この研究は、国立精神衛生研究所の新しい科学者のためのバイオビヘイビア研究賞(BRAINS)賞R01MH113858(R.K.へ)、国立衛生研究所賞KL2 TR002542(PL)によってサポートされました。国立精神衛生研究所臨床科学者開発賞K08MH086846(R.K.へ)、シドニーRベアJr財団グラント(P.L.)ドリスデューク慈善財団臨床科学者開発賞(R.K.)、ライアン・リヒト・サン・バイポーラ財団(R.K.)、フィリス&amp; ジェローム・ライル・ラッパポート財団(R.K.)、ハーバード幹細胞研究所(R.K.へ)、スティーブ・ウィリスとエリッサ・フロイト(R.K.へ)。私たちは、彼女の批判的な読書と原稿に関するフィードバックのためにアニー・カトゥリア博士に感謝します。

ヒトiPSCは、マサチューセッツ総合病院およびマクリーン病院の機関審査委員会によって承認されたプロトコルを使用して健康なドナーの線維芽細胞から再プログラムされ、以前の研究44、45、46に記載されているように特徴付けられる。
注:簡単に言えば、線維芽細胞は、mRNAベースの遺伝的リプログラミング47を介してiPSCに再プログラムされた。iPSCは幹細胞培地(SCM)(材料リストを参照)で維持され、SCMの1mLで〜1.2 x 102 細胞/mLの密度で保存され、Rho関連プロテインキナーゼ阻害剤(ROCKi)Y-27632、および10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)の凍結物でC-液体中に凍結した。 以下の手順はすべて、特に明記されていない限り、バイオセーフティキャビネットで行われます。
1. 基質膜マトリックス希釈およびプレートコーティング
<ol><li>希薄(1:50)成長因子は、フェノールレッドなしのダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)のエンゲルブレス-ホルム群発腫瘍から精製された基質膜マトリックスを減少させた。</li>
	<li>細胞培養プレートに適量の希釈基質膜マトリックス(すなわち、6ウェルプレート=1mL、12ウェルプレート=0.5mL)を塗布し、これらのプレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。</li>
</ol>2. iPSC メンテナンス
注:6ウェルフラットボトムプレートのウェルあたりの最大合流値は〜1.2 x 106 細胞です。
<ol><li>凍結保存されたiPSCを10 μM Y-27632でSCMに解凍し、希釈成長因子でコーティングされた6ウェルプレートにプレートを貼り付け、基部膜マトリックスを減少させます。</li>
	<li>解凍後の最初の24時間、10 μM Y-27632でIPSCをSCMに維持します。24時間後に新鮮な培地に切り替えます。</li>
	<li>細胞が合格する前に80-90%の合流度に達するまで、SCMでiPSCを維持します。<ol>
<li>分化に必要な密度(15,600セル/cm2)をウェルの表面積で乗算することにより、分化に必要なiPSCの数を計算します。6ウェルフラットボトムプレートの場合、15,600個のセル/cm2 に9.6cm2 を掛け、合計149,760個の細胞/ウェルを求めます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通過するには、ハンクスのバランス塩溶液(HBBS)で細胞を洗います。次いで、37°Cで5分間非酵素性エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)(材料リストを参照)で細胞をインキュベートする。<ol>
<li>セルスクレーパーを使用して、細胞をそっと持ち上げます。新鮮なSCMで細胞を収集します。</li>
		<li>細胞を希釈したSCMでコーティングし、ステップ2.3に記載されているように細胞を維持するか、SCMの1mL、10μM Y-27632、および10%DMSO(v/v)を-160°Cの温度で液体窒素中の凍結保存バイアルに保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. BMEC に対する iPSC の差別化
注: 非酵素 EDTA は細胞を束に分離します。酵素EDTA( 材料表を参照)は、細胞を単一細胞懸濁液に分離する。レチノイン酸(RA)は光から保護する必要があります。
<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩基(DPBS)でiPSCを一度洗います。酵素EDTA(6ウェルプレート用1mL、12ウェルプレートの場合は0.5mL、24ウェルプレートでは0.25mL)を37°Cで約5分間インキュベートし、単一の細胞懸濁液を得る。</li>
	<li>細胞と遠心分離機を室温で5分間300xg(相対遠心力)で収集します。10 μM Y-27632 を含む SCM の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>トリパンブルーと自動セルカウンターまたはヘモサイトメーター装置を使用して細胞密度を決定します。SCMの15,600細胞/cm2 または149,760細胞/ウェルの密度のプレートセルは、10 μM Y-27632を24時間含むSCMの6ウェルフラットボトムプレート(表面積9.6 cm2/well)です。</li>
