Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

我々 は感謝し、ピーター ネルソン博士とすべての人間の脳組織サンプルを提供するため英国 ADC 脳組織銀行でソニア ・ アンダーソンを認める (NIH 付与数: 国立老化研究所から P30 AG028383)。グラフィカルな援助、マット ・ ハザードとトム ・ ドーラン、情報技術サービス、学術技術と学部婚約、ケンタッキー大学に感謝しますこのプロジェクトはだった (B.B.) に国立神経疾患と脳卒中から許可番号 1R01NS079507 によって (A.M.S.H.) に国立老化研究所から許可番号 1R01AG039621 でサポートされています。内容は著者の責任と高齢化に関する国立研究所の神経疾患と脳卒中や国立研究所の公式見解を必ずしも表さない。著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

以下の情報は、現行の安全およびケンタッキーの大学, レキシントン、ケンタッキー、米国で規制の基準に基づいています。安全対策として人間の組織で作業する前に機関の生物学的安全プログラムと最新の規則と推奨事項を参照してください。
注意: 人間の組織は、ひと免疫不全ウイルス (HIV)、B 型肝炎ウイルス (HBV)、C 型肝炎ウイルス (HCV) を含む血液媒介病原体の源をすることができます。人間の組織での作業血液媒介病原体からの感染リスクがあります。したがって、研究者を保護するために人間の組織を操作するとき、特定の規制や安全性は不可欠です。米国における人の組織のバイオ セーフティ レベル 2 の実験室と同様、安全上の注意と NIH のセクション IV B 7、1970年句 5(a)(1) とユーザーの制度的生物学的安全性プログラムの OSHA の法律に従ってトレーニングが必要です。一般に、人間の材料 (組織、体液) を含む任意の研究を行う前に機関のバイオ セーフティ委員会や治験審査委員会の承認を得なければなりません。訓練は全員人間材料での作業に必要な基礎実習安全教育など、化学衛生学および実験室の安全と同様、生物学的安全性、有害廃棄物、人間の特定のトレーニングが含まれています血液媒介病原体。人間の材料とすべての職員は、人間の材料で作業する前に、B 型肝炎の予防接種を取得する一押しです。人事は人間の材料、例えば作業中の特定の保護具を着用する必要。、カフ付き白衣とシールド、および手袋を着用してすべての回での顔。バイオ セーフティ キャビネット (クラス 2) で、すべての作業が実行されます。ひと由来資料から人間の材料との接触や、廃棄物は、すべての装置は、汚染や職員への感染を防ぐために適切に処理されます。すべての機器と表面は人間の材料を含む各手順に従って 10% 漂白剤と 75% エタノールで洗浄します。ひと由来資料の流出はすぐにクリーンアップする必要があります。ガラス製品は使用後オートクレーブです。固定されていない人間の組織を含む廃棄物はラベル バイオハザード廃棄袋に収集され、オートクレーブです。シャープは、ラベルとしてバイオハザード穿刺と漏れ防止コンテナーにまとめられます。人間の材料からすべての廃棄物は、機関の生物学的安全規則に従って破棄されます。
注: 当研究室の高齢化・ サンダース ブラウン センターを通じて故人個人から新鮮な前頭葉サンプルを取得 (IRB #B15-2602-M)。包含の規準がある: 英国 ADC 縦剖検例のコホート研究と Post Mortem 間隔 (PMI) ≤4 登録 h64。解剖標準プロトコルに従う、すべてのプロシージャが NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン65に準拠します。4 h 未満の短い PMI 分離後キャピラリーの生存を保証するために最も重要です。新鮮および凍結組織を使用ことができます。新たに得られた人間の脳組織ショック液体窒素で凍結する必要があります、-80 ° C で保存凍結が必要な場合新鮮なまたは解凍組織を分離バッファー (下記参照) に格納され、迅速に処理する必要があります。我々 は、新鮮な人間の組織利回り脳毛細血管 (湿重量) の約 100 mg の 10 g を見つけます。
1. セットアップ
<ol><li>
緩衝液調製 注: 必要なバッファーの量は、組織の量に依存します。次のプロトコルのすべてのバッファーのボリュームは、人間の脳皮質組織の 10 グラムに基づいています。<ol>
<li>L 分離バッファー: 使用ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS; 2.7 mM KCl、1.47 mM KH2PO4、136.9 mM NaCl、Na2HPO48.1 mM、0.9 mM の CaCl2、0.49 mM MgCl2) の 1.5 L 5 mM D-グルコース (1.35 g で補うと) と 1 mM ピルビン酸ナトリウム (0.165 g)。追加するとグルコース、ピルビン酸、水酸化ナトリウムで pH 7.4 に調整します。クールは、使用する前に 4 ° C にバッファーを格納します。</li>
		<li>ウシ血清アルブミン (BSA): は、BSA の最終濃度 1% の分離バッファーの 1 L に BSA 粉末 10 g を追加します。泡を避けるため、pH 7.4 に調整、一晩 4 ° C で保存するゆっくりとかき混ぜます。すぐに使用前に軽くかき混ぜます。アルブミンの変性を避けるために気泡を形成しないでください。</li>
		<li>密度勾配媒体: ガラス瓶の中に密度勾配媒体の 18 グラムの重量を量るし、電磁攪拌棒を追加。60 mL の分離バッファーを追加し、すべての粉末が中断されるまでに 5 分は積極的に振る。溶解する密度勾配媒体を許可する 4 ° C で一晩ストア。使用前に 10 分間かき混ぜます。</li>
		<li>4 ° C ですべてのバッファーを保存します。全体の分離のプロシージャの間にすべてのツールおよび氷の上のバッファーを維持します。使用する前にすべてのバッファーをかき混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
実験のセットアップ
	<ol>
<li>電子オーバーヘッド攪拌にポッター エルベジェム組織グラインダーの杵をマウントします。フードの下で氷の上杵・ ポッター エルベジェム組織グラインダー、Dounce ホモジナイザーを配置します。300 μ m フィルター メッシュ (5 × 5 cm2) を準備、円錐形に折ると挿入し、50 mL ファルコン管テープ (図 1 a) に添付します。</li>
