この作品は、NSFのHRD-0630456によってサポートされていました、NSF CRESTプログラムとNSFは、DMR-0934142です。

1。 αの合成、ω-ジヒドロキシポリマー[HO-PEO-P2MS-PEO-OH] <ol><li> 図1に示すように、重合反応器を組み立てます。この実験のための反応器は、標準的なテーパージョイント外側（Chemglass）、三方活栓を持つ2つのフロー制御アダプタ（Chemglass）、および1テフロン攪拌棒を有する2口フラスコ100mlの丸底で構成されています。アダプタA（ 図1）は不活性システムに侵入する空気や水分を防ぐために、システムを介して超高純度（UHP）窒素の流れを維持するために使用された。アダプタB（ 図1）を反応フラスコに、溶媒、モノマーおよび開始剤を注入するために使用されていました。 </li><li>乾燥窒素ガス下で6時間の最小値に対して、指標としてベンゾフェノンを用いて、Na金属の上にテトラヒドロフラン（THF）200mlを乾燥させてください。 </li><li> 24時間水素化カルシウム上で2 - メトキシ10mlを乾燥させてください。 </li><li> ℃でイソプロパノールのスラリーを用いて-78℃で維持低温風呂の準備をするND液体窒素。 </li><li>窒素ガス下（ 図1を参照）重合反応フラスコに、THFの25 mlを加え、重合を介してすべての窒素ガス下で反応を保つ。 </li><li>スラリー中に場所を100mlの丸底フラスコ。 </li><li>反応フラスコに、開始剤溶液2 mlを（0.27ミリモル/ ml）を追加します。 </li><li>反応フラスコに第一のモノマー、2 - メトキシ（4 ml）を注入します。 </li><li> 40分間進行する反応を可能にします。 </li><li>第二のモノマー、エチレンオキサイドの1ミリリットルを追加します。 </li><li>重合は2日間室温で継続することができます。 </li><li> HClとポリマー（6M）/メタノール（1/20、体積/体積）を終了。 </li><li>ヘキサンおよび真空オーブンで乾燥したポリマー中に沈殿させてポリマーを精製する。 </li><li> NMRを用いてポリマーを特徴付ける。 </li></ol> 2。 α、機能Polymを入手するためにN-2 ,4-DNP-Ε-アミノカプロン酸、ω-ジヒドロキシ持つ高分子の機能化えー、CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP <ol><li> 3口フラスコに、α、ω-ジヒドロキシポリマー（0.05ミリモル）、N-2 ,4-DNP-E-アミノカプロン酸（0.25ミリモル）、DCC（0.15ミリモル）およびDMAP（0.005 mmol）とを配置4時間真空ラインで乾燥させてください。 </li><li>フラスコに乾燥ジクロロメタン（10 ml）を蒸留する。 </li><li>窒素下で真空を解放し、室温で12時間反応をかき混ぜる。 </li><li>フィルター反応混合物およびヘキサン、メタノールに二回沈殿させることによってポリマーを回収。 </li><li>乾燥は、40℃の真空オーブン中でポリマーを沈殿させた</li><li> FT-IRおよび1 H NMRによる高分子の構造と機能を決定します。 </li></ol> 3。エレクトロスピニング用CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT溶液の調製<ol><li>クロロベンゼンCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNPの20重量％を溶解します。 </li><li> 2の溶液を調製するクロロベンゼンで20ワット％とポリスチレンの40重量％（分子量800,000）を溶解。高い分子ポリスチレンはincreasに使用されている電子ポリマー鎖鎖の絡み合いとエレクトロスピニングするために必要な最適な粘度を得る。 </li><li>ポリマーの1:1と1:2の比率を形成し、混合物を1重量％の単層カーボンナノチューブ（SWCNT）を追加し、CNTの均一な分布のために一晩撹拌するために一緒に3.1と3.2で調製したポリマー溶液を混合。 </li></ol> 4。ポリマーCNTコンポジットのエレクトロスピニング<ol><li> 図2に示すように設定するエレクトロスピニングを組み立てます。図の右側にグラスマン高圧電源です。その隣に、シリコンウエハが接続されているレトルトスタンドです。左にシリンジをマウントして、その背後にそれが進行するとの手順を可視化するためのランプであるされている別のレトルトスタンドです。 </li><li>皮下注射器を使用して、CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT混合物（約1ml）の少量を撤回し、レトルトスタンドに皮下注射器をマウントします。 </li><li>シリコンウェハは、マウントされ10cmの距離でしっかりとシリンジ、高電圧源のグランド·クリップ向かいedはそれに接続されています。 </li><li>注射器の針に印加する高電圧を冠しクリップを取り付け、プランジャーを少し（針先端のドロップを中断するために）押し下げ、この時点では、エレクトロスピニングは準備ができています。 </li><li>高電圧源の電源をオンにし、10 kVの電圧計を調整します。複合材料中のポリマーの性質に応じて、より高い電圧は、直径が数百ナノメートルの下のナノファイバーが望まれている場合は、特に必要がある場合があります。 </li><li>完全に乾燥するために一晩デシケータでアンマウントシリコンウェハと場所。 </li></ol> 5。ナノファイバーの特性評価<ol><li>ナノファイバーの初期イメージングは​​、繊維の全体的な視点を観察する光学顕微鏡を使って行われます。 </li><li>形態、直径、平均細孔径、等のような細かい詳細を観察する走査型電子顕微鏡の活用</li><li>キャリー繊維などの3次元地形を観察する原子間力顕微鏡でさらにイメージング出</li></ol> 6。抗DNP IgEタンパク質とナノファイバーの結合特異性<ol><li> PBS-BSA（リン酸緩衝生理食塩水 - ウシ血清アルブミン）溶液に4 UG / lの蛍光標識、FITC標識抗IgE（フルオレセインIsothio - シアネート - 免疫グロブリンE）の溶液を調製します。 </li><li>マテックよくカバースリップ上のナノファイバーが発生していたシリコンウェハの小片を置きます。 1時間この溶液中でナノファイバーをインキュベートする。インキュベーションは、優しく、シリコンウェハ上に、10μlのIgEのソリューションをピペッティングすることによって行われます。 </li><li>インキュベーション後、PBS-BSA緩衝液でサンプルを三回洗浄することによって結合していないIgEを削除します。 PBS溶液をナノファイバー上に直接バッファを潮吹き避けるために、マテック皿の壁にそっと分配される。ナノファイバー上に緩衝液を配布するための手で優しく渦巻皿を。ピペットで注意深くバッファを削除して再泥炭この2回以上。 </li><li>制御のために、同じ条件で蛍光標識IgG（DNPの非特定の）でナノファイバーをインキュベートする。 </li><li> IgEと結合観察する共焦点レーザ顕微鏡を用いたバインドされた繊維を可視化する。私たちの研究のために、使用される顕微鏡は、63Xレンズ付きライカTCS SP2共焦点だった。 </li></ol> 7。ナノファイバーの電流 - 電圧特性<ol><li class="jove_content">ケースレー6430敏感なソースメータのような非常に低い電流源に2マイクロポジショナーを接続します。現在の電圧の挙動を決定するためのセットアップ図3に示します。この図は、ナノ繊維の初期のIV特性を決定するために使用されるプローブ·ステーションを示しています。それはボシュロムMicroZoom顕微鏡、真空チャックステージ、およびプロービングに使用される4つのMicropositionersで構成されています。