	<li>SCMをE6培地に変更して24時間後に分化を開始します。次の4日間、E6培地を毎日変更します。</li>
	<li>分化の4日目に、希釈(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAを添加したhESFMでE6培地を交換してください。このメディアは、次の 48 時間変更しないでください。</li>
	<li>希釈(1:200)B27でhESFMの200 mLを調製し、hESFMの199 mLに50倍濃縮B27サプリメントの1 mLを混合します。</li>
	<li>トリスバッファー(5 mMトリス、pH 7.6、150 mM NaCl)の250 μLで50 μgのbFGFを再構成して、200 μg/mL のストック溶液を作り出し、bFGF の 20 ng/mL を調製します。200 μg/mL bFGF の 20 μL を 200 mL の hESFM と混合して 200 ng/mL bFGF を含む hESFM の 200 mL を準備します。</li>
	<li>まず、2.5 mLのDMSOを100mgのRA粉末に加えて、40mg/mLのRAストック溶液を作って10μM RAを調製します。この濃度を3 mg/mLに希釈して10 mMのストック液を作ります。10μM RAを含むhESFM 200 mLを200 mL hESFMに200 μM RAの200 μL混合して準備します。</li>
</ol>4. iPSC由来BMECの精製用コラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスのコーティング
<ol><li>2 mg/mL FNストック溶液を作るためにFNの2mgに滅菌水の2 mLを加えます。5 mg/mL COL4 ストック溶液を作るために5 mg の COL4 に無菌水の 5 mL を加えます。<ol>
<li>FNを37°Cで少なくとも30分間溶解させ、コル4を室温で溶解させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌水中のFNストック溶液を100 μg/mLの最終濃度に希釈し、コル4ストック溶液を400 μg/mLの最終濃度にします。</li>
	<li>目的のプレート(6ウェルプレート=1mLのCOL4/FN溶液、12ウェルプレート=0.5mL、24ウェルプレート=0.25mL、12トランスウェル濾過プレート=0.25mL)を400μg/mL COL4と100μg/FNLの混合物でコーティングします。</li>
	<li>プレートを37°Cで最低2時間または一晩インキュベートします。トランスウェルの濾過プレートには、最低4時間を推奨します。</li>
</ol>5. iPSC由来BMECsのサブカルチャーと精製
注:酵素EDTAによるインキュベーションは、分化の6日目の細胞の合流度に応じて15分以上かかることがあります。
<ol><li>分化の6日目に、DPBSで細胞を2回洗浄する。1 mLの酵素EDTAを1mLで、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間インキュベートする。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈された(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>400 μg/mL COL4 と 100 μg/mL FN の混合物でコーティングされたプレートに細胞をシード. 12 ウェルプレートの 3 ウェルに対する 6 ウェルの比率を使用して、12-トランスウェルフィルタープレートの 3 つのウェル、または 24 ウェル プレートの 6 ウェル。</li>
	<li>同じ細胞株から、TEER分析用の負のコントロールとして、12トランスウェル濾過プレートをコーティングした12トランスウェルにコーティングされたプレートに未分化のiPSCをシードします。</li>
	<li>サブ培養の24時間後、B27サプリメントのみで培地をhESFMに変更する。この手順の後に、メディアの変更は必要ありません。</li>
</ol>6. 発芽アッセイ
<ol><li>8日目のiPSC由来BMECを収集し、100,000個の細胞/ウェルで播種し、200μL/cm2 の基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルフラットボトムプレートに播種します。</li>
	<li>これらの細胞を希釈(1:200)B27および40ng/mLの血管内皮増殖因子A(VEGFA165)で治療してください。</li>
	<li>細胞を24時間ごとに観察し、2日ごとに培地を変える。</li>
</ol>7. 免疫細胞化学(ICC)
メモ:ICCは24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。
<ol><li>48時間のサブ培養(8日目)の後、DPBSで細胞を2回洗浄する。4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を20分間固定します。</li>