		<li>接続リングを置き、セルの歪みフィルター (細孔サイズ: 30 μ m) 50 mL の隼の管に。バイオハザード廃棄物バッグを準備します。キャビネット、バイオ セーフティに必要なすべての機器を配置 (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 脳サンプル準備
注:図 1 aは、以下の全体の分離手順のワークフロー グラフを示します。人間の脳組織は皮質の任意の部分に由来することが、新鮮なまたは冷凍に使用することができます。冷凍脳組織は、(バッファーがありません; 10 g ~ 30 分) 室温で解凍できます。同等の結果を達成するために脳組織は各実験のため同じ脳の領域から取得必要があります。新鮮なこのプロトコルを最適化 (PMI < 4 h) 凍結されていない人間の大脳皮質。
<ol><li>人間の脳組織の準備: 脳組織の重量を文書化します。次のプロトコルのすべての数値は 10 g の新鮮な人間の脳組織に適しています。100 mm のペトリ皿に脳組織を配置します。すべての髄膜をピンセットで慎重に取り外します。白質を切断するには、メスを使用します。</li>
	<li>人間の脳組織のミンチ: 慎重に脳組織をカットし、メスでミンチします。約 5 分 (2-3 mm 個) をみじん切り。・ ポッター エルベジェム組織グラインダーに脳組織を転送します。30 mL の分離バッファーを追加します。 注: みじん切りの組織部分、肉挽きのプロセスをドロドロに脳組織を回すので参照してくださいすることは困難。</li>
</ol>3. 均質化
<ol><li>・ ポッター エルベジェム組織グラインダー (クリアランス: 150-230 μ m): ホモジナイザー速度 50 rpm で 100 ストロークで各サンプルをホモジナイズしてください。すべての 25 のストロークと 100 ストロークに必要な合計時間は、時間を記録します。提案された均質化プロトコル; の表 1を参照してください。ヒトの前頭皮質の 10 g を均質化の合計時間は、約 22 分です。気泡を防ぐために空気で攪拌しないでください。</li>
	<li>Dounce ホモジナイザー (クリアランス: 80-130 μ m): 氷上 Dounce ホモジナイザーにホモジュネートを転送します。20 ストローク (~ 6 秒/ストローク、〜 2 分の合計) で懸濁液をホモジナイズしてください。泡を避けるため。</li>
</ol>4. 遠心分離
<ol><li>4 つの 50 mL の遠心管とドキュメント磨砕液の総量に脳乳剤を均一に分散します。遠心分離管 (チューブあたり 12.5 mL) に 50 mL の密度勾配バッファーを配布します。10 mL の分離バッファーを使用して、杵、ホモジナイザー、リンスし、4 つの遠心分離管 (~2.5 mL チューブあたり) に配布します。</li>
	<li>キャップと遠沈管をしっかりと閉じます。チューブを活発に揺することによって乳剤、密度勾配媒体、およびバッファーをミックスします。4 ° c (固定角ロータ); 15 分 5,800 × gで遠心分離します。チューブに接続されているペレットを維持する中減速速度を選択します。上澄みを廃棄し、1 %bsa の 2 mL にペレットを再懸濁します。</li>
</ol>5. ろ過
注: 赤い血液細胞と他の細胞の残骸から毛細血管を分離、ろ過のいくつかの手順が必要です。
<ol><li>300 μ m メッシュ: ペレットを再懸濁後、300 μ m メッシュを介して懸濁液をフィルタ リングします。毛細血管がメッシュでろ過する大きな船や大きな脳の破片は、メッシュに対し。最大 50 ml の 1 %bsa のメッシュを慎重に洗います。メッシュを破棄します。 注: このろ過ステップは、大きな血管や脳の破片の塊から毛細血管の懸濁液をクリアします。</li>
	<li>
30 μ M の細胞の歪みフィルター 注: このろ過ステップは、赤色の血液細胞や他の脳の破片から毛細血管を分離します。<ol>
<li>6.1 またぎ 5 30 μ m セル歪みフィルター (キャピラリー濾液セル歪みフィルターあたり約 10 mL) から毛細血管の濾液を配布します。このフィルターでは、フィルターを通過し、濾液に集められ赤い血液細胞、他の単一セル、および小さな脳の破片に対しに戻って毛細血管を開催します。</li>
		<li>25 ml の 1 %bsa の各フィルターを洗浄します。その後、全ろ液を収穫を増加する 6 番目のフィルターに注ぐ。1 %bsa; の 50 mL の各フィルターを洗浄します。維持の細胞毛細血管を含むひずみフィルター、濾液を廃棄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 毛細血管コレクション
<ol><li>フィルターを裏返し、50 mL の管に 50 ml の各フィルターに対して 1 %bsa の毛細血管を洗います。慎重に 5 mL pipettor のピペット先端部で圧をかけ、脳の毛細血管を洗浄するフィルターに移動します。</li>
	<li>特にフィルターの縁から、すべての脳毛細血管を洗浄することを確認します。このろ過プロセスが難しくキャピラリーの損失の可能性が高くなりますので、泡を避けるため。</li>
</ol>7. 洗濯
<ol><li>毛細血管を収集した後、1,500 × g (スイング バケツの回転子) 4 ° C で 3 分間ですべてのサンプルを遠心します。上澄みを除去し、再分離バッファーの約 3 mL にペレットを中断します。15 mL コニカル チューブに 1 つのサンプルからすべての再懸濁のペレットを組み合わせて、分離バッファーでそれを埋めます。再び 4 ° C で 3 分間 1,500 × gで遠心分離し、さらに 2 回を洗ってください。</li>
	<li>顕微鏡 (100 倍) とカメラ (図 1 b) キャピラリーの純度を文書化します。 注: 人間の脳組織の 10 g から脳の毛細血管収量は通常約 100 mg です。分離脳の毛細血管は処理の実験のため今すぐ使用ことができます (e.g。、ライセート、膜分離)、またはフラッシュ凍結し、(複数の凍結融解サイクルを避けるため) 6-12 ヶ月の最小のため cryotubes には-80 ° C で保存されます。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

