私たちのプロトコルは、脳卒中後の回復に影響を与える複雑な細胞メカニズムの研究のために、in vitroでヒトの血液脳関門をよりよく要約する必要性を認識しています。私たちのトリプルモデルは、坑井インサートの大きな区画化に部分的に関連する堅牢な完全性を示し、変更頻度を減らし、集団の混乱を回避することができます。私たちのモデルは、虚血性脳卒中中および虚血性脳卒中後に血液脳関門で発生する分子および細胞の変化を研究するための優れたツールです。
私たちのプロトコルは、脳卒中後の回復を改善するための新しい標的と治療法の発見を可能にします。虚血性脳卒中の現在の治療法は時間に敏感であり、結果として常に効果的であるとは限りません。まず、細胞接着のために活性化された表面を持つT75培養フラスコでHBVPを、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度でコンフルエントになるまで培養します。
コンフルエントに達したら、古い周皮細胞培地を吸引し、5ミリリットルの温かいダルベッコPBSで細胞を洗浄します。ダルベッコのPBSを吸引し、4ミリリットルの温かいトリプシンEDTA溶液と1ミリリットルのダルベッコのPBSの組み合わせを使用して、フラスコから細胞を剥離します。フラスコを二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で5分間インキュベートします。
細胞がフラスコから剥離しているかどうかを確認するために顕微鏡で観察する。2%FBSを含む5ミリリットルの温かい周皮細胞培地をフラスコに加え、剥離した細胞を50ミリリットルの遠沈管に移します。細胞懸濁液を200 gで3分間遠心分離し、細胞がチューブの底にペレットを形成するようにします。
チューブから培地を吸引し、細胞ペレットが無傷のままであることを確認します。細胞ペレットを周皮細胞培地に再懸濁する。細胞の合流点と必要なウェルインサートの数に応じて培地の量を計算します。
再懸濁した細胞を10マイクロリットル取り、細胞カウントスライドに入れて、細胞数を数えます。細胞密度を決定し、ウェルインサートの腺側に1ミリリットルの周皮細胞培地にインサートあたり300, 000細胞をシードします。本文に記載されているように、2%FBSを含むアストロサイト培地を使用して初代ヒトアストロサイトを培養します。
細胞密度を決定し、組織培養6ウェルプレートの底部にウェルあたり300, 000細胞を播種します。蒸発を防ぐためにプレートを覆い、一晩インキュベートします。同様に、テキスト原稿に記載されているように、10%FBSを含む完全な古典培地を使用して組織培養皿でHBMECを培養します。
アストロサイトを含む組織培養6ウェルプレートと周皮細胞を含むウェルインサートをインキュベーターから取り出します。組織培養6ウェルプレートからアストロサイト培地を吸引し、ペリサイト培地1ミリリットルとアストロサイト培地1ミリリットルを各ウェルに加えます。ウェルインサートから周皮細胞培地を吸引し、播種したアストロサイトを含む組織培養6ウェルプレートに入れます。
HBMECを1ウェルあたり300, 000細胞の密度で、2ミリリットルの完全な古典培地に同じウェルインサートの頂端側に播種します。細胞をダルベッコのPBSで3回洗浄します。酸素-グルコース欠乏を受けたトリプルセル培養の場合は、頂端コンパートメントと基底外側コンパートメントの両方にグルコースフリー培地を追加します。
培養液を新鮮な培地と交換し、正常酸素コントロール細胞培養液を使用します。コントロールトリプル培養液を摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。培養物の適切な加湿を提供するために、20ミリリットルの滅菌水を含むペトリ皿を低酸素インキュベーターチャンバーに入れます。
リングクランプを解除してチャンバーを開き、細胞培養物を棚に配置します。リングクランプを固定してチャンバーを密閉します。チャンバーの入口ポートと出口ポートを開き、チャンバーの流量計の上部からチューブを取り付けます。
流量計の底部からエアフィルターを介してガスタンクにチューブを取り付けます。タンク流量制御バルブを反時計回りに回して開き、ガスの流れを最小限に抑えます。時計回りに回して、圧力調整バルブをゆっくりと開きます。
毎分20リットルの流量で5分間ガス混合物でチャンバーを洗い流す。チャンバーをガス源から外し、両方の白いプラスチックclを閉じますampsしっかりと。時計回りに回してタンク流量制御バルブをオフにします。
反時計回りに回して圧力調整弁を閉じます。低酸素チャンバーを摂氏37度に設定した従来のインキュベーターに4時間入れます。滅菌したTEER機器をバイオセーフティキャビネットに入れ、電極を上皮ボルトオームメーターに差し込みます。
