著者は、専門家の技術サポートのためにAmnisコーポレーション（EMD Millliporeの一部）からシンシナティ小児病院研究財団とリチャードDemarcoの、Sherree友人、そしてスコットモルデカイの研究フローサイトメトリーコアに感謝します。この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていましたK08HL088126とR01HL116352（TAK）とP30のDK090971（YZ）を付与します。

体外赤血球文化の中で 1。長期（ex vivoで赤血球分化培養プロトコルGiarratanaによるら 8、修正およびマウス細胞に適応） これは、in vitro赤血球生成プロトコルで 3段階の長期的である。最初のステップ（0〜4日目）は、2×10 5細胞/ mlを、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン-3（IL-3）、エリスロポエチン（EPO）を補充した赤芽球増殖培地中に置かれる。第二工程（5-6日間）において、細胞は、Epoを用いてのみ補充した新鮮赤芽球の増殖培地中で接着性間質細胞上/ mlで共培養し、2×10 5細胞（MS5）に再懸濁する。第三段階（7-9日間）において、細胞は、最大除核のサイトカイン（ 図1A）なしの新鮮な赤芽球の増殖培地中のMS-5細胞の層上で培養される。 全ての動物プロトコルはの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたシンシナティ小児病院医療センター。 <ol><li>骨および低密度骨髄細胞の単離の収穫<ol><li> 2ミリリットルを15 mlのコニカルチューブ中の2％ウシ胎児血清（FBS）を含有する滅菌IMDMを追加し、氷上に保つ。 </li><li>機関が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入、）は、次の（興味のある遺伝的に標的とするマウスの有無にかかわらず一緒に）2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを安楽死させる。 </li><li> 、鉗子やメスを用いて骨盤骨、大腿骨、および両足の脛骨を分離IMDM +2％FBSを含むチューブに追加し、氷上に保つ。 </li><li> 1ミリリットルピンセットを用いて、滅菌フローサイトメトリーチューブとフラッシュ骨にIMDM +2％FBSおよび25-G×5/8 &quot;針でツベルクリン注射器を追加します。フラッシュIMDM +2％FBS、骨を通して数回静かに（ ）を細胞懸濁液から〜500μLを吸引し、骨を再度フラッシングすることにより、およびフローcytometrに骨髄細胞を採取Yチューブ。骨が白くなったフラッシングは完了です。 </li><li> 50 mlのコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーセットを介して細胞懸濁液をフィルタリングする。 IMDM +2％のFBSと同じ培地を5mlの細胞懸濁液の最終体積を調節用いてセルストレーナーを洗浄する。 </li><li>密度勾配遠心分離により、低密度骨髄細胞（LDBM）を準備し、慎重に25 750×gで15 mlチューブ、スピンでグラム/ mlの培地密度勾配細胞分離5mlの1.083に細胞懸濁液を5ml層ブレーキなし/低加速しながら、室温（RT）で分。 </li><li>新しい15 mlチューブに上清（軟膜を取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてのすべてをバックアップ）を転送して、5分間525×gでIMDM +2％FBSで1以上の洗浄を行うRT。 </li><li>上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中にペレットを再懸濁させることによって、残りの赤血球（RBC）を溶解する。赤芽球の高い純度がある場合最後のステップ（生化学的研究用など ）で必要とされる、磁気分離による林NEG細胞に、このステップでさらにLDBM細胞を浄化する。 </li></ol></li><li> LDBMまたはLIN NEG細胞 （ 図1A）から開始してex vivoで赤血球分化培養プロトコル<ol><li>追加7ミリリットルIMDM +2％のFBS、5分およびRTでなる2mlの赤芽球増殖培地（EGM）中でペレット化した細胞を再懸濁するために525×gでスピン。 A。 STEMPRO-34培地を含む B。 2.6％STEMPRO-34培地補充、 C。 20％BIT-9500、 D。 900 ng / mLの硫酸第一鉄、 E。 90 ng / mLの硝酸鉄、 F。 100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン グラム。 10 -6 Mヒドロコルチゾン H。および新たなサイトカインを追加しました： I）100 ng / mlのSCF、 ii）の5 ng / mlのIL-3、および III）3 IU / mlのエポ。 </li><li>裾を使用して自動化細胞カウンターを用いてまたは手動で顕微鏡で細胞を数えるocytometer。 </li><li> 5×10 5細胞/ウェルにEGM 2.5ミリリットル（2×10 5 LDBM細胞/ ml）の最終体積の濃度で6ウェル細胞培養プレートにおいてプレートし、37°C（インキュベートこれが考慮される文化の日の＃0など）。 </li><li> 、上清の1.5ミリリットルを吸引室温で5分間525×gでスピンし、すべての3サイトカインを含有し、日中2に戻ってウェルに毎日を追加する新鮮な培地1.5mLに再懸濁することによりメディアを変更し、3、4、最適化する増殖期。 3日目に、すべての細胞を除去カウントし、約2×10 5細胞/ mlの細胞ウエル濃度を維持するために適切な数のウェルに分割する。 37℃/ 5％CO 2で培養物を維持する。 </li><li> 4日目に、新たな細胞培養6ウェルプレートのウェルにプレートMS5細胞（マウス間質細胞株）。 MS5細胞培養培地は、20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有するα-MEMである。 </li><li> 5日目に、数を数える血球計数器を用いて顕微鏡で自動細胞カウンターを用いてまたは手動で元の培養プレートの各ウェル中の細胞（現在著しく赤芽球に富む）。 </li><li>各ウェルからすべてのセルを持ち上げて、15 mlのコニカルチューブに移し、室温で5分間525×gでスピンダウンし、上清を吸引し、および2×10の濃度にのみEPO（3 IU / ml）を含む新鮮なEGMでペレットを溶解5細胞/ ml。 </li><li> MS-5細胞は、前日めっき（共培養時には70〜80％の集密度をターゲット）とEPOのみの（ではないが、その培地を含むEGMでこれらのウェル中の赤血球細胞を追加したウェルから上清を吸引し選択は、MS-5細胞）数日間、EGMでよく生き残る。 </li><li>日の＃6に新鮮なEPOを追加する培地交換。 </li><li>無添加サイトカインとEGMを使用して、その日の＃7にメディアを変更します。毎日、抗TER119及びSYTO-16で染色した後、フローサイトメトリーによる除核およびp日間7〜9、試験サンプル上のマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（3章で詳述）のためのサンプルを染色するroceed。 注：メッキ前と2日目に、4、6、および培養7、サイズ（FSC）対表面マーカーCD44およびTER119を評価することにより、フローサイトメトリーで赤芽球濃縮および分化のための培養細胞をモニター9また、CD71、TER119、およびFSC。また、10、11を使用することができる。 </li></ol></li></ol> 2。高速除核アッセイ、吉田らが記載したプロトコルに従って。変更した12（図1B） <ol><li> in vitroの赤血球生成培養のためのストレス赤血球生成誘導と間質細胞調製<ol><li>動物実験委員会のガイドライン（ 例えばイソフルラン溶液による）あたりの2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを麻酔。マウスが十分に緩やかな後足のピンチに反射的反応の欠如のためにとのチェックをして麻酔されていることを確認してください手順の間に定期的な呼吸。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医眼軟膏を使用してください。 </li><li> 500μLの最終容量に出血尾を経由して、ストレス赤血球生成を誘導する。インスリン注射器を用いて、動物の腹腔内に流体蘇生（注入する前に、トレンデレンブルグ体位に動物を保持し、内臓を傷つけないように下腹部に注射する）を保証するために生理食塩水を等量のを注入する。 </li><li>ケージの周りを移動し始めと陥ることなく、立って歩くことができるという動物によって示されるように、モータ制御を取り戻したまで無人マウスを放置しないでください。 phlebotomizedマウスは他のマウスなしでケージに入れている。 </li><li> 2日後、24ウェル細胞培養プレートのウェル中のMS-5細胞をプレート。 70〜80であることを目標とMS5細胞培地中で37℃/ 5％CO 2（20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有する-MEM）でのMS-5細胞をインキュベート％コンフルエントのI48時間後、n個のプレートウェル。 </li></ol></li><li>脾細胞の脾臓および処理の収穫<ol><li>四日（96時間）ストレス赤血球生成誘導後、動物実験委員会が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入）を通じて以前に出血させ、マウスを安楽死させる。 </li><li>収穫脾臓とIMDM 2％FBSを含む15 mlのコニカルチューブに入れ、氷上に保つ。 </li><li>背中の研究室では、無菌条件下で組織培養フード内で、50 mlチューブの上にセットさ40μmのセルストレーナーに脾臓を含むチューブを反転させる。 5 mlのプラスチックシリンジのプランジャーを使用して脾臓をつぶす。 </li><li> IMDM +2％FBSを細胞ストレーナーを洗浄し、同じ培地を用いて、5mlまでの細胞懸濁液の最終体積を調整します。 </li><li>慎重にブレーキなし/低加速して、室温で25分間750×gで15 mlチューブとスピンで5ミリリットルの密度勾配細胞分離培地1.083グラム/ミリリットルで5ミリリットル脾臓細胞浮遊液を重ね。 </li><li>転送新しい15 mlチューブに、室温で5分間525×gでIMDM +2％FBSを含む1以上の洗浄を行い、上清（バフィーコートを取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてまで溶液） 。 </li><li>上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中でペレットを再懸濁することによって赤血球を溶解する。 </li><li> 7ミリリットルIMDM +2％のFBSで細胞を洗浄し、4℃で5分間、525×gでRBC溶解緩衝液とスピンを希釈し、中和するために追加</li><li>上清を吸引し、および赤芽球増殖培地（EGM）2mlにペレット化した細胞を一時停止。 </li></ol></li><li>プラスチック上の赤芽球が濃縮された孤立した低密度脾細胞、（高速のin vitro赤血球生成文化の第一段階）の培養<ol><li>自動細胞カウンターにまたは手動で、血球計数器で細胞を数える。この段階では、脾臓当たりの単離された細胞の通常の数は、約15×10 6である。 </li><li> fで（サイトカインを含む更な​​るEGM内のセルを一時停止inal濃度）：SCF 50 ng / mlのIL-3 5 ng / mlの、そしてエポ2単位/ ml。 </li><li> / 24ウェル細胞培養プレートを1ml /ウェル（ウェルの細胞の総数に応じて当たりのセルの数が同じ）の最終体積中で、37℃でO / Nインキュベート板1〜5×10 6細胞5％CO 2。 </li></ol></li><li> MS5細胞に対する赤芽球の培養物（ 体外赤血球産生培養において 、高速の第二段階<ol><li>吸引穴プラスチックからの上清各ウェルに氷の上に、5分間PBS中に冷たい10mMのEDTAの2ミリリットルを追加することによって、（強く赤芽球が濃縮された）細胞を持ち上げる。 </li><li> （サイトカインなしで）EGMで一度洗って同じに再懸濁、新しいチューブに細胞を入れた。 </li><li> 1〜2 mLの量のプレート5×10 5 -1×10 6個の各MS5細胞で被覆された24ウェルプレートのウェル。薬理学的阻害剤は、実験に使用されている場合は、ここで適切な濃度で追加してください。 </li><li>によって導か6から8時間（時間インキュベート未処理のWTサンプル中の約30％-40％の摘出）の顕微鏡観察。 MS-5細胞に対する赤芽球の結合は、彼らの摘出を加速させる。 </li><li>氷上で5分間、冷PBS + 10 mMのEDTAを2mlを添加することにより、各ウェルから細胞を持ち上げ。赤芽球と一緒に、MS-5細胞も収集することができるが、これらは、後で簡単にFSC こんにちは TER119として、フローサイトメトリー解析の際に除外することができます-細胞。 </li><li>この段階で、細胞をマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる分析のために固定し、染色することができる。 </li></ol></li></ol> 3。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核の間に細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化のための赤芽球の染色<ol><li> RTおよび上清を吸引し、5分間525×gでのスピン、PBS中で細胞を洗浄。 </li><li> （固定時間が反によって異なる場合があり、15分間、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド500μlの細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を固定GENはプロービング）し、穏やかにピペッティングしている。 </li><li> 1.5 mlのプラスチック製遠心管に移し、室温で15分間インキュベートする。 </li><li> 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、各チューブに500μlのPBSを添加し、緩やかにピペッティングすることによりワンウォッシュを行う。 </li><li> 20秒、吸引上清ベンチ微量2,000 XGでスピンし、少なくとも15分間氷上でチューブを保持します。透過化は、3.6から3.9は、迅速かつ効率的に行うべきであり、RTにて紡糸/吸引の後、細胞ペレットを直ちに細胞は、より自分の完全性を維持するために、氷上に戻すべきであるステップ。 </li><li> -20℃の冷凍庫からアセトン溶液を取り出し、氷上に置く。穏やかに500μlの氷冷50％アセトン（のdH 2 Oとの1:1）ピペッティングで第細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を透過。 </li><li> 20秒、吸引上清500μLに再懸濁細胞ペレット用のベンチ微量2,000 XGでのスピン60;優しくピペッティングによる氷冷100％アセトン。 </li><li> 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、静かにピペッティングして500μLの氷冷50％アセトン中でもう一度細胞ペレットを懸濁します。 </li><li>ベンチのマイクロスピン2000 20秒XG、上清を吸引し、穏やかにピペッティングすることにより冷FACSバッファー（PBS +0.5％BSA）で細胞を1回洗浄します。 </li><li>目的の分子に対する抗体またはマーカーで標識カクテルを準備します。赤血球細胞染色用のF-アクチン染色および1μl/100μLTER119-PECy7 0.1 U/100μlのAF488-ファロイジンを。代替的または追加的染色も（1:50）、AF-594-結合コレラ毒素サブユニットB脂質ラフトを標識する（1:200）、抗pMRLC（Ser19）AF-488-抗β-チューブリン抗体を用いて行うことができる一次抗ウサギAF-488結合二次抗体（1:400）、続いて、リン酸化ミオシン制御軽鎖に対する抗体（1:50）、および抗γ-tubu抗ウサギAF-555結合二次抗体（1:300）、続いて林一次ウサギ抗体（1:100）。 </li><li>上清を吸引後、穏やかにマーカーカクテル100μlのピペットで細胞ペレットを再懸濁し、RTで30分間インキュベートする。 </li><li>核染色のDRAQ5の2.5μMを含むFACS緩衝液を準備します。 </li><li>ベンチマイクロ遠心にDRAQ5を含む60μlのFACS緩衝液中で20秒、吸引上清と再懸濁のために2000×gでスピンダウン、FACS緩衝液で細胞を洗浄。 </li><li>イメージングで実行試料は、撮像に固有解析ソフトウェアフローサイトメーターを用いて、実験あたり少なくとも10,000の事象を収集し、以前に公表13として生データファイルを補償し、 図2に示すように、結果を分析するフローサイトメーター。 </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. 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R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine-dependent+engulfment+by+macrophages+of+nuclei+from+erythroid+precursor+cells.">Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells.</a> Nature. 437, 754-758 (2005).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

