この作品は、健康とジョージE.ヒューイット財団フェローシップ（AP）の国立研究所からの補助金によって支えられている。

ゲル電気泳動 テクニカルノート ：手順を開始する前に、あなたのタンパク質サンプルをご用意。 この最初のステップで、サンプル中のタンパク質は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いてその分子量に従って分離されています。タンパク質サンプルを10分間70℃で加熱された後にドデシル硫酸リチウム（LDS）を搭載したNuPAGE ® LDSサンプルバッファーは、変性状態でポリペプチドを維持します。強力な還元剤は、二次および三次構造（DTT、ジスルフィド結合を破壊する）を削除するために組み合わせて使用​​されます。さらに、サンプルのタンパク質は負に帯電LDSで覆われてようになるため、正に帯電した電極に向かってゲルのアクリルアミドメッシュを介して移動する。これは、分子量（キロダルトン、kDaの単位で測定）にしたがってそれらの分離が可能になります。 試料調製とこのページの手順については、詳細なステップバイステップのプロトコルは、Invitrogen社のウェブサイト2、またはNuPAGEテクニカルガイド3に見つけることができます。 技術上のヒント<ol><li>インビトロジェンNuPAGEビス - トリス不連続緩衝液系では、タンパク質の電気泳動移動度とゲルのその後の分離の範囲は、次の2つの要因に依存しています：ⅰ）​​ゲルのacrylamid濃度（より低いのよりよい解決をもたらす大きなアクリルアミド濃度分子量蛋白質）及びii）を実行してバッファー、MOPSまたはMESの末尾のイオン。あなたが達成したい分離範囲の適切な組み合わせを選択するには、ゲルの移行図1を参照してください。井戸のゲルと数の厚さは、ボリュームとは、それぞれ、ロードするサンプルの量に依存します。 </li><li>あなたがゲルのウェルにあなたのサンプルをロードすると、少なくとも一つの車線は、分子量マーカー（またはラダー）用に予約されています。これらのタンパク質の基準は、移行の進行状況を追跡するための可視バンドを形成するように、いくつかの会社から市販されており、一般的に定義された分子量を有する染色されたタンパク質の混合物から構成される。あなたのゲルの解像度と互換性のある分子量の範囲を選択してください。 </li><li>素晴らしいとさえ移行パターンを達成するために我々は、サンプルまたは1X LDSサンプルバッファーの類似したボリュームを使用して、ゲルの全ウェルをロードすることをお勧めします。 </li></ol>転送 テクニカルノート ：転送ステップを開始する前に、トランスファーバッファー（10％メタノールと1X）と℃の低温室で4〜プレクールを準備。 抗体の検出にアクセス可能なタンパク質を作るためには、彼らはニトロセルロース膜にゲルからエレクトロブロッティングにより転送されます。タンパク質の結合は、疎水性相互作用だけでなく、膜とタンパク質の間の電荷の相互作用に基づいています。 （ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜は、代替として使用することができます。この場合には、PVDF膜は、メタノールで少なくとも30秒間使用前にプリウェットにする必要があります。） ラボは、InvitrogenのX細胞IIが装備されている場合にはBio - Rad社製ミニトランスブロット電気泳動トランスファーセル、または参照2-3をご使用の場合、転送手順の詳細なステップバイステップのプロトコルは、参考文献4に記載されています™モジュールの汚点。 このプロセスの結果として、タンパク質は薄い表面層と検出のための準備で公開されています。ゲルからメンブレンへのタンパク質の移転の均一性と全体的な効果は可逆ポンソーS色素膜の染色により確認することができます。 ポンソーS染色の手順（オプション）： <ol><li>タンパク質を転送した後、（タンパク質が上向きに）インキュベーショントレイに膜を置きます。 </li><li>膜をカバーし、穏やかに撹拌しながら、少なくとも30秒を培養するのに十分なポンソーS染色を追加。 </li><li>背景が透明になるまで蒸留水でメンブレンをリンス。 </li><li> 2〜3分間蒸留水を実行していると膜を脱色する。 </li><li>ブロッキング溶液で膜を置きます（下記参照）。 </li></ol> 技術上のヒント： <ol><li>我々は蛋白質が露出された側とあなたのサンプルの向きを示すために、タンパク質の転送の前に鉛筆を使用して膜にラベルを付けることをお勧めします。 </li><li>ポンソーS染色と分子量マーカーの両方が異なる抗体を用いて、結果の部分をプロービングするため、転送後の膜を切断するために使用することができる</li></ol>免疫検出： テクニカルノート ：この免疫検出の手順は、ガイドラインとしてのみ提供されています。最適化は、それぞれのアリのために必要となる場合がありますibody、具体的な情報は市販の抗体の大部分のデータシート（例えば、希釈、インキュベーション時間、等の作業）で見つけることができます。 この最後のプロセスの間に、標的タンパク質を特異的抗体を用いて検出され、フィルム上のバンドとして表示されます。バンドの強度が標的タンパク質の存在量に依存するのに対し、バンドの位置は、標的タンパク質の分子量の依存です。 通常、このは、次の3つのサブステップ後に達成される。 <ol><li>ブロッキング：メンブレン（膜上の余分なスペースは一般的な蛋白質の希薄溶液で覆われている）と抗体の非特異的相互作用を避けるために。 </li><li>プロービング：目的のタンパク質が特定で検出された<a title="一次抗体" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">一次抗体</a> 。