著者らは、買収が行われたモンペリエリオ映像法（MRI）のプラットフォームを承認したいと思います。これらはプロトコルのさまざまな部分で彼らの助けのためにイザベルクリスティーナ·ロペスメヒア、アレクサンドラメッツ、イリーナLassot、ソランジュDesagher、ファビアンLoust​​alotとヴィルジニーGeorgetに感謝します。この作品は、LAルシェルシュMédicale（FRM）（エキップFRM 2011-N°DEQ20111223745）を注ぐ財団によってサポートされていました。

このプロトコルのすべての動物の手続きは、1986年11月24日の欧州共同体理事会指令（86-609/EEC）のガイドラインに厳密に準拠している。食料と水を自由に摂取できるように、家群のマウス、。 12時間の明：暗サイクル（午前7:00に点灯し）、12時間で制御された環境（22±1℃、55±5％の湿度）でそれらを維持する。 1マウス初代細胞の培養：マウス胚線維芽細胞（MEFに） <ol><li>オートクレーブ細いピンセットだけでなく、湾曲したピンセットと解剖ハサミ。滅菌容器に保管してください。無菌D-PBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）を使用します。完全なMEFの培地を調製する：10％ウシ胎児血清（FBS）、1mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1％非必須アミノ酸、および0.5mM 2 - メルカプトエタノールを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ F12そして37℃の温</li><li>妊娠中のマウス（13.5日でポスト交尾（DPCを安楽死させる））頸椎脱臼により。 90％エタノールで消毒したマウスから子宮角を削除します。無菌で清潔なフードの下、37℃での胚とホーンを配置し、D-PBSをあらかじめ温めておい。ホーンを開き、場所 100ミリメートル滅菌プラスチックシャーレ中の胚は、臍帯材料からそれらをクリーンアップし、血液の過剰を取り除くために温かいD-PBSでそれらを洗ってください。両眼の下では、胚の手足、内臓を取り除き、 脳を含む頭部の上部。 </li><li>新しいシャーレに、ミンチ 無菌の手術と非常に小さな断片に胚 ブレード またはハサミ（少なくとも1分間）。異なる遺伝子型の胚の場合、個々のペトリ皿に各胚を入れて、ジェノタイピングのための尾または上位頭を維持するように注意してください。 </li><li> 1Xトリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、1mMのEDTA）で胚をカバーしています。 37℃のインキュベーター内で1時間に30分間インキュベートします。完全に10ミリリットルを追加トリプシン反応を停止するためのMEF培地。上下にピペットすべての凝集物を除去する。 10分間（完全培地で満たされた）を50mlチューブに細胞懸濁液を放置し、そして室温で300×gで5分間遠心し、上清を。完全培地（1胚のための6ミリリットル）でペレットを再懸濁します。生存可能な有核細胞を、トリパンを使用してカウントすることができる ブルー （約5×10 6細胞は、一胚から期待することができる）。プレート60ミリメートルペトリ皿当たり3ミリリットル。 </li><li>翌日培地を変更し、 細胞が成長することができます 料理がコンフルエントになるまで。多くの 細胞型は見ることができ、 しかし、唯一の線維芽細胞は、継代培養後も存続します。 </li><li>セルを分割し、それらをトランスフェクションのための50〜70％の集密度になるまで、ガラスボトム（時間経過の実験のために重要）で35mm皿で成長することができます。 