それはex vivoで赤血球の正常な、大規模生産を達成するために効果的に再現するのが最も困難であるインビトロ赤血球新生培養における工程であるため、近年、赤芽球除核の研究が増加する勢いを得ている。最近まで、赤芽球摘出利用主に蛍光顕微鏡の研究とは、フローサイトメトリー法。蛍光顕微鏡法は、関与する分子を同定するのに有用ではあるが、特定の時点で固定された...

哺乳動物の赤血球系統内の端末分化はオルソ赤芽球は赤血球2を生成し 、その膜包ま核（pyrenocyte）1を排出を通して摘出の劇的過程でまとめられる。また、インビトロで赤血球の成功した、大規模生産の律速段階であるこのプロセスの正確なメカニズムは、まだ完全には解明されていない。除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在は、蛍光および電子顕微鏡3-5の使用に依存している。この面倒なプロセスは、一般的に摘出イベントの限られた数の識別をもたらし、常に意味のある統計的な分析を可能にしていません。マクグラスら 6により、前述の赤芽球の識別方法に拡大し、我々は、マルチスペクトルいまで摘出イベントを特定し、研究する新しいアプローチを開発した測定値を取得し、統計分析を実行するために十分な数の観測値を提供することができるエージングフローサイトメトリー（フローにおける多パラメータの高速セルイメージング、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を組み合わせた方法）7。 ここでは、赤芽球を同期し、評価時に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される最初の2つのin vitroでの赤血球形成培養法を記載している。その後、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。 サンプルは、フローサイトメーターイメージングフロー上で実行され、回収した細胞をオルソ赤芽球6を識別するために、適切にゲートされています。明いまで測定されるオルソ赤芽球は、次​​いで、それらのアスペクト比に基づいて分析されそれぞれTER119及びDNAのために染色された領域の中心間の距離として定義されるパラメータデルタ重心XY TER119-DNA、のためのそれらの値に対するエージング。低アスペクト比及び高いデルタ重心XY Ter119/DNAを有する細胞の集団は、高度に細胞を除核内に濃縮される。 - / -たRac2上のRac1のMX-Creを媒介条件の削除と赤芽球に対する野生型（WT）赤芽球を使用して、または組み合わせたRac2 - / - ; RAC3 - / -遺伝的背景およびマルチスペクトル画像のこの新規な分析プロトコルは、フローサイトメトリー、我々は最近、脱核が非対称分裂に似ているし、RACのGTPaseによって部分的に調節アクトミオシン環の形成が摘出進行7のために重要であるとことを明らかにした。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