この議定書では、新鮮な組織からそのままで、実行可能な人間の脳毛細血管の分離について説明します。次の詳細に議論我々 このセクションで: 1) プロトコル、2) の一般的なエラーのトラブルシューティング、手法の限界 3)、4) に関して、既存モデルと代替血液脳関門モデルの意義への変更と 5)。分離脳毛細血管の潜在的なアプリケーション。
ここで説明されているプ?...

血液脳関門は、血液と何が入るし、脳から出てくるを決定する脳の間厳重に管理されたインターフェイスです。解剖学的, 血管内皮細胞は血液脳関門を作成し、複雑で、連続的な毛細血管網を形成します。生理、この毛細血管網は同時に炭酸ガスや代謝の廃棄物を処分しながら脳に酸素と栄養素を供給します。重要なは、証拠は、バリアへの変更が多数の病理学、アルツハイマー病、てんかん、脳卒中1,2,3,4,5などに貢献することをサポートしています,6,7. 脳血管内皮細胞はまた、例えば脳に薬剤の吸収をブロックすることによって治療にバリアとして役立つ、膠腫瘍切除術8,9,を次の化学療法。10. 分離脳毛細血管がバリア特性生体内でバリア機能と健康障害の研究では、これとよく似たユニークな体外血液脳関門モデルを表現するこの点では、疾患。この記事では、一貫して高品質の毛細血管で人間の脳から脳の毛細血管を分離し、血液脳関門の研究をもたらすのためのプロトコルを提供します。
1969 年に Siakotosら。11は、脳の毛細血管密度勾配遠心分離とガラス ビーズ列分離を用いたウシと人間の脳組織からの分離を報告する最初でした。その後、ゴールドスタインら12は、脳毛細血管グルコース輸送の代謝活性を維持しながら、ラットから分離された研究に必要な組織の量を削減する複数の濾過手順を追加することによってこの方法を改善しました。その後、研究者は何度もキャピラリー分離手順を最適化し、各イテレーション13,14,15法と脳毛細血管モデルを改善します。たとえば、Pardridgeら。16機械の均質化ではなく、酵素消化を使用して牛の毛細血管を分離し、210 μ m のメッシュ フィルターとガラス ビーズの列を介して毛細血管の懸濁液をその後渡されます。これらの変更は、分離脳毛細血管のトリパン ブルー色素排除汚れを改善し、したがって、内皮細胞生存率を増加します。1990 年代初頭にダレールら。17は、γ - グルタミルトランスフェラーゼ (γ-GTase) およびアルカリホスファターゼの代謝活性を維持され神経汚染の明確なウシおよびラットの毛細血管を分離しました。2000 年、ミラーら。18毛細血管の内腔に輸送基質の蓄積を共焦点顕微鏡との組み合わせでラットとブタ脳毛細血管を使用しました。その後、当研究室は、脳毛細血管分離手順を最適化するために続けているし、P-糖タンパク質 (P gp)19,20,21, 乳癌を決定する輸送アッセイを設けて抵抗蛋白質 (BCRP)22,23日、多剤耐性蛋白質 2 (Mrp2)24交通活動。2004 年、我々 は様々 なシグナル伝達経路を調査するラット脳毛細血管を用いて 2 つのレポートを公開しました。ハルツら。21、そのペプチドのエンドセリン 1 急速かつ可逆的減少 P gp トランスポート機能 (PKC) エンドセリン受容体 B (エB) 受容体、一酸化窒素合成酵素 (NOS) および蛋白質キナーゼ C を介して作用することにより脳の毛細血管でわかりました。バウアーらで19、我々 は核内受容体有する X レセプター (PXR) の発現と脳の毛細血管で P gp 式とトランスポート機能の示した PXR 変調を実証しました。遺伝子組換えヒト PXR マウスでの実験、研究のこのラインを拡大し、体内バリアにより骨折 P gp hPXR 活性化25まで引き締めを示した。2010 年にハルツら。26 P gp タンパク質発現を復元し、トランスポート ノザン ハップ トランスジェニック人間アミロイド前駆体タンパク質 (ハップ) マウスの動作このアプローチを使用します。また、ハップの P gp を復元するマウス大幅削減アミロイド β (a β)40と a β42の脳レベル。
シグナル伝達経路を検討するほか、分離脳の毛細血管は毛細血管漏出として参照する毛細血管の透過性の変更を確認する使用できます。特に、テキサス赤の漏出試金は、時間とこれらのデータで毛細血管の内腔からテキサス赤は漏洩率を分析に使用し、蛍光色素の漏出を評価するために使用されます。コントロールの毛細血管からのそれらと比較して増加した毛細血管漏出率は、血液-脳関門2の物理的な整合性の変化を示します。バリア、例えばに関連付けられている多くの病気の状態があるので、これは貴重な、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳傷害27,28,29、。 30です。他のグループはまた蛋白質の表現、蛋白質31,32,33,34,の輸送活性を調節するシグナル伝達経路を識別する孤立した毛細血管を利用します。 35,36,37。最後に、人間の脳の毛細血管を分離するためこのメソッドを最適化してまいりましたし、最近、我々 はてんかん発作のない制御個人38 に比べて患者におけるひと血液脳関門で P gp 発現の増加を示した.一緒に取られて、これらの開発は、分離脳の毛細血管がバリア機能を勉強する汎用的なモデルとして使用できることを示します。
様々 な体外体内、および体外血液脳関門モデルの基礎研究および産業創薬スクリーニング、脳39,報40,41 への薬物送達をテストの目的で主に使用されています。 ,42,43,44。脳毛細血管分離前のヴィヴォに加えてには現在血液脳関門モデル、インシリコモデル、分離脳毛細血管内皮細胞の様々 な由来不死化細胞株の in vitro細胞培養種の培養脳内毛細血管内皮細胞とマイクロ流体チップのモデルに区別するひと多能性幹細胞 (hPSC) の文化。
インシリコモデルは、予測吸収、分布、代謝、排泄 (ADME) プロパティに基づく新薬候補を選択するため医薬品開発で最も一般的に使用されます。定量的構造物性相関 (QSPR) モデルなど量的な構造活動関係 (QSAR) モデル メソッドは、脳浸透薬剤の候補者を予測するライブラリの高スループット スクリーニングで使用される人気のあるメソッド45,46. これらのモデルは、バリア貫通性の分子を画面に便利。