マイコプラズマおよびマウスの病原体のためのテスト。 </li></ol> 2。文化Aニューロンの場合のdaptations <ol><li>文化前日、無菌で清潔なフードの下のコートポリ-L-リジンと35ミリメートルのガラスボトムペトリ皿（0.1 mg / mlと200μl）を、一晩のままにしておきます。 </li><li>次の朝、二回45分〜1時間に1回5分間のために、無菌純水ですすいでください。 2のDMEMミリリットル+10％FBS培地と交換し、37℃のインキュベーターに保つ。 </li><li> 18.5 DPCの胚を解剖。無菌で清潔なフードの下、100ミリメートルペトリ皿に冷滅菌HBSS（ハンクス液）中の胚でホーンを配置。新生仔はまた、ダムの寿命を維持し、特に入手が困難であることができるトランスジェニック動物の場合には、より多くの子孫を生成することを可能にするために代わりに胚のに使用することができる。個々のペトリ皿に、各胚や新生児を取り、はさみで首を切った。 、目に湾曲した鉗子を挿入することにより、ヘッドを保持する皮膚をカットし、丁寧に背面からソフト頭蓋骨を開くヘッドの目までは、頭の両側にある。視神経および脳幹をカット、脳を除去し、HBSSを含む新しいペトリ皿に入れて。ステレオスコープの下では、二つの薄い鉗子を使用して、すべての髄膜を除去します。海馬、皮質、または勉強する構造に応じて、脳の他の部分を分離する。 </li><li>冷HBSSの4.5ミリリットルで解剖脳の構造を浸し15ミリリットルのチューブに予め用意し、トリプシンで消化するまで氷上に保つ。 2.5％トリプシンの0.5ミリリットルを加え、20分、15分、37℃でインキュベートする。消化された脳の部分を破棄しないことは非常に注意しながら、HBSSでトリプシン3回すすいでください。 </li><li>があるまで1ミリリットルチップを搭載した1ミリリットルマイクロピペットで1ミリリットル（皮質）、DMEM +10％FBSおよびピペッティングし、数回上下に500μL（海馬）に再懸濁し、次に、1ミリリットルを加えた200μlのヒントを装備目に見える骨材ません。 </li><li>各35ミリメートルのガラスだぼっに細胞懸濁液100〜200μLを配布DMEM +10％FBSを含有するニューロンは、少なくとも3時間、37℃で付着させてm個の皿。予め加温したニューロン完全培地により交換し（Neurobasal培地を、250μMのL-グルタミンおよびNS21を補充Chen ら 19に記載のように調製）および神経成長を可能にするために、37℃で残す。 in vitroでの 5から14日後に神経細胞をトランスフェクション（DIV）（トランスフェクションの効率は、DIVのカップルの後に高いが、シナプスの接続が良く7-10 DIVから確立されています）。 </li></ol> EGFP-G3BP1コンストラクトの3。トランスフェクション 35ミリメートル皿あたり精製したプラスミドの3μgのを使用して、蛍光マーカー（など、GFP、YFP、）に融合した目的タンパク質のcDNA（のSGの任意のコンポーネント）を含むベクターで細胞をトランスフェクト。 <ol><li>製造業者のプロトコール（材料/試薬の表を参照）、以下、商業メソッドを使用するMEFをトランスフェクト。 </li><li>カルシウムと神経細胞をトランスフェクト夏らから適応リン酸カルシウム法20簡単に言うと： <ol><li>解決策を準備し、DMEM-ウォッシュ：25のKClを含むDMEM;トランスフェクション溶液：1X DMKY（HEPES 5mMの、MgCl 2を 10mMの、フェノールレッド）を含むDMEM洗浄;衝撃溶液：HEBS 1×、1×DMKY、DMSOおよび2％（v / v）で;そして37℃で保管してください</li><li>ニューロン、ろ液からメディアを取り出し、37℃で保管してトランスフェクション培地と交換し、リン酸カルシウムプラスミドDNAの沈殿物の調製時に37℃で保管した後、DMEM洗浄で洗浄する。 </li><li> 1.5ミリリットルの微量遠心管中で、（この順番で）ブラウン水（最終容量50μL）、 塩化カルシウム2.5 Mの5μL、およびプラスミドDNAの3μgのを追加します。すでに丸底ポリプロピレンチューブに導入されたHEBS 2X50μlの上に、このミックスをドロップします。ドロップと一緒に回転することにより、チューブを混ぜる。 30分間、室温で沈殿形態をしましょう​​。 </li><li> precipitatを追加Eニューロン上に滴下し、30から50分の間、37℃で去る。 </li><li> DMEM-洗浄ですすぎ、最後に予備調整培地を再導入して、1分間のショック溶液と交換してください。 37℃で細胞を維持する</li></ol></li></ol>のSGアセンブリおよびダイナミクスを含むG3BPの4。可視化<ol><li>フェノールレッドを含まない培地でフェノールレッドが含まれている細胞の培地を交換してください。 </li><li>買収のための蛍光を装備した共焦点顕微鏡を使用してください。顕微鏡システムをオンにします。水銀ランプ、コンピュータ、およびレーザーを。買収の開始前に37℃で少なくとも20分室内を暖める。 </li><li> G3BPの過剰発現のSGの種類の自然形成を誘導する。細胞は、このようにして、ストレス誘導なしのトランスフェクション後24時間のSGの右側のアセンブリについて観察することができる。代替的に、ストレスがさらに前記SGsの組立を誘導するように誘導することができる。 0.5 mMの亜ヒ酸ナトリウムとスターを追加右化合物（顆粒はよく1時間以内に形成される）の添加後に取得はt。 </li><li>浸対物レンズに油を追加します（40Xや63Xの目標を使用します）、ステージホルダーに安定化に適応35ミリメートル顕微鏡ホルダーに客観的な、上のシャーレをインストールしてください。料理は買収が変更されそうで平坦であることを確認してください。関連する蛍光団によると、蛍光灯の電源を入れ、トランスフェクションされた細胞を可視化する。目的の細胞を漂白し、細胞毒性を最小限にするために、フィールドに入ると蛍光をオフにします。 </li><li> 」を取得タブ」において、タグ·フルオロフォアの励起波長（EGFPタグ付きG3BPを使用しています我々のプロトコルでの488 nm）をに応じてレーザーを選択して、PMT（光電子増倍管）に適合し発光長を選択します。ノイズや過飽和ならびに毒性を最小限にするために、レーザパワー（通常は10％以上）を調整し、ゲインを設定し、信号対雑音比を変更するためのオフセット。レーザー博覧会（ライン平均2、フレーム平均1）の期間を最小限にするために（1,000 Hz）の高速スキャン。所望であれば、（1μmのZ工程は細胞に通常結構です）Zスタックのパラメータは3Dで画像を再構成することができるように設定してください。各収集間隔の時間を決定する：短い間隔は、より一貫したムービーを取得する許可が、これは（20秒の間隔を記載した実験に使用した）光退色および毒性を誘導することができる。総取得の持続時間は、応力の種類に応じて変えることができる。多くのG3BP含有SGSが亜ヒ酸治療では非常に急速に形成され、治療の1時間後によく見えるされています。その場合には、15の買収の合計時間で、右側のストレス後の買収を撮影し、開始するために、急速に細胞を選択 - いくつかのSGの組み立てを観察するの大部分は十分な20分。 </li><li>画像を保存し、ImageJソフトウェアを使用してスタックし、ムービーを再構築する。 </li></ol>