右上のAgilent 34405Aデジタル·マルチメータは、電圧を測定する際に使用し、その下にはされている<html>ソースに繊維に入力された低電流を使用ケースレー6430サブフェムトアンペアリモートソースメータ。 </li><li class="jove_content">繊維に触れる先端と反対側に繊維マットの上にマイクロポジショナーのプローブ·アームをマウントします。 </li><li class="jove_content">デジタルマルチメータに別の2つのマイクロポジショナーを接続し、他の2つの間インプローブ·アームをマウントし、繊維マットのヒントを着陸。 4つのヒントは、できるだけ同一直線上にあることを確認します。 </li><li class="jove_content">ケースレー（典型的にはナノアンペアの範囲）からの電流の量を変化させる入力。 </li><li class="jove_content">供給される電流の大きさのためにすべての外側先端の両端の電圧降下を測定します。 </li><li class="jove_content">これらの値をプロットすると、繊維マットのように動作するデバイスの種類を示します。 </li></ol> 8。代表的な結果機能性高分子α、ω-ビ[2,4 - ジニトロフェニルカプロン]の合成のための &quot;&gt;メソッド[ポリ（エチレンオキシド）-b-ポリ（2 - メトキシスチレン）-b-ポリ（エチレンオキシド）]（CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP）は、図4に示されている。機能性高分子の1構造は、FT-IR（ 図5）と500 MHzの1 H NMRスペクトル（ 図6）により確認された。FT-IRは完全に消失を示しています-OH -1 CDNPグループとの定量的な官能基を示す3500センチメートル周辺の広い吸収が、これはまた、 図6に示すように、NMRスペクトルによって確認された。NMRスペクトルにおけるピークの積分を使用して、それを決定したことCDNP-PEO -P2MS-PEO-CDNPポリマーが定量的に官能化される。 ナノファイバー 図7では、クロロベンゼンからCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /ポリスチレン/ SWCNTをエレクトロスピニングによって得られた導電性ナノファイバーのマットはshです自身。得られた共焦点画像は、タンパク質IgEが繊維表面にDNPと結合することを示した。3これはIgE抗体に向かって電界紡糸DNP-ポリマーの結合の特異性の指標である。タンパク質が蛍光標識される光の強度は、ナノファイバー上のIgEの存在の指標となる。 図8aは、このプロセスと図8bによって得られたナノファイバーは、この特定のナノファイバーの寸法は直径150 nm付近であることを示している1のAFM（原子間力顕微鏡）像である。このプロセスによって100から700 nmの間の繊維が得られる。この現在の時点ではそれは特定の次元を有する繊維を準備するために挑戦している。これは、他のグループで観察されるものと一致している。9に示すCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /ポリスチレン/ SWCNTのSEM像4 図は、ナノファイバーおよびナノファイバーの直径が200nm〜300nmの間であった。3 SEMがありますnanofibeのイメージrsは異なる倍率で示す。 3つの画像の研究では、繊維の形態は線形とビーズアールを示しています。全体的な目標は、主に線形である繊維を調製することである。 図10 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /ポリスチレン/ SWCNTから調製されたナノファイバーのマットのIVプロットを示しています。プロットは、抵抗（オーム）の挙動を示している。抗原がナノファイバーにバインドされているとき、我々は抵抗のこの変化は、機能性繊維は、単一分子検出のためのセンサーの有効成分として潜在的なアプリケーションを持っていることを示唆している特徴であるように繊維マットのIVの挙動の変化を見ることを期待。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig1.jpg" /> 図1は、α、ω-ジヒドロキシポリマーを合成するための重合反応器。フローUHPガス窒素のA）注入地点。 B.）、溶媒、モノマー、およびイニシエータの注入ポイント。 C）を反応容器を。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig2.jpg" /> 図2：グラスマン高圧電源を用いて電界紡糸に使用されるセットアップ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig3.jpg" /> 図3：サブフェムトアンペアリモートソースメータ（Keithley社）を用いてIVのプロットを測定するために使用されるセットアップ。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig4.jpg" /> OH-PEO-P2MS-PEO-OHのポリマーを製造するための4）。合成アプローチ図 。 α、ω-ジヒドロキシのB）の官能[ポリ（エチレンオキシド）-b-ポリ（2 - メトキシスチレン）-b-ポリ（エチレンオキシド）]。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig5.jpg" /> の図5 FT-IRスペクトル（A）は、OH-PEO-P2MS-PEO-OH CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNPと（B）CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNPへの前駆体。 <img alt="図6"SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4135/4135fig6.jpg&quot; /&gt; 図6 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNPの500MHzプロトンNMR。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig7.jpg" /> 図7。）クロロベンゼンからCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP繊維エレクトロとのFITC-IgEの結合画像。コントロールのB）の共焦点顕微鏡像（IgGとナノファイバー）。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig8.jpg" /> 図8。）クロロベンゼン及び図5aに示すように1つの繊維B）のAFMプロファイルすなわちディメンションからCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNPファイバーエレクトロスピニングのAFM像。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig9.jpg" /> 図9。CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /ポリスチレン/ SWCNTのナノファイバーのSEM像。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig10.jpg"/&gt; 図10 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /ポリスチレン/ SWCNTから調製したナノファイバーのマットのIVプロット。