ベッツら47は、体外血液脳関門モデル システムとしての培養脳内毛細血管内皮細胞の単分子膜を設立しました。人間の脳微小血管内皮細胞 (hCMECs) など新鮮な組織や不死化血管内皮細胞を用いて細胞文化モデルの in vitro脳浸透または機構研究のための別の高スループット スクリーニング ツールをすることができます。ただし、脳毛細血管内皮細胞培養モデル毛細血管の内腔内の血流の生理学的な剪断応力がない、全体的な生物学的複雑さに限られている、重要なバリア成分の発現や局在の変化を受けタイト結合タンパク質など表面の受容器、トランスポーター、酵素、イオン チャンネルは48,49,50。逆に、内皮細胞膜に由来する hPSCs hCMEC/D3 の文化と比較して低糖透磁率がある、いくつかの血液脳関門輸送、接着分子、タイトな接合51,の偏光式が含まれて52です。 しかし、これらの細胞も文化でのプロパティの変更は、体内バリアのプロパティ52・のシステムを検証する必要があります。
血液脳関門の研究の新しい動向、マイクロ流体デバイスを生成する臓器・ オン ・ チップ技術を使用してまたは中空繊維技術53,を利用した人工の毛細血管を作成する 3 D 培養システムを利用54,55。 人工の毛細血管、脳毛細血管 (3-7 μ m) よりも大幅に大きい直径 (100-200 μ m) があります。したがって、せん断力、体外で完全に似ていない体内状況。これは、"blood-brain-barrier-on-a-chip"マイクロ流体デバイス、マイクロ流体せん断力を生成するこれらのデバイスを人工膜フォームの「血」と「脳」のコンパートメントと流体を励起しているに扱われます。同様に、アストロ サイトのさまざまな組み合わせで血管内皮細胞や血管平滑筋細胞の共培養もで使用されている中空繊維技術体内条件56下の粘弾性パラメーターを再作成するには,57,58です。 ただし、わかりにくい方法もこのモデルは血液脳関門輸送、代謝、シグナル伝達、などなどの他のプロパティを反映します。これらの人工毛細血管とチップのモデルは薬の高スループット スクリーニングに適したが、文化の中に、これらのモデルを生成するために使用するセルが予告なく変更も。
冷凍と固定脳スライスまたは原発性脳毛細血管内皮細胞の文化は人間の血管を研究5,59,60,61に使用することができます追加のモデル。たとえば、固定脳組織の免疫組織化学を使用して蛋白質のローカリゼーションを決定、健康式は病気にかかったティッシュと比較します。
組織スライスとの in vitroモデルに加えて上記、新鮮な分離脳の毛細血管は血液脳関門の機能を研究する利用できます。この孤立した毛細血管モデルの制限新鮮な人間の脳組織を取得する難しさを含んで比較的時間のかかる分離プロセスと神経細胞、アストロ サイトの不在。分離脳毛細血管モデルの利点は、このモデル体内状況を密接に似ているし、したがって、バリア機能不全の評価に使用できます。重要なは、試金および分子生物学手法3,19,,6263の多数を使用してシグナルを見分けることも使用することができます。
加齢に関するサンダース ブラウン センターを介して両方の生鮮、冷凍人間の脳組織へのアクセス研究室 (IRB #B15-2602-M)64。このコンテキストで解剖標準プロトコルに従う、脳には求め < 4 h、およびすべての手順は NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン65に適合。人間の脳組織へのこのユニークなアクセスを与えを設置し、そのまま、実行可能な人間の脳の毛細血管の高収率の結果人間の脳から脳の毛細血管を分離するためのプロトコルを最適化します。関心の 2 つの一般的なエンドポイントは、タンパク質の発現と活性を決定します。この点で、我々 と他の蛋白質の表現および活動レベルを勉強する分離脳の毛細血管で使える様々 なアッセイを設けてください。これらのアッセイは、西部にしみが付くこと、シンプルなウエスタン アッセイ、酵素免疫測定法 (ELISA)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)、ザイモグラフィー、輸送活動のアッセイと毛細血管漏出試金。これらの試できる研究者が人間の病理学的条件でバリア機能の変化を研究、蛋白質の表現や活動を支配する経路を決定する、関連付けられている血液脳関門の治療のための薬理学的ターゲットを特定するには病気。
一緒に、新鮮な分離脳の毛細血管は血液-脳関門の堅牢かつ再現可能なモデルとして利用できます。特に、このモデルは、さまざまなバリア機能を勉強するエンドポイントを決定する多くの異なるアッセイと組み合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Personal Protective Equipment (PPE)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Disposable Protective Labcoats</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td></tr><tr><td>Face Shield, disposable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>19460102</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td></tr><tr><td>Safety Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Paper 18&quot; x 20&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>to cover working areas</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>for used scalpels</td></tr><tr><td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.</td><td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C Refrigerator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscope</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td><td></td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td><td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>used to freeze the tissue?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analytical Balance</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td><td></td><td>used to check isolated capillaries</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools and Glassware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>resuspend pellet in BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>to mince brain tissue</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>to cover beaker and volumetric flask</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>to wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>60 mL syringe with Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>used with connector ring to filter capillaries</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>used for mincing</td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>50 mL volume, clearance: 150-230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL volume, clearance: 80-130 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td></tr><tr><td>pluriStrainers (pore size: 30 &amp;micro;m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Connector Ring</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>41-50000-03</td><td>reuse multiple time</td></tr><tr><td>1 L Volumetric Flask</td><td></td><td></td><td>for preparation of Isolation Buffer</td></tr><tr><td>1 L Beaker</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA</td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Schott Bottle (60 mL)</td><td></td><td></td><td>for preparation of Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td>to keep everything cold</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td></td><td></td><td>for mincing of brain tissue</td></tr><tr><td>Tissue Culture Cell Scraper</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89260-222</td><td>to remove supernatant after centrifugation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraction V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647-500g</td><td>prepare in DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td></tr><tr><td>DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>to adjust pH of the DPBS</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Concentration: 1 mM</td></tr></tbody></table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

