財政支援は、NIH Directorの新イノベーター賞（1DP2HL117750）からダウド-ICESフェローシップからQJにし、アジア女性基金に、再生医療T32トレーニングプログラム（2T32EB003392）にNIHのバイオメカニクスからJMSに提供された。

フォトリソグラフィを用いてマスター型の1。作製<ol><li> ECMタンパク質ナノファイバー、nanofabricsおよびナノ構造を作製する第一のコンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを用いて設計される。このCADファイルは、フォトマスクに転写される。フォトマスクの種類は、特徴の解像度に依存します。機能の十分な透明性ベースのフォトマスクが約10ミクロンにまでサイズで。小さなフィーチャ&lt;10μmのガラスフォトマスク上のクロムが必要になります。ここで紹介するナノファイバーとナノ構造のすべてが透明ベースのフォトマスクを用いて作製し、このように横方向の寸法の厚さにナノメートルスケールであったが、されませんでした。 注：これは、（正または負）フォトレジストの種類と共に、このような（UV光を通過させる）フォトマスクの領域が暗くなるもの（通過するUV光を防ぐ）と透明になるものを区別することが重要である、マスター型の最終形状を決定することになる。 </li><li>マスターモールドの製造を開始するために、15分間150℃に設定したホットプレート上に置くことで4 &quot;シリコンウェーハを脱水。 </li><li>スピンコーターの真空チャック上のウエハをセンタリング。ウェハの真ん中にSU-8-2015ネガ型フォトレジストを注ぎ、ウェーハの約3分の2が覆われるまで同心円状に注ぐ続けています。 注：泡の発生を最小限に抑えるために注ぐときに近いウェハSU-8のボトルを保管してください。 </li><li>次のようにスピンコーターをプログラム： <ul><li>スプレッドサイクル：10秒100回転/秒の加速で500回転。 </li><li>スピンサイクル：30秒100回転/秒の加速で4000回転。 </li></ul>注：このスピンコーティングレシピの厚さが〜10μmであるフォトレジスト層を形成する。紡糸速度SU8又は製剤を変更することにより、厚さを調整することができる。 </li><li>ソフト3分間95℃に設定したホットプレート上に置くことで、ウェハを焼く。 </li><li>を介してUV光でウエハを露光140ミリジュール/ cm 2の総投与用のフォトマスク。 注意：SU-8は、したがって、UV光がフォトマスクを通過することができる領域は、開発した後に残り、マスターモールド上の隆起になるネガ型フォトレジストである。 </li><li> 4分間95℃に設定したホットプレート上に置くことによって、ウエハ焼く露出を投稿してください。 </li><li> 3分間のSU-8の開発者に置くことで、ウェハを開発しています。 3分後、イソプロピルアルコールでウエハをすすぐ。白色フィルムは、すすぎの間に生成される場合、ウェーハは完全に開発されるものではなく、別の30秒間現像剤に戻されるべきである。イソプロピルアルコールで再度洗い流す。白色フィルムは、イソプロピルアルコールすすぎ時に形成しなくなるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li>ほこりから保護するために150ミリメートルペトリ皿中の窒素と場所の流れの中で、ウェーハを乾燥させます。 </li></ol> 2。PDMSスタンプを作る<ol><li>エラストマーベースを組み合わせ、中に硬化剤でのPDMSプレポリマーを製造10時01 w / wの比率。典型的には、塩基及び硬化剤8gの80gを厚さ1cmの層にマスターモールドをカバーするのに十分なPDMSがあることを確認するために使用される。 </li><li>混合し、次のように設定求心ミキサーを使用して、PDMSを脱ガス： <ul><li>ミックス：2分間2,000 rpmで</li><li>ドガ：2分2000回転。 </li></ul></li><li>ミキサーが使用できない場合は10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて10分間、手でPDMSを混ぜる。気泡を除去するために30分間、真空デシケーター中に置くことによって混合物を脱気。 </li><li>厚さ1cmの層を形成したマスター型（パターン化されたシリコンウエハ）上で十分なのPDMSプレポリマーを注ぐ。 