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	<li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+granules:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability.">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules.">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li><li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein.">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li><li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein:+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1.">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li><li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+G3BPs:+tissue+specific+expression,+chromosomal+localisation+and+rasGAP(120)+binding+studies.">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li><li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#945;+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress.">PKC&#945; 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E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult.">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li><li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly.">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase/ERK-Dependent+Mechanism.">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li><li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2&#945;+phosphorylation.">Large G3BP-induced granules trigger eIF2&#945; phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

プロトコルの懸念の中で最も重要なステップ慎重に細胞毒性をダウン下げるために監視されなければならないトランスフェクション、より詳細には、時間の経過合併。 初代細胞の培養物であれば無菌状態が維持され、注意が切開および細胞分離ステップ中の損傷を防止するためにとられているように、困難な部分ではない。 MEFを初期の継代で凍結保存することができる?...

ストレス顆粒（のSG）は、高温、酸化ストレス、低酸素症、浸透圧ショック、UV照射、グルコース欠乏、またはウイルス感染のような1環境ストレスに対する細胞防御応答として形成された非細胞質の膜状の病巣である。それらは、酸化的ストレスをトリガ亜砒酸ナトリウムのような化合物で処理することにより化学的に誘導することができる。 SGSは失速翻訳メッセンジャーリボ核タンパク質（mRNPs）を逮捕し蓄積する翻訳機構からmRNAを隔離する、2と錯体を形成し、そのアセンブリがeIF2αリン（真核生物開始因子α2）のリン酸化によって引き起こされることができます。 SGSはPボディーのようなポリソームや他の顆粒と部品を交換する動的な構造体である。彼らは、mRNAが安定な非ポリソームmRNPs 3への翻訳、再開始、劣化、またはパッケージのいずれかに分類され、処理される「トリアージセンター」を構成する。のSGの組み立てが速いbはUTより大きな顆粒に合体初期多数の小さな集合体との漸進的なプロセスである。微小管を破壊するか、安定化する化学的阻害剤の使用は、微小管ネットワークがアセンブリ、凝集および分解プロセスを含むSG動力学に必要とされることを示している。 のSGの動的アセンブリも二量体化することができ、TIA-1（T細胞内部抗原1）およびTIAR（TIA-1関連タンパク質）のような特定のRNA結合タンパク質（RNA-BP）の凝集によって促進される、SGSに4へソーム分解およびmRNAのルーティングを促進する。 G3BP（に、RasGAP SH3ドメイン結合タンパク質）は、細胞が亜ヒ酸や高温で強調しており、脱リン酸化G3BPの過剰発現がのSGアセンブリ5を誘導することができたときのSGに局在するようなRNA-BPである。 G3BPは最初に、RasGAP P（RAS-GTPアーゼ活性化タンパク質との相互作用により特徴づけられた進化的に保存されたRNA-BPである120 6）;しかし、この相互作用は、最近7を再訪した。 G3BPファミリは、2哺乳動物のメンバーは、G3BP1（G3BPと呼ばれる）とG3BP2 8が含まれています。両方のタンパク質は、細胞がストレス9に供されるのSGに共局在。正規のRNA認識モチーフ（RRM）を保存されたRNP1とRNP2モチーフにした：G3BPs N末端NTF2ドメインはプロリンリッチ（PXXP）のモチーフが続くそれらの局在やオリゴマー化に影響を与えることが示唆構成し、C末端モチーフは、RNA結合に関連付けられている、アルギニン - グリシンが豊富（RGG）のボックスが続く。興味深いことに、EGFPに融合した異なるドメインを構築することによって、タンパク質の様々な部分の分析はNTF2様ドメインおよびRNA結合ドメインは最も効率的に二量体化特性の重要性を示唆し、前記SGsに動員し、RNAが結合であることを示したのSGの組み立て。多様なモデルは、in vitro 10-13 に G3BPタンパク質の異なる機能を明らかにした。マウスにおけるG3BPの破壊は、発生、成長および生存14、並びに、空間ワーキングメモリ15に運動失調および欠陥を特徴と中枢神経系（CNS）におけるG3BPの重要な役割におけるこのタンパク質の重要性を示している。 G3BP欠乏は、SGの形成と神経変性疾患15の間の直接リンクを確立、変更された神経可塑性およびカルシウム恒常性につながる。それは、神経細胞のような初代細胞内のSGのダイナミクスを研究することができることが重要である。 このプロトコルは、亜ヒ酸の治療を受け、一次細胞でG3BP1含有のSGの組み立てを観察する簡単な方法を提供します。これは、応力の異なる種類、例えば、異なる条件下でのSGアセンブリを研究するために使用することができる。また、他のSGの顆粒または他の成分に適合させることができる。実際、このプロトコルは、G3BP1に焦点を当てていますが、TIA-1 / R、TTP（tristetraprolin）2のような他のストレス顆粒マーカーがありますFMRP（脆弱X精神遅滞症候群タンパク質）16、TDP-43（transactive応答DNA結合タンパク質43）17またはスタウフェン18。具体的には、TIA-1 / Rのようなタンパク質が過剰発現された場合、異なる形成のSG機能、調節および関連する転写産物が異なる場合であっても、アセンブリのSGを誘導することができるRNA結合タンパク質、核、G3BPのようである。のSGのこれらの重要な構成要素のいずれか、または核生成の発蛍光タグ付きバージョンのトランスフェクションは、画像の特定のSGアセンブリとダイナミクスに行うことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:312px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Trypsin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass bottom B-35</td>
			<td style="width:153px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">627860/627861</td>
			<td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HeBS</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">DU-110-A</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">P-110-BUF</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Small scissors</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">CM-85-BS</td>
			<td>Can be useful to remove hippocampi</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyplus transfection JetPEI reagent&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Ozyme</td>
			<td style="width:119px;">101-10</td>
			<td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:153px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