	<li>DPBSで細胞を3回洗浄し、1回5分洗浄します。5%ロバ血清と0.3%トリトンX-100(v/v)を用いたDPBSの室温で1時間のプレブロック細胞。</li>
	<li>一次抗体でインキュベート:マウス抗ヒトPECAM1(1:100、ストック0.5mg/mL)、ウサギの抗ヒトTJP1(1:200、 在庫 0.53 mg/mL、マウス抗ヒトCLDN5(1:200、在庫0.5 mg/mL)、マウス抗ヒトOCLN(1:200、ストック0.5 mg/mL)、ウサギの抗ヒトSLC2A1(1:100、在庫0.2 mg/mL)、DPBSで一晩で5%のドンキーを含む<ol>
<li>DPBSで細胞を一度洗い流し、次にDPBSで1回5分間洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次抗体を含むインキュベート細胞:ロバ抗ウサギアレクサFluor 555(1:200)とロバ抗マウス488(1:200)を含むDPBSで5%ロバ血清を1時間含む。</li>
	<li>このインキュベーションに続いて、Hoechst 33342三水塩化物三水和物をDPBSで10分間希釈(1:1000)を加えます。<ol>
<li>Hoechst 33342溶液を取り出し、DPBSで1回洗い流し、1回の洗浄につき5分間DPBSで4回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、細胞メーカーの発現と局在を探します。</li>
</ol>8. TEERの測定および分析
注:コーニング12-トランスウェル濾過プレートは、1.12 cm2 ポリエチレンテレフタレート膜および0.4マイクロメートルの細孔からなるフィルタが装備されています。TEERの測定は技術的(ウェルあたり3)および生物学的複製(細胞株および/または条件当たり3つのウェル)で得られる。
<ol><li>サブ培養(7日目)の24時間後に、24時間ごとに箸電極とボルトメーターを使用してTEERを測定します。測定の取得に関する具体的な説明については、voltohmmmeterユーザーマニュアルを参照してください。<ol>
<li>TEERを測定するには、前の晩に電圧計計を充電します。楽器と箸の電極を70%エタノールで軽く拭き取ってから、安全フードに入れます。</li>
		<li>電源を入れ、製造元が推奨するオームメーターを調整します。</li>
		<li>70%エタノールを使用して箸の電極とリンス電極を差し込み、その後DPBSを使用します。</li>
		<li>短い端電極をトランスウェルインサート(アピカルチャンバー)に入れ、長い端をバソラハアチャンバーに入れます。</li>
		<li>まず、COL4/FNのみでコーティングされたブランクウェルを測定します。その後、他の井戸を測定します。</li>
		<li>異なる条件(すなわち異なる細胞株を測定する)を測定するとき、70%エタノールとDPBSで箸の電極を素早くすすぐ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての測定(Ω)が記録された後、70%エタノールと滅菌水で箸の電極をすすいでください。電極を軽く拭き取り、安全フード内で空気を乾燥させます。</li>
	<li>空白ウェルから TEER 値 (Ω) を 3 重に平均し、条件ごとに各未加工の TEER 値からこの平均値を差し引きます。<ol>
<li>減算された値を平均化し、1.12 cm2 (12 トランスウェル挿入物の表面積) を掛けます。</li>
		<li>ステップ 6 の変換された値を使用して、TEER 測定の各日の TEER 値と標準誤差を示すグラフを生成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 流出トランスポーターの活動と分析
注:流出トランスポーター活性アッセイは、24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。目的の流出トランスポーターは、ABCB1およびABCC1を含む。各条件は、コントロールウェル(すなわち、それぞれの阻害剤のないブランクウェル)で三重に行われることをお勧めします。
<ol><li>48時間のサブ培養(8日目)の後、10μMバルスポダール(ABCB1阻害剤)または10μM MK571(ABCC1阻害剤)を37°Cで1時間インキュベートする。<ol>
<li>412 μLのDMSOに5mgの粉末(1214.64 g/mol)を溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mMバルスポダールストックを調製します。例えば、10 μM バルスポダールで 10 mL の hESFM を作るためには、10 mM バルスポダールの 10 μL を 10 mL の hESFM と混ぜます。</li>
		<li>5 mg粉末(537.07 g/mol)を931 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM MK571ストックを調製します。例えば、10 μM MK571で10 mLのhESFMを作るためには、10 mM MK571ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1時間後、10μMローダミン123(ABCB1基質)または10μM2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセインジアセインジアセア(H2DCFDA、ABCC1基質)を37°Cで1時間、または無用にインキュベートする細胞。<ol>