未結合の一次抗体が洗い流さされた後、膜は、レポーターにリンクされている別の抗体にさらされている<a title="酵素" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">酵素</a> 、 <a title="西洋ワサビペルオキシダーゼ" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">西洋ワサビペルオキシダーゼ</a> （HRP）。この二次抗体を一次抗体の種特異的な部分（ 例えば抗ウサギ二次抗体は、任意のウサギ-情報源を一次抗体に結合される）に対して向けられている。 </li><li>検出：化学発光剤は、二次抗体にHRPにさらされた場合に冷光を発するれる基板として使用されます。この反応は、場所にし、プローブタンパク質の量に比例して発光を生成します。光は、写真フィルムで検出されます。 </li></ol>一般的なステップバイステップの手順を以下に用意されています。他の詳細な手順については、市販の抗体を伴うECL Plusはウェスタンブロッティング検出試薬の取扱説明書5にまたはほとんどのデータシートに記載されています。インキュベーション時間、抗体の希釈、およびブロッキングおよび洗浄溶液は、経験的にそれぞれの抗体のために最適化する必要があります。 免疫検出の手順： <ol><li>膜全体をカバーするためにPBS、1％カゼインブロッキング溶液の十分な量でインキュベートすることにより、非特異的結合をブロックする。室温で少なくとも30分間ロッカーの上に置いまたは4℃で一晩</li><li>あなたの一次抗体（目的のタンパク質に対して特異的）で膜をインキュベートする。一次抗体をブロッキング溶液で希釈してください。ほとんどの抗体は、完全な結合は、穏やかに攪拌下、室温で1-2時間のインキュベーション後に達成される。また、インキュベーションのステップは、信号対雑音比を高める° Cに4℃で一晩行うことができます。 </li><li>解決策を（° C -20 ° Cまで繰り返し使用するために破棄または4で保つ）を外し、すぐに一回膜を洗浄する。激しく振盪しながら室温でPBS、0.05％ツイーン20（PBST）でその後3X10分。 </li><li>ブロッキング溶液で希釈したHRP結合二次抗体で膜をインキュベートする。一次抗体が提起された種のIgGの部分を認識する抗体を選択してください。インキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で1時間行われます。 </li><li>液を捨て、すぐに一回膜を洗浄する。激しく振盪しながら室温でPBSTとし3X10分。 </li><li>メーカーの指示にしたがって化学発光検出に進みます。我々は、GEヘルスケア（具体的な手順については参考文献5を参照）からECL Plusはウェスタンブロッティング検出試薬を使用。 </li><li>サランラップやオートラジオグラフィーカセット内部のポーチと場所に膜を置きます。余分な液体を排出し、すべての気泡を除去することを確認してください。 </li><li>暗い部屋での膜への写真フィルムを公開。 1分間の露光時間で起動し、目的の信号強度に応じて調整する。 </li></ol> 技術上のヒント： <ol><li>非特異的結合のブロッキングは、タンパク質の希釈溶液で膜を配置することによって達成されます。我々は、通常1％のカゼインを使用していますが、 <a title="ウシ血清アルブミン" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">ウシ血清アルブミン</a> （〜2％BSA）または無脂肪ドライミルク（〜5％）を代替として使用することができます。 </li><li> （TBS）トリス緩衝食塩水の代わりにPBSの手順全体で使用することができます。あなたがphosphospecific抗体を使用して膜をプローブすることを計画している場合我々はTBSを使用することをお勧めします。 </li><li>の使用グローインザダークオートラジオグラフィーカセットの底部にタップステッカー（例えば、ストラタジーンのGlogos ® II Autoradマーカー）を使用すると、解析のステップ中に、フィルムや膜を整列するのに役立ちます。 </li></ol>分析今、あなたのフィルムを露出していることは、実用的な面で、すべての西部劇一素敵な単一のバンドとしての蛋白質を明らかにしないことを認識するであろう。ピアツリーLバンドはまた、プライマリとセカンダリの両方の抗体の非特異的結合のために表示されることがあります。このバックグラウンドシグナルは免疫検出の手順を最適化することによって減らすことができます。さらに、適切な制御（例えば、トランスフェクトされていない細胞、siRNAを処理した細胞、など）は、抗体の特異性と細胞膜上の標的タンパク質の正確な位置を決定するために有用であろう。 フィルムに膜から染色されたタンパク質の標準バンドの位置をマーキングした後、それぞれの分子量のログをプロット それらに対応する相対移動度 （x軸）に対する蛋白質の基準（y軸）の。相対移動度（Rf）は、（ゲルの正面）に移動しているタンパク質は、距離のトラッキング色素または低分子量のマーカーからの相対原点のその点（ゲルの上部）から移動した距離の比率で使用される用語です。傾きとy切片の値を取得するための標準曲線の回帰直線を決定する。あなたの標的タンパク質の未知の分子量（サイズ）は、そのRfと、次の修正式を用いて推定される。 分子量=（傾き）（標的タンパク質の移動性またはRf）+ y切片を記録する （詳しい手順については、基準6を参照）。 発現レベルの近似は、構造タンパク質（例えば、チューブリンやアクチン）あるいはGAPDHなどのハウスキーピング遺伝子産物のように標的タンパク質のバンド強度を比較することによって行われます。このいわゆる&quot;ローディングコントロールは、&quot;試料と特異的一次抗体を用いて明らかにされている間は変更しないでください。イメージがさらにタンパク質染色の相対量を評価し、光学密度の点で結果を定量化するデンシトメトリーにより分析することができる。

