このプロトコルは、分化された人工多能性幹細胞をオルガンオンチップに播種して、中枢神経系の薬物透過性を予測し、神経疾患を研究するために使用できる完全にヒトでパーソナライズされたマイクロ流体血液脳関門を生成する方法を示す。市販のオルガンオンチップを使用して、生物学的指向のラボがこの技術を使用して、パーソナライズされたマイクロ流体血液脳関門オンチップを生成する方法を実証します。証拠の蓄積は、BBBが遺伝性神経疾患を有する個人のiPSCに由来するパーソナライズされたBBBチップを生成することによって神経疾患に役割を果たしていることを示唆している。
健康と病気におけるBBBの役割を研究することが可能になります。この方法はまた、製薬会社のために有用であり得る, これは、人間の脳に候補神経薬の浸透性をスクリーニングするために、この人間のBBBプラットフォームを使用することができます.オルガンオンチップ技術の応用には、通常、専門的なエンジニアリングスキルが必要です。
市販のプラットフォームを使用することで、生物学的指向のラボでこの技術を適用できます。まず、準備したチップを含む皿をバイオセーフティキャビネットに持って行きます。P200ピペットを使用して、200マイクロリットルの神経分化媒体を入口に加え、液体を出口から引き出すことによって、両方のチャネルを穏やかに洗浄します。
ポートとの接触を避け、チップの表面から余分な媒体液滴を慎重に吸引する。細胞懸濁液を穏やかに撹拌し、均質な細胞懸濁液を確保します。iPSC由来の神経前駆細胞をトップチャネルに播種して脳側を生成するには、1ミリリットル当たり10倍の濃度で30~100マイクロリットルの細胞懸濁液を含むP200チップをトップチャネル入口に加え、ピペットから先端を静かに放出します。
空のP200ピペットを取り、プランジャーを押し、上部チャネル出口に挿入し、慎重にチップを通して単一細胞懸濁液を引き出します。チップを顕微鏡に移して、トップチャネル内の細胞の播種密度と均質な分布を確認します。20%のカバレッジで細胞密度を確認した後、すぐに37°Cで2時間インキュベーターにチップを入れます。
その後、新鮮な神経分化培地を入口に加え、出口からピペットを介して液体を引っ張ることによって、付着しない細胞を洗い流します。毎日の神経分化培地交換で37°Cの静的条件下で細胞を保ちます。iNPCが取り付けられた後、または播種後のその後の日に、準備されたチップを含む皿をバイオセーフティキャビネットに持って来てください。
底流路を200マイクロリットルの内皮細胞培地で静かに洗います。ポートとの接触を避け、チップの表面から過剰な内皮細胞媒体の液滴を慎重に吸引し、両方のチャネルに培地を残すことを確認する。細胞懸濁液を穏やかに撹拌し、均質な細胞懸濁液を確保します。
P200ピペットを用いて、iPSC由来脳内皮細胞懸濁液の30~100マイクロリットルを1ミリリットル当たり6個の細胞に14~20倍の濃度で引き上げ、先端をボトムチャネルインレットに入れ口に入れる。機能性バリア特性を達成するための最も重要なステップは、脳内皮細胞の播種である。適切な密度で細胞をシードして、オルガンチップ内の均質な分布を検証するために、泡の形成を避けることは重要です。
P200ピペットのプランジャーを空のチップで押し下げ、下チャンネルの出口に挿入し、ピペットプランジャーをゆっくりと解放して、下のチャネルを通して単一細胞の懸濁液を慎重に引っ張ります。余分な細胞懸濁液をチップの表面から吸引する。細胞懸濁液がチャネルから吸引されないように、入口ポートと出口ポートとの直接接触を避けてください。
チップを顕微鏡に移して、播種密度を確認します。下のチャネルは、間に観察可能なギャップのないセルで埋められます。正しい細胞密度を確認した後、残りのチップに細胞をシードします。
底チャンネルの上部にある多孔質膜に細胞を取り付けるには、各チップを反転させ、チップクレードルで休ませます。150ミリメートル皿の中に滅菌DPBSを含む小さな貯水池を置き、細胞に湿度を提供します。チップを約37°Cで約3時間、または下部チャネルの細胞が取り付けられるまでインキュベートします。