脳保護を改善し、脳を扱う脳ドラッグデリバリーを強化する約束を保持する新しい治療上の作戦の開発の重要な生理学的および病態生理学的条件下で血液脳関門の機能を理解、障害。ただし、ひと血液脳関門の機能を勉強するは困難です。したがって、適切なモデルの重要な必要性があります。この点で、人間の脳組織から分離した脳の毛細血管は、できるだけ人間体内の状況に近いとバリア機能を勉強するユニークなツールを表します。ここでは、高収率に一貫した品質と純度で人間の脳組織から毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルについて述べる。毛細血管は、機械の均質化、密度勾配の遠心分離、ろ過を使用して新鮮な人間の脳組織から分離されます。分離後、脳毛細血管のタンパク質発現と機能、酵素活性や細胞内シグナル伝達の研究に漏れの試金、ライブセル イメージング免疫アッセイなど様々 な用途に使用できます。分離脳の毛細血管は、ひと血液脳関門の機能調節を解明するユニークなモデルです。このモデルは、中枢神経系疾患を治療するための治療戦略の開発を助ける中枢神経系 (CNS) の病因に洞察力を提供できます。

人間の脳組織から分離は、大きな船、赤の血液細胞、他の単一セル、いくつかの細胞の残骸の量が少ない人間の脳毛細血管 (図 1 b) の濃縮懸濁液をもたらします。いくつかの毛細血管を分岐すると、そして、いくつかは、赤血球が毛細血管の内腔に捕捉されました。典型的な毛管 3-7 μ m の直径を持つ、約 100-200 μ m; オープン ルーメンと長いほと...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

