著者は、ここで利用実験的組織を収集するための機会を提供するためのライアン·チャップリン、ケンタッキー肉ラボと動物と食品科学科の大学の博士グレッグRentfrowを認める。

全く生きた動物を使用しなかったため、この研究で使用した手順は、ケンタッキー州動物実験委員会の大学からの承認を必要としませんでした。本明細書中で使用される任意の試料の採取前に、すべての動物は、キャプティブボルトを唖然と放血させた。これは、ケンタッキー大学の連邦政府の検査食肉処理施設で行った。米国農務省食品安全検査局の公式代表がカーカスの生きた動物や取り扱いに対処するすべての活動を観察した。 計装の調製<ol><li>実験の開始に組織サンプルの収集の間の時間、セットアップ機材を最小限にし、（追加の人員が利用可能である場合、または、これらのタスクが同時に発生する可能性があります）は、実験の組織を収集する前にバッファを準備するには。 注：これは組織が実験を行うために生存し続ける時間の最大量を提供していますが、一部だけでなく、したがって、それが早くも実現可能なように使い始めることが通常望ましいが、実験が長時間にわたって実行することができます（または、一日に複数の実験を完了することが望まれている）。 </li><li>パワーアップに関連するコンピュータ、データ取得装置、水浴（バッファ（複数可）用）およびミオグラフユニット（複数可）。ミオグラフユニット（複数可）上で校正装置を配置し、温度をプリセットに温めユニットと校正装置を（37.5℃にプリセット）ミオグラフ熱をオンにして可能にします。 <ol><li>コンピュータ上で以前に作成したグラフのソフトウェアの設定ファイルを開き、実行を開始する（ただし、データを取得していない）。 </li></ol></li><li> 10分のための機器をウォームアップ。 <ol><li>データの取得を開始します。 </li><li>ゼロすべてのチャンネル。 </li><li>確認し、認定された重量によって供給された2-G力に、そのチャンネルに関連するそれぞれの力変換器から供給される電気信号を標準化するために、各チャネル（multimyographあたり4チャネル）上で（必要な場合）、キャリブレーションを実施しています。 </li><li>キャリブレーションと単位変換後のグラムとして、後続のすべてのデータを格納する、完成されている。各個別の研究室の要望に基づいて、それに応じて変更します。機器およびソフトウェアは、ミリニュートンやボルトのような他のユニットの使用を可能にする。 </li></ol></li><li>ガスラインは、閉塞の明確であることを確認し、（複数の）単位をミオグラフへのガス供給（95％O 2/5％CO 2）をオンにします。継続的に全体の手順の間（ミオグラフチャンバー内の）すべてのバッファをガス。 </li><li> 70％エタノールですべてミオグラフチャンバーを記入し、10分間浸し、エタノールを除去し、ソーク第10分間繰り返します。 <ol><li>エタノールを除去した後、チャンバ内のバッファの第三の加算を残して、準備されたバッファ（バッファを調製するための第2節を参照）で3回リンスに続いて脱イオン水で3回リンス。 注：バッファおよび組織が準備されるまで、この時点で機器がこの状態のアイドル状態を維持することができ、スタッフはexperimenを続行する準備ができているトン。 </li></ol></li></ol>バッファの調製<ol><li> 11.1 mMのD-グルコースの最終濃度を達成するために、組織サンプルの輸送および処理に使用するための1 Lクレブス - ヘンゼライト緩衝液を準備し; 1.2 mMの4を硫酸マグネシウム; 1.2mMのKH 2 PO 4; 4.7のKCl; 118.1のNaCl; 3.4のCaCl 2; 24.9のNaHCO 3。 <ol><li>撹拌プレート上に約900ミリリットルの脱イオン水にクレブス塩9.6グラムを混ぜる。 </li><li>必要なバッファー1L当たり2.1グラムの重炭酸ナトリウムに続いて0.373グラムの塩化カルシウム水和物で混ぜる。 </li><li> 95％O 2/5％CO 2で20分間ガス緩衝液。 </li><li> L.及び1に音量を調節;ガス処理後、7.05のpHを調整（最終目標pHは7.4であるべきバッファの濾過は、pHを増加させる） </li><li>フィルターは使用するまで4℃でクリーンなオートクレーブ処理1 L培地ボトルとストアバッファにバッファを滅菌する。 </li></ol></li><li>独立したクレブス-Hを準備ミオグラフ実験で使用するためのenseleit緩衝溶液収縮実験に関連する追加の化合物との交通クレブス - ヘンゼライトバッファにステップ2.1で説明したように。 注：一般的に、2Lは、この資料に記載された実験のために十分であろうが、このボリュームは、実験の長さに基づいて増減する必要があるかもしれない、ミオグラフ室の数、および（治療の追加に関して）番号バッファの交換。 <ol><li>ガス発生段階（ステップ2.1.3）の前に、バッファリングするデシプラミン塩酸の9.1 mgの（バッファ1L当たり準備中）を追加します。 </li><li>プロプラノロール塩酸1.0μMの溶液を調製し、クレブス - ヘンゼライト緩衝溶液にこの溶液（バッファー1L当たり準備中）1ミリリットルを追加します。利用当日にこのバッファを作成し、ミオグラフ動作温度（ミオグラフに37.5℃の温度が得温度）で維持する。 NOTE：デシプラミンは、生体アミンの再取り込み機構を阻害するために添加されそしてより急速に起こることが、血管の入浴バッファからの実験の追加のクリアを可能にする。プロプラノロールの追加は、βアドレナリン受容体をすることが、治療化合物の非特異的結合を防ぐことができます。 </li></ol></li></ol>血管系の3。収集と準備<ol><li>できるだけ早く、死体からの消化管を取り外します。動物はもはや不随意反射を呈すると、頭を削除せず、非表示にしてから縦にカーカスを上げる。死体からの胃腸内臓（肛門まで食道）の除去は、（素晴らしい時から&lt;20分）承認された食肉処理場の担当者が完了する必要があります。 注：どのくらいで、一般的に腸管から採取し、標準作業手順や施設の担当者に続いて連邦政府が義務付け手続きされている場所/施設によって制限されます。 <ol><li>ほとんどの施設では、消化管の操作を行って食料供給を入力するように運命づけられているカーカスの処理とは別の場所にある。消化管を採取し、検査のために展開することができ、近くの便利な場所に使用します。 </li></ol></li><li>消化管が広げられると、小腸、盲腸に小腸を接続回盲倍、回盲倍（ 図1A）の近位に延びる回腸フランジを識別する。 <ol><li>メスまたはナイフを使用して、非常に軽く回腸フランジの中心部にある腸間膜膜に切開する。 2つのインデックスの指を使って、ぶっきらぼうに腸間膜血管系（ 図1B）を露光脂肪および結合組織を離れて解剖。 </li></ol></li><li>腸間膜内のこのフランジまたは膨らみから、回腸（ 図1C）のこの部分をサポートして露出した腸間膜動脈と静脈の束の複数のブランチ（長さ約2センチ）を解剖する。 <ol><li> uの場合は組織を把持する鉗子を歌う、直接把握したり損傷し、否定的に組織のパフォーマンス14に影響を与え得るストレッチの任意の並べ替えとして、それらを除去しながら、全くの血管を引っ張らないように注意してください。血管除去が最良除去すべき部分のそれぞれの端を横断してから、今孤立セクションに沿って配置したり、平行に切断することによって、行われます。簡単にするために、ピンセットで把握するいくつかの組織を提供するために、船と一緒に周囲の組織の一部を削除。 </li><li>ピンセットで、氷冷クレブス - ヘンゼライト緩衝液を含むチューブ内に組織サンプルを沈め、処理が、実験室で発生する可能性まで氷上で保存する。 </li></ol></li><li>切断面やペトリ皿に組織サンプルを配置し、部分的に氷冷クレブス - ヘンゼライトに水没。 <ol><li>スコープ＃5宝石商鉗子、ノイスアイリスはさみを使用して、ランプを拡大または解剖、慎重に周囲の脂肪とconnectiを離れて解剖（5.0X倍率に2.5で十分です）組織をVEの動脈と静脈を分離する。部分の一端で容器開口部を特定し、慎重に鉗子で血管の周囲の筋膜を把握する。 </li><li>ハサミでカットが提起筋膜の下にはさみの先端をスライドさせて、容器に平行にしてください。最初の切開の後、脂肪および結合組織をさらにハサミでいずれかの側を下に切断することによって容器から取り外すことができる。血管がベンチに費やす時間の量を最小限に抑えながら、船は、可能な限りクリーンであることを確認します。 </li><li> （サンプルは採取後、最大24時間保存され、まだ有効な収縮データを作成されたまますることができます）、4℃で新鮮なクレブス - ヘンゼライトバッファとストアのチューブに血管を返します。 </li><li>カミソリの刃を使用して、スライス容器は2mmの断片の所望の数にミオグラフに使用する（これは、一貫した断面を得るために、組織スライサーを使用すると便利である）。 </li><li>解剖SCOの下で、各セクションを調べますPE（12.5X倍率）は、各セクションが誤って解剖し、洗浄中に行わない異常、枝、バルブ、あるいは表面的な損傷がないことを確認します。異常、支店、バルブ、あるいは表面的な損傷がある場合には、血管部分を交換してください。 </li></ol></li><li> （クレブス - ヘンゼライト緩衝液中に沈め）お店許容可能なスライス血管セクション氷の上または4℃でミオグラフ室（通常は&lt;30分）に取り付ける直前まで、。 </li><li>静かに2〜3グラムの読みの上血管を伸ばさないように注意しながら（ミオグラフにマイクロポジショナーを使用して）管腔を通って支柱を挿入することによりミオグラフに容器をマウントし、緊張を高める。 </li><li>すべてのチャンバが覆われると、全てのチャンバからバッファ真空とバッファの5.0ミリリットルを補充し、平衡期間、実験を開始するために、15分のタイマーを開始する。 </li></ol> 4。実験<ol><li>安定した解像度を達成するために1.5時間、すべての血管のセクションを平衡化1.0グラムのティン張力。 <ol><li>クレブス - ヘンゼライトインキュベーション緩衝液を15分毎に交換してください。 </li><li>平衡時には、常に2グラムまでの血管セクションの張力を調整した後、約0.80グラムまで緩和することを可能にする。血管が（彼らはマウントを滑り落ちる場合があります）あまりリラックスすることができないようにしてください。容器は、調整を必要とせずに1グラム張力を保持している安定したベースラインの張力を達成してみてください。 </li></ol></li><li>平衡時には、基準となるのKCl水溶液1.32 M溶液を調製。 </li><li>満足な平衡が完了した後、容器の入浴5.5ミリリットル溶液中の0.12モル溶液をもたらすと1.32 MのKCl溶液500μlを加える。 <ol><li>この添加から最大応答は、組織の生存率を評価するために使用され、治療データを正規化するために使用することができるように1.32 M KClを添加した後、a側に（手動で例えば、濃度応答の張力を調節しないgonist）。 </li><li>張力が1.0グラムのベースライン値に戻るまで15分間隔でバッファを交換してください。 </li></ol></li><li>ベースラインに到達すると、バッファを変更すると同時に、1分タイマーを開始する。開始時間の驚異を回避するために、同時に全てのチャンバのためにこれを行います。 <ol><li>追加される標準をボルテックスし、1分間のカウントダウン中にチャンバ1のコメントを準備します。 </li><li> （これは全体積の0.5％以下の治療を続ける）実験おもむくまま、各チャンバーに25μlのアリコートに基準を追加します。 </li><li>最後の規格が追加されている場合には、9分タイマーを開始します。 </li><li> 9分、標準インキュベーションの最後に、チャンバーから治療を含む緩衝液を除去し、新鮮な緩衝液5.0mlのを追加し、2.5分タイマーを開始します。 </li><li>繰り返し手順4.4.4。 </li><li>第2.5分すすぎの最後に、チャンバーを真空、新鮮な緩衝液を追加し、seconの開始をカウントダウンするために1分間のタイマーを開始dの標準添加。 </li></ol></li><li>一日の標準添加のすべてについて、このサイクルを繰り返します。 </li><li>最終基準の添加およびその後の9分間のインキュベーションの間に500μlに実行参照用量添加の終わりのための1.32 MのKCl参照化合物を準備します。 </li><li>最終処理を添加した後1分間隔の後に、塩化カリウムを追加し、9分タイマーを開始します。 注：塩化カリウムの添加は、実験の終了時に組織生存を確認することであり、無視できる応答をもたらす治療を施す場合に便利です。 </li><li>最後の9分間の参照化合物のインキュベーションの終了時に、真空またはチャンバーのすべてのバッファを削除します。新鮮なバッファーを追加しないでください。実験を締結。 </li><li>チャートファイルを保存し、血管のセクションを削除し、適切に処分する、とミオグラフ機器にクリーンアッププロトコル（製造業者によって提供され、実験室に特異的であり得る）に従う。 </li></ol>