<li>10 mgの粉末(380.82 g/mol)をDMSOの875 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して10 mMローダミン123を調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。</li>
		<li>50 mgの粉末(487.29 g/mol)を10.26 mLのDMSOに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM H2DCFDAを調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5%トリトンX(v/v)を含むDPBSを使用して、0.5 mLのDPBSと溶菌で細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>マルチプレートまたはマイクロプレートリーダーを使用して、細胞の発光を測定します(材料リストを参照)。<ol>
<li>蛍光プレートリーダーの計測器を485ナノメートル励起と530ナノメートルの発光に設定し、これらの波長で蛍光を測定します。</li>
		<li>トランスポーターアッセイに使用されていないウェルの場合、細胞核定量のために4%PFAで固定する前に、DPBSで細胞を2回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hoechst 33342三水和物を用いたインキュベート細胞は、DPBSで10分間希釈した三水塩化物(1:1000)各ウェルに複数の視野を画像化し、蛍光顕微鏡を用いて平均細胞核数を計算する。</li>
	<li>フィジーを使用して核を数え、これらのカウントに細胞ごとに蛍光値を正規化します。<ol>
<li>それぞれのブランク値から各条件の生蛍光蓄積値を差し引いて、蛍光の平均蓄積を計算する。</li>
		<li>各条件の平均減算値。</li>
		<li>ステップ 9.6.1 の平均値を平均セル数で割ります。これらの値を使用して、細胞ごとに蛍光値を正規化します。</li>
		<li>正規化された値を使用して、各インヒビター条件のグラフィカル表現を生成し、必要な統計分析を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. BMECのパッシング、拡大、凍結保存
<ol><li>希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで8日目のBMEC培養物を補充し、細胞がCOL4 / FNマトリックスでさらに2日間拡大できるようにします。</li>
	<li>新しい12-トランスウェルろ過プレートと24ウェルフラットボトムプレートに400 μg/mL COL4と100 μg/mL FNをコーティングし、4時間インキュベートします。</li>
	<li>10日目に、DPBSで細胞を洗浄し、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間酵素EDTAの1mLでインキュベートする。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。<ol>
<li>これらの細胞を凍結保存するには、30%の胎児ウシ血清(FBS)および10%DMSOで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
		<li>iPSC由来のBMECを-80°Cで最初の24時間イソプロパノール容器に凍結保存されたバイアルに保存し、次に液体窒素に入れて-160°Cで長期保存します。</li>
		<li>これらの細胞を通過させるために、希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ10.2で調製したコーティングされたプレートに細胞をシードする。6ウェルプレートの1ウェルの比を使用して、12-トランスウェル濾過プレートの3つの井戸と24ウェルプレートの6ウェルにシードセル。細胞が 24 時間成長し、拡大することを許可します。</li>
	<li>11日目に、ステップ8に記載されているステップに従ってTEERを測定します。</li>
	<li>12日目に、手順9に記載されている手順に従ってICCを実行します。</li>
	<li>凍結保存されたBMECを解凍するには、凍結保存されたバイアルを温水またはビーズバスの37oCに入れます。解凍したBMECsを希釈(1:200)B27で補ったhESFMの5 mLに移します。<ol>
<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈(1:200)B27、10 μM RA、10 μM Y-27632を補ったhESFMで細胞を再懸濁します。</li>
		<li>24時間後、希釈された(1:200)B27と10 μM Y-27632を添加したhESFMに媒体をRAなしで切り替える。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