電極を30ミリリットルの70%イソプロピルアルコール溶液で最低30分間滅菌します。TEER機器の電源を入れ、機能をオームに設定します。70%イソプロピルアルコール溶液から電極を取り外し、TEERデバイスのデジタル読み出しがゼロオームを読み取るまで、20ミリリットルのダルベッコのPBSに最低30分間入れます。
ブランクウェルインサートコントロールのウェルインサート格納庫にある3つの開口部の1つから電極の長いプロングを挿入し、ウェルの底に触れるまで電極を下げます。短いプロングがウェルインサートの底部にある頂端培養物の上に置かれていることを確認します。TEER機器のデジタル読み出し値が水平になるまで待ってから、値を記録してください。
電極をダルベッコのPBSに戻し、測定の合間に洗浄します。さらに2つのブランクウェルインサートコントロールのすべてのTEER測定値を引き続き収集します。前に示したように、サンプルプレートのTEER測定値を収集します。
すべての測定が完了したら、電極を70%イソプロピルアルコール溶液に30分間戻します。次に、電極をTEER機器から外し、風乾させます。TEER 値を計算します。
基底外側コンパートメントから培地を吸引し、トリプルセル培養血液脳関門モデルで2ミリリットルのフェノールレッド遊離内皮細胞増殖培地と交換します。頂端コンパートメント内の細胞をHBSSで2回洗浄する。1ミリリットルのFITCデキストラン溶液を頂端コンパートメントに加え、プレートをアルミホイルで覆い、次にプレートを摂氏37度に設定したインキュベーターに5%二酸化炭素で1時間置きます。
基底外側コンパートメントから100マイクロリットルの培地を取り出し、それを黒色の96ウェルプレートに移します。励起波長と発光波長をそれぞれ480ナノメートルと530ナノメートルに設定したマイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定します。ポリD-リジンコーティングされた35ミリメートルのガラス底皿の中心に200マイクロリットルのHBMEC、初代星状細胞、およびHBVPを、皿あたり150, 000細胞の密度で播種します。
HBMECを播種する前に、皿の底に付着係数を塗ります。二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で一晩放置することにより、細胞をガラス表面に付着させます。コンフルエントに達したら、培養培地を廃棄し、酸素グルコース欠乏用の2ミリリットルの予熱したグルコースフリー培地またはコントロール用の通常の培地を追加します。
酸素-グルコース遮断処理後、すべてのディッシュで培地をイメージング最適化培地と交換し、本文に記載されているようにGFPフィルターとトップステージ共焦点顕微鏡インキュベーターを使用して蛍光生細胞イメージングを実行します。示された血液脳関門モデル構成における内皮単層のバリア完全性は、酸素-グルコース欠乏前後、および再酸素化の24時間後のTEERを決定することによって評価されました。4時間の間、酸素-グルコース欠乏は、HBMEC単培養およびHBMECおよびHBVPとの共培養モデルでのみTEER値の有意な減少を引き起こしました。
これらの減少したレベルは、24時間の再酸素化後にベースラインレベルに達しました。.三重共培養モデルのTEER値は,酸素-グルコース欠乏直後の二重共培養対照または単培養対照のTEER値よりも有意に高かった。内皮単層の20キロダルトンの分子量であるFITCデキストランに対する傍細胞透過性は、正常酸素コントロールと比較して、HBMEC単培養で劇的に増加し、HBMECおよびHBVPとの共培養モデルでは程度は低かった。
さらに、20キロダルトンのFITCデキストラン透過性レベルは、正常酸素および酸素-グルコース欠乏条件下でのすべてのモデルの中で、トリプルブレイン-血液バリアモデルで最も低かった。いずれのモデルにおいても、内皮単層を横切る70キロダルトンのFITCデキストランフラックスに変化は見られませんでした。酸素-グルコース欠乏に曝露されたすべての主要なヒトタイプは強い緑色蛍光を示し、画像化された生細胞が低酸素であることを証明しました。
ウェルインサートの腺側にヒト脳血管周皮細胞を播種した後、蒸発を防ぐためにそれらをフリッププレートで覆うことが非常に重要です。私たちのモデルでは、比較的小さな0.4マイクロメートルの細孔径のポリエステルウェルインサートを使用しているため、治療のために血液脳関門を通過する必要があるあらゆる疾患の医薬品候補のスクリーニングに適しています。この技術は、必要に応じてタンパク質やトランスポーターの修飾を可視化する絶好の機会を提供します。