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商品名、独自の製品、または指定された機器に関する記述は、米国農務省が保証または保証するものではありませんし、利用可能である他の製品を除外して承認を意味するものではありません。

このバイオアッセイの開発における最初の課題は、腸間膜血管系のための反復可能な収集場所の設立だった。回腸を通じて空腸からの進行の間の小腸の変化と、その結果腸間膜の機能のいくつかは同じようなパターンで変化するように、サンプルサイトの一貫性は、非常に重要です。腸間膜動脈と静脈の回腸枝は最も容易に解剖学的なランドマークを介して同定された。盲腸の位置を特定し?...

組織床への血流の変化は、臓器の機能に大きな影響を持つことができる。小腸の主な機能は、栄養吸収である。腸の吸収面への動脈血流が面1に沿って移動する消化物として栄養吸収を助けるために、栄養吸収、血液の流れが増加するために必要とされる。血流の減少は、経上皮勾配2の減少に栄養吸収の低下を引き起こす可能性がある。栄養素に加えて、小腸はまた、腸間膜における局所血流量に対して効果を発揮する二次代謝産物、薬物、または毒素に曝露することができる。反芻動物の場合、化合物は、前腸の発酵過程を経て飼料（例えば、アミノ酸、またはそのような麦角アルカロイドなどの毒素として、例えば 、栄養素）から遊離させることができる。これらの化合物は第一胃発酵の微生物代謝を生き残るならば、彼らは今、吸収のために利用可能であるまたは相互作用それらは動物の胃腸管を通過する。 in vivoでの血流を測定するために利用可能多くの異なる方法がある（ 例えば 、ドップラー超音波、血液流量計、放射性標識ミクロスフェア、およびインジケータ希釈技術留置）は、さまざまな実験的なシナリオまたは治療の評価を可能にする。 Mulvanyおよびアルペルン3は、ワイヤを用いる技術を記載する物品はミオグラフにおける血管リング標本をマウント公開までは、血管平滑筋の機械的または薬理学的特性に関する情報を得るためには、この方法は、大きな血管に制限されなかった。この技術の開発以来、改変は、管状構造を評価するためのさまざまなアプリケーションを可能に関連付けられたミオグラフシステムに対して行われ続ける。システムはまた、ここで灌流大きな血管4を取り付けるための固定されたロッドを利用するように適合されている技術が望まれていません。 容器や動物型とは異なる動物の種、データから同じ血管内の異なる解剖起源との区別から血管内の非類似性のなので簡単に別の容器又は異なる動物タイプ5で同じ容器全体に外挿することはできない。このため、個別のバイオアッセイを開発し、これらの側面を変更した、いつでも検証する必要があります。最近、いくつかのバイオアッセイは、牛の横伏在静脈と右第一胃動脈と静脈6,7で使用するためのこれらの技術で開発されてきた。 このバイオアッセイは、麦角アルカロイドが小腸を支える血管系に与える具体的影響を調査するために開発されました。これは、供給アルカロイドの50〜60％が第四胃の内容に表示されることが報告されたが、わずか5％が糞8で回収される。ストリックランドら 9は 、麦角アルカロイドのレビューで、その利用可能なデータsuggを表明ESTは、小腸はergopeptine吸収のための最も重要な部位であり得ること。エッカートら麦角アルカロイドの10件のバイオ医薬品の態様およびそれらが上皮関門を通過後は、麦角アルカロイドが鎖骨下静脈または腸間膜静脈と門脈血液中にリンパ系のいずれかによって輸送されると述べた。ローズら 11は、高エンドファイト感染（高麦角アルカロイド）の食事を消費する去勢牛十二指腸、大腸への血流の減少を報告した。右第一胃動脈と静脈バイオアッセイを用いて、フットら 12は、麦角アルカロイドは、第一胃血管系内の血管作動性であることを実証した。フットら 13は、続いて、in vivoで実証し減少し、第一胃上皮の血流の麦角アルカロイド結果と第一胃の暴露。第一胃の吸収面への血流の減少は、同時に栄養（揮発性脂肪酸）フラックスの減少を引き起こした。屈原を考える前腸から小腸への継承麦角アルカロイドのantity;それは小腸血管系および栄養吸収に対する同様の効果が発生するという仮説が立てられた。これはウシの近位回腸腸間膜動脈と静脈バイオアッセイの開発を必要とした。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="611">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:259px;">Comment/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Multi Myograph</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">610M</td>
			<td style="width:259px;">A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">Powerlab 8/sp</td>
			<td style="width:127px;">ADIntruments</td>
			<td style="width:120px;">ML785</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">LabChart 7</td>
			<td style="width:127px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:120px;">Version 7</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Force Calibration Kit</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">100055</td>
			<td style="width:259px;">Specific to DMT myographs</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Bottle-top Filter</td>
			<td style="width:127px;">Nalgene</td>
			<td style="width:120px;">595-4520</td>
			<td style="width:259px;">0.22 um pore size; 45 mm neck size</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">#5 Jewler&#8217;s Forceps</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">555008FT</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of forceps can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Noyes Iris Scissors</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">18-1510</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of scissors can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Dissecting Scope</td>
			<td style="width:127px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">Stemi 2000-C</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of dissecting light microscope will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Adjustable Tissue Matrice</td>
			<td style="width:127px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:120px;">TM C12</td>
			<td style="width:259px;">This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Krebs-Hensleit Buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">K3753-10x1L</td>
			<td style="width:259px;">It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Calcium chloride dehydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S5761-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Desipramine-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D3900-5G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Propranolol-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0884-1G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">KCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P9333-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:105px;">95% O2/5% CO2</td>
			<td style="width:127px;">Scott Gross</td>
			<td style="width:120px;">UN3156</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