変更とトラブルシューティング
このプロトコルでは、BMECsの誘導のためにiPSC培養中に一般的に使用される細胞外マトリックスおよび細胞培養培地を使用する際にいくつかの変更を加えた(図1)。これらの変更は、Lippmann プロトコル1に記載されているように、ヒト iPSC から BMECS を導出する能力に影響を与えませんでした?...

血液脳関門機能 血液脳関門(BBB)は、血液から脳への物質の移動を制限する境界を形成する。BBBは、血管系を裏打ちする単層を形成する脳内血管内皮細胞(BMEC)で構成される。BMECは、アストロサイト、ニューロン、ペリサイト、ミクログリア、および細胞外マトリックスと共に、神経血管ユニットを形成する。BMECは、BBBが高い経皮電気抵抗(TEER)を維持することを可能にする厳しく調節されたパラセルラー構造を有し、受動拡散を制限し、バリア完全性1、2の指標として機能する。BMECsはまた、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、およびトランスマイグレーションなどの細胞間移動を助けるタンパク質、ならびに免疫応答3中の白血球の飛散を助けるタンパク質を有する。BMECは、脳内の恒育的バランスを維持するために、廃棄物の栄養と除去のために流入および流出輸送器に依存しています3.例えば、溶質キャリアファミリー2メンバー1(SLC2A1)は、BBB4を横切るグルコースの移動を担う流入トランスポーターであり、ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1(ABCB1)およびATP結合カセットサブファミリーCメンバー1(ABCC1)などの流出トランスポーターは、基材を血流3、5、6、7に戻す責任を負う。ABCB1基質は、モルヒネ、ベラパミル4、オランザピンおよびリスペリドン8などの抗精神病薬を含み、一方、ABCC1トランスポーターは、硫酸コンジュゲート、ビンクリスチン、グルクロニド共役体4を含む様々な基質を有する。
精神障害におけるBBBモデルの応用 BBB機能障害は、統合失調症および双極性障害9,10を含む多くの神経学的および精神疾患に関与している。近年、iPSC由来のex vivo細胞モデルは、精神疾患の細胞および分子基盤を問い合わせるのに利用されているが、これらのモデルは現在、神経血管系11、12、13が果たす潜在的な役割を考慮していない。血液中を循環する末梢炎症性サイトカインがBBB14、15、16、17に悪影響を及ぼす可能性があると仮定されているが、細胞内18、19、20、21、22、トランスセルラー23、24、25、26、27、28、29、および細胞外マトリックス20、29、302、32に対する異常を示す証拠もある。 BBBの破壊は、血液の内容物が脳実質に入り、アストロサイトおよび/またはミクログリアを活性化して炎症性サイトカインを放出し、脳34に有害な影響を及ぼし得る炎症反応33を開始する。BMECはBBBの主要な構成要素であり、これらの細胞の構造および機能を調べることは、神経学的および精神障害におけるBBB機能不全の理解を高めることができる。
代替BMECモデル iPSC1,6,35,36からBMECを導出するための効率的なプロトコルが開発される前に、研究者はBBB機能を研究するために不死化BMEC37を採用していました。しかしながら、これらのモデルの多くは望ましいBBB型を達成することができず、このようなTEER値の生理学的範囲は38,39である。iPSCを利用することは、細胞が由来する個体の遺伝的背景を保持するという利点がある。科学者たちは、人間の脳の構造と機能を再現するiPSC由来のex vivo微小環境モデルの確立に積極的に取り組んでいます。研究者たちは、生体内で見つかったBMECsと構造的および生理的に類似したBMECを導き出す方法を開発した。iPSC由来BMECの精製集団を得るための方法は、プロトコルが過去数年間に最適化されているいくつかの異なるステップを必要とします1,6,35,36.一般に、iPSC由来BMECは、エッセンシャル6(E6)培地で4日間培養され、続いてヒト内皮無血清培地(hESFM)に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、レチノイン酸(RA)、およびB27サプリメントを添加して2日間培養する。次に、細胞をコラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスで培養し、90%均質BMECs1を得る。
BMECの同一性は、血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM1)、SLC2A1、およびタイト接合タンパク質1(TJP1)、閉塞子タンパク質(OCLN)、およびクローディン-5(CLDN)6などの緊密な接合タンパク質を含むBMECタンパク質の共発現を示す免疫蛍光によって確認される。発芽アッセイは、iPSC由来BMECの血管新生電位を確認するために使用されてきた。6 BMECのBBB完全性は、ヒロインテエル値(〜2000Ω xcm2)37の存在とABCB1およびABCC11、6、36などの流出トランスポーターに対する測定可能な活性によって評価される。Lippmannグループによる最近の方法論的進歩は、実験変動性の低下と再現性の強化を伴うiPSC由来のBMECプロトコルに至った。しかし、彼らがサブ培養段階を超えて拡大し、通過できるかどうかは不明である。私たちの変更されたプロトコルは、8日目以降にiPSC由来のBMECを渡し、凍結保存後にBBBプロパティをさらに拡張できるかどうかを評価することによって、この問題に対処することを目指しています。iPSC由来BMECの経食について記述した研究はないが、凍結融解サイクル40を受けた後に生理学的BBB特性を保持するBMEC凍結保存のためのプロトコルが存在する。しかし、凍結保存後BMECを通過させ、BBB特性を保持できることは知られていない。
Lippmann プロトコルを使用して iPSC から派生した BMEC は、ハンチントン病などの神経疾患における BBB 破壊をモデル化するために利用されてきた7.このようなiPSC由来BMECは、それぞれ41,42の血液CSFバリア及びBBBの破壊に対するナイセリア髄膜炎又はB群連鎖球菌などの細菌感染の影響を調べるためにも用いられている。また、統合失調症患者の22q欠失症候群患者からのiPSC由来BMECを用いて、研究者は、脳43への白血球の募集および外挿を補助するBMECの主要な接着分子である細胞間接着分子-1(ICAM-1)の増加を観察した。これらの研究をまとめると、複雑な神経精神疾患におけるBBB破壊を研究するためのiPSC由来BMECの有用性を示す。