4時間又は48時間室温にて65℃で焼成することによりPDMSを硬化させる。 </li><li>一度硬化し、パターンを含む領域はPDMSスタンプを形成するために切り出すことができる。 PDMSスタンプの裏面側から特徴を区別するために、スタンプの裏側に角部の一方の外ノッチをカットする。 </li></ol> 3。マイクロコンタクトのPrECMパターンのinting <ol><li>きれいな直径25mmのガラス製カバースリップ65℃のオーブン中で1時間、次いで乾燥のために95％エタノール中で超音波処理による。 </li><li>濃度10％（重量/体積、10ml中の典型的には1 g）で1 - ブタノールにグラフティングを溶解させてグラフティング溶液を調製する。 </li><li>全体ガラス表面が覆われるようにグラフティング·ソリューションのスピンコーターピペットを200μlの真空チャック上のカバーガラスを中央に。 </li><li> 1分間6000回転でカバーガラスをスピンコート。 </li><li>窒素の流れの下で30分、その後、乾燥のために50％エタノール中で超音波処理によって、PDMSスタンプを清掃してください。 注：乾燥およびその後の工程はECMナノ構造セルで使用されるアプリケーションのための無菌性を維持するために、バイオセーフティキャビネット内で行われるべきである。 </li><li>コー​​ト各PDMSのパターン化された表面は、タンパク質溶液200μl、FNのための滅菌蒸留水に、通常、50μg/ mlのでスタンプ。室温で1時間インキュベートする。 注：のThボリュームをコーティングさは1.5センチメートル2 PDMSスタンプのためであり、PDMSスタンプを用いECMタンパク質および溶液中のECMタンパク質の濃度の大きさに応じて調整する必要があります。 </li><li>過剰なタンパク質を除去し、窒素気流下で完全に乾燥蒸留水に、PDMSスタンプを洗う。 注意：スタンプに残ってすべての水がカバースリップ上でグラフティングコーティングの早期解散の引き金と適切なタンパク質の転送を防ぐことができます。 </li><li>無菌製造のための、閉じたペトリ皿の内側にグラフティング·コートしたカバーガラスを配置し、UV照射を用いて滅菌し、生物学的安全キャビネット内のUV光下で45分間で十分である。無菌性が必要とされない場合は、このステップを省略することができる。 </li><li>グラフティングでコーティングされたカバースリップに接触してPDMSスタンプの機能面を配置することによって、マイクロコンタクト印刷を実行します。必要に応じて、気泡を除去し、均一な接触を確実にするためにスタンプの背面を軽くタップする鉗子を使用。 </li><li> 5マイルの後N、カバースリップからPDMSスタンプをはがし。 </li><li>この段階で、追加のECMタンパク質は、より複雑で多成分構造体を作成するためにパターン化することができる。 3印刷物まで、このプロセスで動作することが確認されており、それ以上は実行可能である。 </li></ol> ECMナノファイバーおよびナノ構造の4。リリース<ol><li> 35ミリメートルペトリ皿にパターン化されたグラフティングコーティングされたカバーガラスを配置し、位相差顕微鏡を用いたパターン忠実性を検査します。パターンに応じて、CCDカメラは、パターンの特徴を解決する必要があるかもしれない。蛍光顕微鏡はまた、ECMタンパク質が蛍光標識された提供されたパターンを検査するために使用することができる。 </li><li>ペトリ皿に40℃の蒸留水3mlを加え、水が徐々に冷却します。 </li><li>グラフティング層の溶解およびECMタンパク質の放出パターンは、位相差顕微鏡を用いてモニターすることができる。アプリケーションは、光学TECの使用を許可しない場合hniques、放出は、溶液温度を測定することによりモニターすることができる。典型的には、水は、ECMタンパク質ナノ構造体が解放されたことを確認するため、ウェルグラフティング（32°C）のLCSTより下、室温に冷却する。 </li><li>リリース後、ナノファイバー、nanofabrics、その他のナノ構造は、水に浮かんでいる。それらを使用する更なるアプリケーションのためにそれらを操作する必要がある。正確なアプローチは、実験の目的に依存し、そのような、別の表面上に固定化するマイクロマニピュレータシステムに移動するか、ヒドロゲル中に埋め込むようなステップを含んでもよい。 </li></ol>