<ol>
	<li>Sannigrahi, B., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Characterization+of+&#945;,&#969;-bi[2,4-dinitrophenyl+(DNP)]+poly(2-methoxystyrene)+Functional+Polymers.+Preliminary+Evaluation+of+the+Interaction+of+the+Functional+Polymers+with+RBL+Mast+Cells.">Synthesis and Characterization of &#945;,&#969;-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).</li><li>Gordon, K., Sannigrahi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Optically+Active+Helical+Poly(2-methoxystyrene).+Enhancement+of+HeLa+and+Osteoblast+Cell+Growth+on+Optically+Active+Helical+Poly(2-methoxystyrene)+Surfaces.">Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).</li><li>Baird, E. J., Holowka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Effective+Poly(Ethylene+Glycol)+Architectures+for+Specific+Inhibition+of+Immune+Receptor+Activation.">Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation.</a> Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).</li><li>Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -. E., Ma, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , (2005).</li><li>Kameoka, J., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Oriented+Polymeric+Nanofibers+on+Planar+Surfaces+by+Electrospinning.">Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning.</a> Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).</li><li>Ramakrishna, S., Lala, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Nanofibers+for+Biosensor+Applications.">Polymer Nanofibers for Biosensor Applications.</a> Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).</li><li>Reuven, D., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Archetypical+Conductive+Polymer+Structure+for+Specific+Interaction+with+Proteins.">Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins.</a> Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , (2012).</li><li>Ogunro, O., Karunwi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+Asymmetry+of+Helical+Polymer+Nanowire.">Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