iPSC由来の脳内血管内皮細胞が付着したら、チップを直立した位置に戻し、細胞が下部チャネルの下部に付着できるようにします。iPSC由来脳微小血管内皮細胞の播種後48時間、37°Cの水浴で1時間温温することにより内皮細胞培地の温度を平衡化する。次いで、真空駆動ろ過システム下でインキュベーションにより培地を15分間脱気する。
次に、70%エタノールで携帯用モジュールのパッケージとトレイの外装を消毒し、拭き取り、バイオセーフティキャビネットに移します。パッケージを開き、モジュールをトレイの奥に向けてリザーバに向けます。各入口貯留層に事前に平衡した、暖かい媒体のピペット3ミリリットル。
最下チャネルの入口貯留層に内皮細胞培養培地を加え、上部チャネルの上部チャネル入口貯留部に神経分化培地を加える。次いで、ピペット300マイクロリットルの予め平衡化された、各出口貯留層に、各出口ポートを直接上に向ける。各トレイに最大6台のポータブルモジュールを配置します。
トレイをインキュベーターに持ち込み、トレイハンドルを外側に向けて培養モジュールに完全にスライドさせます。カルチャ モジュールでプライム サイクルを選択して実行します。インキュベーターのドアを閉め、培養モジュールがポータブルモジュールを約1分間プライムできるようにします。
ステータス バーが準備完了したら、プライミング サイクルが完了します。トレイを培養モジュールから取り出し、バイオセーフティキャビネットに持ち込みます。バイオセーフティキャビネットの各ポータブルモジュールの下側を調べて、ポータブルモジュールが正常にプライミングされたことを確認します。
4つのポートすべてに小さな液滴が存在することを探します。任意のポータブルモジュールがドロップレットを表示しない場合は、それらのモジュールのプライムサイクルを再実行します。コンセントポートによって頻繁に発生するトレイにメディアが滴り落ちた場合は、70%エタノールでトレイをクリーニングします。
次に、各チップの両方のチャネルを暖かく平衡化された細胞特異的培養培地で穏やかに洗浄し、チャネル内の可能な泡を除去し、各入口と出口ポートの上部に小さなメディアの液滴を置きます。キャリア付きチップをポータブルモジュールに挿入し、各トレイに最大6個を置きます。トレイをカルチャ モジュールに挿入します。
流量や伸張などの適切な臓器チップ培養条件を培養モジュールにプログラムします。規制サイクルが完了すると、約2時間かかるとすぐに、プログラムされた条件が開始されます。その後、培養モジュールは、プリセット臓器チップ培養条件で流れ始める。
iPSCベースの血液脳関門チップの免疫細胞化学は、7日後に、S100β陽性アストロサイト、ネスチン陽性神経前駆細胞、GFAP陽性アストロサイト、βIIIチューブリン陽性ニューロンを含む、トップ脳側チャネルの混合神経細胞集団に分化されたEZ球を示す。底部の血液側チャネルに播種されたIPSC由来脳微小血管内皮細胞は、GLUT-1およびPECAM-1を発現した。血液脳関門チップ透過性の評価は、iPSC由来脳内皮細胞およびEZ球を播種した臓器チップが、iPSC由来の脳内皮細胞を播種した臓器チップと比較して緊密な障壁を有していたことを示している。
EZ球体のみで播種されたオルガンチップは、バリア特性を示さなかった。チャネルの初期表面処理から毎日の媒体切り替えまで、チャネル内の気泡の形成を避ける。表面活性化試薬、細胞外マトリックス、または細胞含有媒体をチャネルを介して挿入する必要があるプロトコルのステップを通して、気泡が見つからないことを注意深く検証することが非常に重要です。
透過性アッセイは、候補薬物のヒト脳浸透性を評価するために行うことができる。このアプローチは、潜在的な治療薬をテストするのに役立ちます。iPSCベースのBBBチップを応用することで、様々な神経疾患におけるBBBの役割を研究することができます。
将来的には、このようなプラットフォームは、予測的でパーソナライズされた医療アプリケーションに役立つ可能性があります。