<table><tbody><tr><td>2&amp;prime;,7&amp;prime;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6964-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>3528S</td><td></td></tr><tr><td>CLDN5 (Claudin-5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV from human placenta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>&amp;nbsp;8670</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Countess slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (without phenol red)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;A1413202</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2438-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-2mg</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelial serum-free medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 6000</td><td>General Electric</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&amp;nbsp;Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MK-571</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7571-5MG</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Occludin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human VEGF 165</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 (GLUT-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA1-21041</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Cell Signaling</td><td>81778S</td><td></td></tr><tr><td>TJP-1 (ZO-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA5-28869</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0572-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Versene solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td><td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

脳内血管内皮細胞(BMEC)は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から分化し、血液脳関門(BBB)機能を研究するためのex vivo細胞モデルを開発することができます。この変更されたプロトコルは、以前のプロトコルで報告されたものとは異なるドナーと試薬を使用して、ヒトのiPSCからBMECを導き出し、拡張し、凍結保存するための詳細な手順を提供します。iPSCは必須6培地で4日間処理され、続いて2日間のヒト内皮無血清培地に塩基性線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、およびB27サプリメントを添加した。6日目に、細胞をコラーゲン/フィブロネクチンマトリックス上で2日間分培養する。免疫細胞化学は、CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1、およびSLC2A1を用いたBMECマーカー分析のために8日目に行われる。ウェスタンブロッティングは、BMECマーカー発現を確認するために行われ、および、内皮マーカーであるSOX17の不存在を確認する。血管形成の可能性は、発芽アッセイで実証される。7日目から箸電極と電圧計を用いて、電気抵抗(TEER)を使用して、内皮間を越えた電気抵抗(TEER)を測定します。ATP結合カセットサブファミリーB部ファミリーB部材1及びATP結合カセットサブファミリーC部材1に対する流出トランスポーター活性は、8日目にマルチプレートリーダーを用いて測定される。BMECsの誘導に成功した、関連する細胞マーカーの存在によって確認され、SOX17の低レベル、血管新生電位、トランスポーター活性、およびTEER値〜2000 Ω xcm2。BMECは、コーティングされたばかりのコラーゲン/フィブロネクチンプレートまたは凍結保存に加える前に、10日目まで拡張されます。このプロトコルは、iPSC由来のBMECを少なくとも1回拡張して通行できることを示しています。しかしながら、凍結保存後に、低いTEER値およびBMECマーカーの局在化不良が観察された。BMECは、他の細胞タイプ(ニューロン、グリア、ペリサイト)、3次元脳モデル(オルガンチップおよびヒドロゲル)、脳オルガノイドの血管化、および神経精神疾患におけるBBB機能障害の研究に使用できます。

BMEC差別化 このプロトコルのいくつかの重要な手順は正確に実行する必要があります (図 1) 。1日目のE6培地使用は重要であり、比較的短時間でiPSCから神経外発性系統を導出するために用いられることが多いため、複数の細胞株36にわたって再現可能な結果を生み出す。もう一つの重要なステップは、E6培地が希釈された(1:200)B27、20 ng / mL b...