本稿では、生体機能性ナノファイバーを製造するための強力なアプローチを提示している。ナノファイバーは、モデルタンパク質に特異的である官能基に装飾が施されています。この通信で報告された手順とアプローチは、一般的なものであり、所望の任意の官能基が飾られたナノファイバーを調製するために用いることができる。アニオンリビング重合が共有結合し、関心のある特定のバ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ナトリウム金属</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 282065 </td></tr><tr><td>ベンゾフェノン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 239852 </td></tr><tr><td> 2 - メトキシ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 563064 </td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 178810 </td></tr><tr><td>クロロベンゼン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 319996 </td></tr><tr><td>単層カーボンナノチューブ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 704113 </td></tr><tr><td>ポリスチレン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 81416 </td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>シリコンクエストインターナショナル</td><td> 720200 </td></tr><tr><td>ツァイスFESEM </td><td>カールツァイス社</td><td>ウルトラ60 </td></tr><tr><td>ボシュロムMicroZoom IIの高性能顕微鏡によるProbestation </td><td>バウシュとLoメガバイト</td><td></td></tr><tr><td>ライカ走査型共焦点システム</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> TCS SP2 </td></tr><tr><td>サブフェムトアンペアリモートソースメータ</td><td>ケースレーインスツルメンツ</td><td> 6430 </td></tr><tr><td>デジタル·マルチメータのオートレンジ</td><td>ケースレーインスツルメンツ</td><td> 175A </td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td> Chemyx株式会社</td><td>フュージョン200 </td></tr><tr><td>ツァイス光学顕微鏡</td><td>カールツァイス社</td><td>ツァイス/ Axiotech </td></tr></tbody></table>