哺乳動物の赤血球生成は、赤血球の形成をもたらす摘出の劇的プロセスを終了します。摘出のメカニズムはまだ完全には解明されていない。顕微鏡による除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在を研究する際に遭遇する一般的な問題は、摘出を受けている細胞の十分な数を観察することが困難なことである。我々は、フロー内のマルチパラメータの高速セルイメージング（マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー）を効率的に除核事象のかなりの数を識別するために、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法を組み合わせた方法を用いて新規な分析プロトコルを開発し、それはを可能にする測定値を取得し、統計解析を行う。 まず、ここでは、マウス赤芽球を同期し、目に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される2つのin vitro赤血球新生培養法を記載評価のE時間。次に、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。サイズおよびオルソ赤芽球を識別するために使用されDNA/Ter119染色と共に、我々は、細長い細胞の認識および「デルタ重心XY Ter119/Draq5に役立つ明視野チャンネル内のセルのパラメータ「アスペクト比」を利用&quot;それはTER119染色（新生網赤血球）の中心は、このように脱核するのに約セルを示す、遠く離れDRAQ5染色（押出を受けて核）の中心からである細胞事象の同定を可能にする。高いデルタ重心と低アスペクト比を有するオルソ赤芽球集団のサブセットは高度に細胞を除核内に濃縮される。

まず、細胞は、その明のアスペクト比（その長軸に対して彼らの未成年の長さの比）とそれらの明領域（その大きさの指標）に基づいて分析する。明Area値20を下回ると、200よりも高いとのイベントには、それぞれ、主に破片および細胞凝集体である、と分析（ 図2A）から除外されます。単一細胞（ゲート「R1」）は、画像の鮮鋭度を示すグラデーションRMSパラメータのためのそれ...

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Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K ビュー.  University of Cincinnati College of Medicine. この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。 

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

生物学

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.