人間の脳組織から分離脳の毛細血管は、生理学的および病態生理学的条件下でバリア機能を研究する臨床モデルとして使用できます。ここでは、新鮮な人間の脳から脳の毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルを提案する.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K ビュー.  University of Kentucky. 人間の脳組織から分離脳の毛細血管は、生理学的および病態生理学的条件下でバリア機能を研究する臨床モデルとして使用できます。ここでは、新鮮な人間の脳から脳の毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルを提案する.

ビデオ: Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

マウス脳血管の精製

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

神経科学

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

単離および脳実質細動脈のカニューレ挿入

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

細胞体カルシウム測定とカルシウムイメージング研究のための脳毛細血管培養

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

生物学

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue

Source: Hartz, A. M. S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57346" target="_blank">Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of cerebral capillaries from a fresh human brain tissue. The isolated capillaries can then be used to generate an ex vivo blood brain barrier model.

ヒト脳からの脳毛細血管の単離:ヒト脳組織から脳毛細血管を抽出するための最適化法

Source: Hartz, A. M. S. et al. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

がん研究

神経系のがん

体外研究

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

初代脳周皮細胞の単離と培養:内皮細胞汚染なしにウシ脳毛細血管から周皮細胞を単離および培養する手順

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...

試験管研究

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

Source: Nielsen, S. S. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56277">Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

ブタの脳からの毛細血管の浄化

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Purification of Porcine Brain ...

神経細胞培養技術

高度な神経細胞モデル

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

ラット脳からの神経血管ユニットの分離法

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...