のSGは、特定のタンパク質成分またはポリA + mRNAの免疫染色により、細胞内で可視化することができる。 SGSは非常に動的であり、そのアセンブリと運命の研究では、ストレスに対する細胞の応答を理解することが重要です。 G3BP様のSGの重要な要素の欠乏は（に、RasGAP SH3ドメイン結合タンパク質）は、中枢神経系のマウス及び変更における発達障害につながる。生物、1缶培養一次細胞から細胞内のSGのダイナミクスを研究し、SGSにはトランスフェクトタグ付けされたコンポーネントのローカライズに従ってください。私たちは、マウス胚線維芽細胞におけるG3BP1含有のSG細胞（MEF）を観察するためにコマ撮り実験について説明します。この技術はまた、最近、これらのSGは、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症に形成されていることが示されたように非常に重要である、生きたニューロンにおけるG3BP含有のSGを研究するために使用することができる。このアプローチは、任意の他の細胞体及び顆粒タンパク質成分に適合し、かつ実施することができるトランスジェニック動物によると、これらの顆粒の具体的な因子の非存在下で、例えば顆粒動態のライブの研究を可能にする。

ストレス顆粒形成は、ストレス、アポトーシスの防止に関連し、クリアされるまで、停止した翻訳付き携帯適応を可能にする、ストレスに対する細胞の応答において重要である。このアッセイは、許可鍵のSGタンパク質成分（ 図1）の局在化に従うことによって、一次細胞でのSGを研究する。 G3BP、SGのアセンブリの主な要因は、培養されたMEFまたは神経細胞（ 図2AのA?...

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Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

ストレス顆粒（SGSは）失速リボ核タンパク質粒子（RNPは）、および様々なストレスに対する細胞応答において重要なを含む細胞質RNAの顆粒である。のSGのダイナミクスは、ストレス後のトランスフェクションした一次細胞内のSGのタグ付けされたコンポーネントの局在を可視化することにより、生細胞で追跡することができます。

ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K ビュー.  Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535. ストレス顆粒（SGSは）失速リボ核タンパク質粒子（RNPは）、および様々なストレスに対する細胞応答において重要なを含む細胞質RNAの顆粒である。のSGのダイナミクスは、ストレス後のトランスフェクションした一次細胞内のSGのタグ付けされたコンポーネントの局在を可視化することにより、生細胞で追跡することができます。 

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

ライブ固定化酵母細胞の可視化のための高速手法

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

生物学

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

筋芽細胞の分化と融合中にトラック核へライブ イメージングを利用しました。

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...