク圧力パルスが負傷したときに、それらのいくつかは、（C）膨潤して変形現れた。細胞は、矢印（D）で示される3.5〜4.5 psiの、重度のストレッチで撤回になる。 100X倍率は。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> 図2。フルーアescence正常対傷ついた細胞の顕微鏡検査損傷後の生存性染色2時間で処理した細胞：コントロール延伸セルBD：延伸細胞（B -低、C - D、中等度-重度）。。。。 100X倍率は。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> 図3。ストレッチ傷害後の上清中に乳酸脱水素酵素（LDH）酵素放出。培養培地に放出されたLDHの延伸によって誘発される傷害の後様々な時間間隔で測定した。 LDHは、全解除可能LDH（メディアプラス細胞におけるLDH）のパーセントとして表した。値は±SEMである。毎回ポイントのnは、0時間Vを除いて、5ですALUEは、n = 3の厳しいストレッチを行った。低域と適度なストレッチを行った細胞からのLDH放出は未延伸のコントロールとは、互いに有意差は認められなかった。ひどく伸びた細胞は1時間に適度に伸ばしサンプルを除く、すべての他のサンプルと比較してLDHが有意に多い量を発表した。 （P &lt;0.05、一つの要因ANOVA、ホルム-シダック法）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 表1。ストレッチ傷害の様々な程度を生成するためのガイド。 <table border="1"><tbody><tr><th>レギュレータ圧力</th><th>ピーク圧力</th><th>損傷の程度</th></tr><tr><td> 15 PSI </td><td> 1.2-1.5 PSI </td><td> &lt;低</td></tr><tr><td> 20-25 PSI </td><td> 1.8-2.0 PSI </td><td>ロー</td></tr><tr><td> 30-35 PSI </td><td> 2.5-3.0 PSI </td><td>適度</tD&gt; </tr><tr><td> 40-50 PSI </td><td> 3.5-4.5 PSI </td><td>厳しい</td></tr><tr><td> 60 PSI </td><td> 4.8から6.0 PSI </td><td> &gt;重度</td></tr></tbody></table>

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

インビトロで外傷性脳損傷モデルは、in vivo脳の変形が再現するために開発されている。延伸誘起損傷は星状細胞、神経細胞、グリア細胞、大動脈、脳内皮細胞のために用いられている。しかし、我々のシステムは、in vitro TBIモデルで確立するためにこちらの正当なモデルを構成する特性を持っている血液脳関門（BBB）モデルを使用しています。

として脳微小血管内皮細胞（CEND）でストレッチ<em&gt;インビトロ</em血液脳関門の&gt;外傷性脳損傷モデル

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K ビュー.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  インビトロで外傷性脳損傷モデルは、in vivo脳の変形が再現するために開発されている。延伸誘起損傷は星状細胞、神経細胞、グリア細胞、大動脈、脳内皮細胞のために用いられている。しかし、我々のシステムは、in vitro TBIモデルで確立するためにこちらの正当なモデルを構成する特性を持っている血液脳関門（BBB）モ...

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のMRI誘導破壊

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

医学

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

血液脳関門の破壊のラットモデルは、対象となる神経血管治療を許可する

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

外傷性脳損傷のための制御皮質衝撃モデル

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

少年ラット用マイルド外傷性脳損傷の新規モデル

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

などの酸素グルコース欠乏および再酸素化<em&gt;インビトロ</em&gt;虚血再灌流傷害モデル血液脳関門の機能障害を研究するための

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

片性および反復性軽度外傷性脳損傷のマウスモデル

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...