<ol>
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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

SIA法は、模倣細胞媒介マトリックスアセンブリここに提示され、調整可能なサイズ、組織と組成物とECMタンパク質ナノファイバーおよびナノ構造のエンジニアリングを可能にします。細胞で生成されたECMとは同一ではないが、SIAは機械的ひずみ21の間に展開/折りたたみ可逆を受け、細胞を20と結合することができるナノスケールのタンパク質線維20で構成され...

組織中の細胞外マトリックス（ECM）の接着、増殖、分化、およびアポトーシス1-3を含む複数の細胞プロセスの物理的および化学的調節に関与する多機能性タンパク質で構成されている。 ECMは、合成され組み立てられ、かつ細胞によって組織され、構成タンパク質線維は、組織の種類と発達段階に応じて変動独特の組成物、繊維サイズ、形状及び相互接続されたアーキテクチャを持っている。最近の研究は、ECMの組成および構造の点でECMをrecapitulatingする組織工学および生物工学用途のためのバイオミメティック材料の開発を可能にするかもしれないことを示唆している、操作された組織4を形成するために細胞を導くために有益な手がかりを提供することができることを実証した。 製造方法の数は、組織中のECMの態様を模倣することができるポリマー足場を設計するために開発されている。例えば、エレクトロスピニングと位相SEPARATIONは、両方のダウン数十マイクロメートルから数十ナノメートル5-7の範囲の直径を有する繊維の多孔質マトリックスを形成する能力を実証した。両方の技術はまた、ナノファイバーの高度に多孔性マトリックスが足場8への細胞接着および浸潤をサポートできることを示している。しかしながら、これらのアプローチを作成することができる可能な繊維の幾何学的形状、配向および3次元のアーキテクチャで制限される。相分離がランダムに配向した繊維で足場を作り出すのに対して、電界紡糸は、一般的にランダムに配向または高度に整列いずれかの繊維と足場を生成します。材料の制限は、研究者は、典型的には、ポリ続いて、細胞接着を促進するために、ECMタンパク質でコーティングされている（ε-カプロラクトン）8、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）9などの合成ポリマーを用いても存在する。天然のバイオポリマーはまた、コラーゲンタイプI 10、11、ゼラチン、フィブリノゲン12を含め、使用されているキトサン13、シルク14が、ネイティブ組織に見られるタンパク質の小さなサブセットのみを表しています。ほとんどの組織は、既存の方法を使用してナノファイバーを製造することが困難または不可能であるフィブロネクチン（FN）、ラミニン（LN）、IV型コラーゲンおよびヒアルロン酸などのECMタンパク質および多糖類の大きい環境を含む。 この課題に対処するために、我々は彼らの周囲のECMタンパク質の線維を組み立て、整理、細胞が合成する方法を模倣する上で我々の研究努力を集中してきた。特定の線維形成プロセスが異なるECMタンパク質によって異なりますが、一般的に、ECMタンパク質分子の立体構造変化は、暗号のような自己組織化サイトを公開し、酵素や受容体を介した相互作用によって引き起こされます。ここでは、より良い線維形成過程を理解するためのモデル系として、FNを使用しています。簡潔には、FNホモダイマー、第10タイプIIにRGDアミノ酸配列を介して細胞表面上のインテグリン受容体に結合する私はユニットを繰り返します。一度結合すると、インテグリンは、アクトミオシンの収縮を経由して離れて移動して、暗号のような自己組織化サイトを公開するために、FNの二量体を展開。これらのFN-FN結合部位の露出は右のセル表面15に不溶性の線維に組み立てるために、FNダイマーを可能にします。無細胞系での作業は、不可解なFN-FN結合部位は、空気-液体-固体界面17から19に、変性剤16又は表面張力を使用して展開を通じて明らかにすることができることを実証した。しかしながら、これらの技術によって作成されたFN繊維は、特定の繊維のサイズおよび形状に制限され、典型的には表面に結合される。 ここでは、アプローチが自立不溶性ナノファイバー、nanofabrics（2Dシート）および単一または複数のECMタンパク質からなる他のナノ構造を作成するために、タンパク質-表面相互作用を利用することによって、これらの制限を克服する表面開始アセンブリ（SIA）20（ 図1と呼ばれる記述）。このP INrocessは、ECMタンパク質は、パターン化された、疎水性のポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプの上にコンパクトな球状溶液中のコンホメーションと部分的に変性（アンフォールド）から吸着される。 ECMタンパク質は、次いで、22マイクロコンタクト印刷を介して熱応答性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（グラフティング）表面上に、この状態で転送される。 40°Cの水で水和するときグラフティングは、固体のままであるが、32℃に冷却したときに、それが親水性となる下限臨界溶液温度（LCST）を通過し、水で膨潤し、次いで溶解するのオンオフ組み立てられたECMのナノ構造体を解放する表面。 SIA法は、ナノメートルスケールの精度で寸法を制御します。そのような組成物、繊維形状、アーキテクチャなどの重要なパラメータを制御することにより、 インビボで見出さECMの多くの特性を再現し、組織工学及びバイオテクノロジーの用途のための高度な足場を開発することが可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