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

ここに示す手順では、MESは、インビトロジェンNuPAGE NOVEXの電気泳動システムを使用してページを変性の例として、バッファを実行するとビス - トリスゲルを使用しています。さらに、このプレキャストゲルシステムは、変性または非変性条件下でタンパク質の分離を可能にするだけでなく、広範囲の分子量を（ビス - トリスゲルのための100から200 kDaのからのための36から400 kDaのトリス-対応アセテートゲル?...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

西洋では（またはイムノ）ブロッティング捜査官は、タンパク質の発現を確認する、異なるサンプル中に存在するタンパク質の相対量を決定し、共免疫沈降実験の結果を分析できるように標準的な検査法です。この方法では、標的タンパク質は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定の一次抗体で検出される。分子量に応じてタンパク質の分離はSDS - PAGEを変性使用して実現されます。膜への転送後に、標的タンパク質は、特定の一次抗体でプローブされ、化学発光で検出。 その最初の記述以来、ウェスタンブロッティングの手法は、プリキャストゲルとユーザーフレンドリーな機器を含むいくつかの改良が施されています。当研究室では、我々はInvitrogen社から市販されてNuPAGE電気泳動システムを使用することにしました。それは革新的な中性pH、不連続SDS - PAGE、プレキャストミニゲルシステムです。 8ヶ月から1年までのプレキャストゲルの長い貯蔵寿命ⅰ）、ⅱ）1〜400 kDaの分子量の広い分離範囲はタイプによって定義：このシステムには含めて従来のLaemmliの手法に比べていくつかの利点を提示ゲル使用の;）とIII以上の汎用性（アクリルアミドの割合、ゲルの種類、および実行中の緩衝液のイオン組成の範囲）。 このビデオの記事で説明した手順4-12％ビス - トリス勾配ゲルとMESはインビトロジェンのNuPAGEの電気泳動システムを用いてウエスタンブロットを実行する方法の例として、バッファを実行するとビス - トリス不連続緩衝液系を利用しています。当研究室では、我々はこのウェスタンブロッティング法を用いて様々な生化学アプリケーション用の良いと再現性のある結果を得ている。

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

この技術記事では、Invitrogen社から市販されてNuPAGE電気ミニゲルシステムを使用して標準的なウェスタンブロッティング手順を説明します。

西洋は、Invitrogen NuPage NOVEXビストリスミニゲルを用いたウェスタンブロット

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.1K ビュー.  University of California, Irvine (UCI). この技術記事では、Invitrogen社から市販されてNuPAGE電気ミニゲルシステムを使用して標準的なウェスタンブロッティング手順を説明します。

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Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

内リンパ管の閉塞による内リンパ水腫の外科的誘導

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

生物学

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

官能ビス - ペプチドの固相合成方法を &quot;安全キャッチ&quot;を使用して

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化<em&gt;インビトロ</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

ウェスタンブロッティングにおける実用的で便利で信頼性の高い全タンパク質ローディング制御のためのV3染色不要のワークフロー

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...