procedure for fabricating biofunctional nanofibers

エレクトロスピニング法は、官能基で飾られたナノファイバーを製造するための効果的な処理方法である。官能基が飾らナノファイバーは、単一分子検出器のような可能性を秘めたバイオセンサーとして作用すなわち物質のバイオマーカーの相互作用を研究するために利用することができる。我々は、機能性はモデルタンパク質と特異的に結合する能力を持っている機能性ポリマーを製造するための効果的なアプローチを開発しました。我々のモデルシステムでは、官能基は、2,4 - ジニトロフェニル（DNP）とタンパク質である抗DNP IgE（免疫グロブリンE）です。機能性ポリマー、α、ω-ビ[2,4 - ジニトロフェニルカプロン] [ポリ（エチレンオキシド）-b-ポリ（2 - メトキシスチレン）-b-ポリ（エチレンオキシド）]（CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP）は、アニオンリビング重合によって調製される。重合に利用二官能性開始剤は、α-メチルスチレンとカリウム（ミラー）は、金属の電子移動反応によって調製した。 2 - メトキシスチレンモノマーが追加されましたイニシエータに、第一、第二のモノマー、酸化エチレンを付加し、続いて、最後にリビングポリマーをメタノールによって終了されました。 α、ω-ジヒドロキシポリマー[HO-PEO-P2MS-PEO-OH]のα、ω-biの形成をもたらすのDCCカップリングによるN-2 ,4-DNP-∈-アミノカプロン酸、と反応させた[ 2,4 - dinitrophenylcaproic] [ポリ（エチレンオキシド）-b-ポリ（2 - メトキシスチレン）-b-ポリ（エチレンオキシド）]（CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP）。ポリマーは、FT-IR、1 H NMRおよびゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によって特徴付けられた。ポリマーの分子量分布は狭かった（1.1-1.2）、50,000より大きい分子量を有するポリマーをこの研究で使用されていました。ポリマーは、黄色の粉末及びテトラヒドロフランに可溶であった。水溶性CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG（dimethoxyethyleneグリコール）複合体は、結合して数秒以内に解IgEと定常状態の結合を実現しています。より高い分子量（約50,000水不溶性IE）より1パーセントを含むP-PEO-P2MS-PEO-CDNPポリマーは、単層カーボンナノチューブ（SWCNT）は、シリコン基板上に電気的に活性なナノファイバー（100 nmの直径が500ナノメートル）に加工した。蛍光分光法は、抗DNP IgEが飾るDNPの官能基の繊維と結合することにより、ナノファイバーと相互作用を示しています。これらの観​​察結果は、適切に官能化されたナノファイバーは、バイオマーカー検出装置を開発するための約束を保持することを示唆している。

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Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

特にタンパク質と相互作用することができる官能基が飾られたナノファイバーを製造するための効率的なアプローチを説明する。アプローチは、最初に適切な官能基で官能化ポリマーの調製を必要とします。官能性ポリマーは、エレクトロスピニング法によるナノファイバーに加工される。タンパク質とナノファイバーの結合の有効性は、共焦点顕微鏡によって研究されています。

バイオ機能ナノファイバーを製造するための手順

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.5K ビュー.  Clark Atlanta University. 特にタンパク質と相互作用することができる官能基が飾られたナノファイバーを製造するための効率的なアプローチを説明する。アプローチは、最初に適切な官能基で官能化ポリマーの調製を必要とします。官能性ポリマーは、エレクトロスピニング法によるナノファイバーに加工される。タンパク質とナノファイバーの結合の有効性は、共焦点顕微鏡?...

ビデオ: Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

生物学

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

マウス腎移植の手順

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

瓜沙手続におけるヘムオキシゲナーゼ-1アップレギュレーションの生物発光イメージング

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

乳腺上皮移植の手順

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

植物抽出物からの分散粒子の除去のための凝集剤の効率を評価するための手順

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

手飼育によるマーモセットの生存と発達の促進

Hand-Rearing Method for Infant Marmosets

The common marmoset (Callithrix jacchus) is a small and highly social New World monkey with high reproduction rates, which has been proven to be a compelling non-human primate model for biomedical and neuroscience research. Some females give birth to triplets; however, the parents cannot raise all of them. To save these infants, we have developed a hand-rearing method for raising newborn marmosets. In this protocol, we describe the formula of the food, the time for feeding, the configuration of the temperature and humidity, as well as the adaptation of the hand-reared infants to the colony environment. This hand-rearing method significantly increases the survival rate of marmoset infants (without hand-rearing: 45%; with hand-rearing: 86%) and provides the opportunity to study the development of marmoset infants with similar genetic backgrounds raised in different postnatal environments. As the method is practical and easy to use, we anticipate that it could also be applied to other labs working with common marmosets.

著者スポットライト: マーモセット研究 - 範囲と課題 

Here, we describe a hand-rearing method for raising infant marmosets in an animal incubator. This method greatly increases the survival rate of marmoset infants, which provides the opportunity to study the development of marmoset infants with similar genetic backgrounds raised in different postnatal environments.