組織中の細胞外マトリックス（ECM）は、厳密に調節繊維径、組成および組織と3D繊維状タンパク質ネットワークを形成する細胞によって合成され、組み立てられる。構造的支持を提供することに加えて、ECMの物理的および化学的特性、接着、分化、およびアポトーシスを含む多数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。 インビボで 、ECMは、タンパク質内の潜在性自己組織化（線維化）部位を露出させることによって組み立てられる。このプロセスは、異なるタンパク質を異なるが、フィブロネクチン（FN）原線維は、十分に特徴付けされ、細胞媒介ECMアセンブリのためのモデル系として働く。具体的には、細胞が不溶性繊維にアセンブリのための結合部位を展開し、公開するために、FNの二量体およびアクトミオシンで生成された収縮力を結合するために、細胞膜上のインテグリン受容体を使用しています。この受容体を介したプロセスは、組織SCAに携帯からECMを組み立て、整理するために、細胞を可能にしますレ。ここでは、ECMタンパク質をアンフォールドし、不溶性繊維にそれらを組み立てるために、タンパク質 - 表面相互作用を用いて細胞媒介性マトリックス立体を再現する方法と呼ばれる表面開始アセンブリ（SIA）を提示する。まず、ECMタンパク質は、それらが部分的に（アンフォールド）変性させ、潜在的結合ドメインを露出疎水性ポリジメチルシロキサン（PDMS）表面に吸着される。折り畳まれたタンパク質は、その後、熱応答性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（グラフティング）表面上にマイクロコンタクト印刷により明確に定義されたミクロおよびナノパターンの中に転送される。グラフティングの熱トリガー溶解が最終組み立てと明確に定義された形状を有する不溶性ECMタンパク質ナノファイバーおよびナノ構造の放出をもたらす。複雑なアーキテクチャは、マイクロコンタクト印刷に使用するPDMSスタンプ上に定義されたパターンを操作することによって可能である。ラミニン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンIおよびIVは、多成分ECMのnanostrucを作成するために入力してFNに加えて、SIAプロセ​​スを使用することができるトゥーレス。このように、SIAは、 インビボで ECMの構造及び組成を再現するために、タンパク質組成物、繊維形状及び足場アーキテクチャを高い精度で制御するECMタンパク質ベースの材料を操作するために使用することができる。

SIAは、ファイバの寸法を高い精度で制御するエンジニアリングECMタンパク質ナノファイバーが可能である。これを実証するために、50×20μmの平面寸法、Fnとナノファイバーの配列は、グラフティングコーティングされたカバーガラス（ 図2A）上にパターン化された。グラフティング表面にパターン化されたときに（ 図2B）、固有のプレストレス下にあったため、放出...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質からナノファイバーおよび複合ナノ構造体を得るための方法が記載されている。この方法は、組織工学及びバイオテクノロジーの様々なアプリケーションで使用するために調整可能な組成物およびアーキテクチャに自立タンパク質ベースの材料を作成するために、タンパク質 - 表面相互作用を使用する。

表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K ビュー.  Carnegie Mellon University. 単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質からナノファイバーおよび複合ナノ構造体を得るための方法が記載されている。この方法は、組織工学及びバイオテクノロジーの様々なアプリケーションで使用するために調整可能な組成物およびアーキテクチャに自立タンパク質ベースの材料を作成するために、タンパク質 - 表面相互作用を使用する。 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

生物工学

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

強化されたマイクロおよびナノ操作のためのプラズモニックとフォトニック結晶ナノ構造の利用

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

操作された血管柄マッスルフラップ

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

光干渉断層計を用いた分解足場ベース組織設計血容器開発の非破壊モニタリング

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

有機溶媒混合物中の複雑なナノ構造へのガンマ修飾ペプチド核酸の自己集合

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...