哺乳類の胃腸システムが常にそのシステムへの及びからの血流に影響を与えることができる化合物（望ましい、望ましくない）にさらされている。小腸への血流の変化は、臓器の吸収機能への影響をもたらすことができる。発酵や消化過程を経て飼料から遊離する毒素に特に興味が生産的な効率を向上させることができる領域として反芻動物で開発しました。この記事に関連したビデオは、ウシ腸間膜動脈の単離断面の中で血管作用およびmultimyographを使用して静脈化合物をスクリーニングするために開発されたインビトロバイオアッセイを説明しています。血管が取り付けられ、ミオグラフで平衡化されると、バイオアッセイ自体を使用することができる。収縮反応または関心のある化合物の血管作用を評価するためのスクリーニングツールとして;薬理学的に特異的アゴニストでの受容体を標的とすることにより、受容体の種類の存在を決定するS;一つ以上のアンタゴニストの存在と受容体の役割を決定する。またはアンタゴニストで目的の化合物の潜在的な相互作用を決定する。このすべてを介して、データをリアルタイムで収集され、単一の動物から採取した組織は、異なる実験処理多数の（in vitroでの利点）に曝露し、かつ正確に提供するために毛細血管床の両側に脈管構造を表すことができ小腸をサポートする求心性と遠心性の血液供給で何が起こって何ができるかの絵。

含まれる結果を生成するために使用される血管は、3週間の間隔内で6ホルスタインの去勢牛（425±8キロ）から収集した。 KClおよび濃度の増加の治療の追加の典型的な腸間膜静脈収縮反応の例は、応答の大きさは、（ドナー動物の大きさと相関する）を容器のサイズに一部変化する。 図2に提示するだけでなく、缶れる回収·洗浄中に血管の（延伸）不適切な取り扱いによって（負?...

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

小腸は、しばしば、血流に影響を与える負栄養吸収に影響を与える可能性が毒素に暴露される。 multimyographおよび腸間膜動脈および静脈の分離株を使用して、目的の化合物または毒素は、血管作用についてスクリーニングすることができる。

バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K ビュー.  USDA-Agricultural Research Service. 小腸は、しばしば、血流に影響を与える負栄養吸収に影響を与える可能性が毒素に暴露される。 multimyographおよび腸間膜動脈および静脈の分離株を使用して、目的の化合物または毒素は、血管作用についてスクリーニングすることができる。 

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

そのような自閉症や統合失調症のような一般的な疾患でのde novo変異を同定するための戦略

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

医学

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

自動ワイヤの筋運動記録法を用いた腸間膜動脈の収縮と弛緩の研究

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

成体マウス静脈性高血圧モデル：外頸静脈吻合部の総頸動脈。

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

配慮ラットモデルにおける血行動態の措置、煎茶や血液サンプリングを実行するために頸動脈と頸静脈のカテーテル

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

マウスにおけるタキサンの薬物動態学的および薬力学的分析のための頸動脈煎茶

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

急速にマウス腸のホールマウントを準備するための簡単​​な装置

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

免震を用いた消化管ホルモン分泌のメカニズム潅流ラット小腸

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...