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Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.3K ビュー.  Massachusetts General Hospital. 本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

神経科学

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

発生生物学

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPS細胞由来HPCを用いた常在性ミクログリアを用いたヒト脳オルガノイドの作製

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central nervous system (CNS) by penetrating highly specialized brain endothelial cells (BECs). As Nm is a human-specific pathogen, the lack of robust in vivo model systems makes study of the host-pathogen interactions between Nm and BECs challenging and establishes a need for a human based model that mimics native BECs. BECs possess tighter barrier properties when compared to peripheral endothelial cells characterized by complex tight junctions and elevated trans-endothelial electrical resistance (TEER). However, many in vitro models, such as primary BECs and immortalized BECs, either lack or rapidly lose their barrier properties after removal from the native neural microenvironment. Recent advances in human stem-cell technologies have developed methods for deriving brain-like endothelial cells from induced pluripotent stem-cells (iPSCs) that better phenocopy BECs when compared to other in vitro human models. The use of iPSC-derived BECs (iPSC-BECs) to model Nm-BEC interaction has the benefit of using human cells that possess BEC barrier properties, and can be used to examine barrier destruction, innate immune activation, and bacterial interaction. Here we demonstrate how to derive iPSC-BECs from iPSCs in addition to bacterial preparation, infection, and sample collection for analysis.

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

The protocol described here highlights the major steps in the differentiating induced pluripotent stem-cell derived brain-like endothelial cells, the preparation of Neisseria meningitidis for infection, and sample collection for other molecular analyses.

髄膜炎菌 人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

免疫・感染学

Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous system (CNS). Due to the limited access to disease-related BBB samples, it is still not well understood whether BBB malfunction is causative for disease development or rather a consequence of the neuroinflammatory or neurodegenerative process. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) therefore provide a novel opportunity to establish in vitro BBB models from healthy donors and patients, and thus to study disease-specific BBB characteristics from individual patients. Several differentiation protocols have been established for deriving brain microvascular endothelial cell (BMEC)-like cells from hiPSCs. Consideration of the specific research question is mandatory for the correct choice of the respective BMEC-differentiation protocol. Here, we describe the extended endothelial cell culture method (EECM), which is optimized to differentiate hiPSCs into BMEC-like cells with a mature immune phenotype, allowing the study of immune cell-BBB interactions. In this protocol, hiPSCs are first differentiated into endothelial progenitor cells (EPCs) by activating Wnt/&#946;-catenin signaling. The resulting culture, which contains smooth muscle-like cells (SMLCs), is then sequentially passaged to increase the purity of endothelial cells (ECs) and to induce BBB-specific properties. Co-culture of EECM-BMECs with these SMLCs or conditioned medium from SMLCs allows for the reproducible, constitutive, and cytokine-regulated expression of EC adhesion molecules. Importantly, EECM-BMEC-like cells establish barrier properties comparable to primary human BMECs, and due to their expression of all EC adhesion molecules, EECM-BMEC-like cells are different from other hiPSC-derived in vitro BBB models. EECM-BMEC-like cells are thus the model of choice for investigating the potential impact of disease processes at the level of the BBB, with an impact on immune cell interaction in a personalized fashion.

Here, we describe a protocol, the extended endothelial cell culture method (EECM), that allows differentiation of pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell (BMEC)-like cells. These cells show endothelial cell adhesion molecule expression and are thus a human blood-brain barrier model suitable to study immune cell interactions in vitro.

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous ...

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

要約

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この動画の章

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

髄膜炎菌人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

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として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

髄膜炎菌 人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

髄膜炎菌人工多能性幹細胞由来脳内皮細胞の感染