Los autores desean agradecer la plataforma Montpellier Rio Imaging (MRI) en la que se realizaron las adquisiciones. Agradecen a Isabel Cristina López Mejía, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot y Virginie Georget por su ayuda en diferentes partes del protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

Todos los procedimientos con animales en este protocolo son, en estricto apego a las directrices de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea de 24 de noviembre de 1986 (86-609/EEC). La casa de los ratones del grupo, permitiendo que los alimentos y el agua ad libitum. Mantener en un ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de humedad) con un 12 hr: 12 horas de luz: oscuridad ciclo (la luz a las 7:00 de la mañana). 1 Cultura de células murinas primarias:. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) <ol><li> Autoclave pinzas delgadas, así como pinzas curvas y tijeras de disección. Almacene en un recipiente estéril. Utilice estéril D-PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco). Preparar medio completo MEFs: medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FBS), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% de aminoácidos no esenciales, y 0,5 mM de 2-mercaptoetanol y caliente a 37 ° C. </li><li> La eutanasia a un ratón embarazadas (13,5 días post-coito (dpc)) Por dislocación cervical. Retire los cuernos uterinos del ratón desinfectado con un 90% de EtOH. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en 37 ° C precalentado D-PBS. Abra el cuernos, el lugar los embriones en un 100 mm placa Petri de plástico estéril, limpiarlos a partir del material del cordón umbilical y lavarlos con agua tibia D-PBS para eliminar el exceso de sangre. En virtud de un binocular, retire las extremidades del embrión, los órganos internos y la parte superior de la cabeza que contiene el cerebro. </li><li> En una nueva placa de Petri, picar el embriones en piezas muy pequeñas con una estéril quirúrgica cuchilla o tijeras (por lo menos durante 1 min). En el caso de los embriones de diferentes genotipos, tenga cuidado de poner cada embrión en platos individuales de Petri y mantener la cola o la cabeza superior para el genotipado. </li><li> Cubrir el embrión con 1x tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM). Incubar durante 30 min a 1 h en una incubadora a 37 °. Añadir 10 ml de completaMEFs medio para detener la reacción con tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar todos los agregados. Dejar reposar la suspensión de células en un tubo de 50 ml (llenado con medio completo) durante 10 min, y se centrifuga el sobrenadante durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en medio completo (6 ml para 1 embrión). Células nucleadas viables pueden contarse utilizando tripano azul (Alrededor de 5 x 10 6 células se puede esperar de un embrión). Placa 3 ml por 60 mm placa de Petri. </li><li> Cambie el medio al día siguiente y permiten que las células crezcan hasta que son confluentes los platos. Muchos tipos de células se pueden ver, pero sólo fibroblastos sobrevivirán subcultivo. </li><li> Dividir las células y les permiten crecer en placas de 35 mm con fondo de cristal (importante para el experimento lapso de tiempo), hasta el 50-70% de confluencia para la transfección. Prueba para Mycoplasma y patógenos del ratón. </li></ol> 2. Cultura Adaptations en el Caso de las neuronas <ol><li> El día anterior a la cultura, la capa 35 mm con fondo de cristal cajas de Petri con poli-L-lisina (200 l de 0,1 mg / ml) en una campana estéril y limpio, y dejar toda la noche. </li><li> En la mañana siguiente, enjuagar con agua pura estéril, dos veces por 5 min y una vez durante 45 minutos a 1 hora. Reemplace con 2 ml de DMEM más 10% de medio FBS y manténgalo en un incubador a 37 ° C. </li><li> Diseccionar embriones en el 18,5 dpc. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en frío HBSS estéril (solución salina equilibrada de Hank) en 100 mm de placa de Petri. Cachorros neonatales también se pueden utilizar en lugar de embriones con el fin de preservar la vida de la presa y le permiten producir más descendencia, especialmente en el caso de animales transgénicos que pueden ser difíciles de obtener. En platos individuales Petri, tome cada embrión o el recién nacido y cortar la cabeza con unas tijeras. Sostenga la cabeza mediante la inserción de pinzas curvas en los ojos, cortar la piel y con cuidado abra el cráneo blando de la parte posteriorde la cabeza hasta los ojos, a cada lado de la cabeza. Cortar los nervios ópticos y el tronco cerebral, retire el cerebro, y lo puso en una nueva placa de Petri que contiene HBSS. En virtud de un estereoscopio, quite todas las meninges utilizando dos pinzas finas. Separar el hipocampo, la corteza o cualquier otra parte del cerebro dependiendo de la estructura a estudiar. </li><li> Sumerja la estructura del cerebro disecado en 4,5 ml de HBSS frío preparado previamente en tubos de 15 ml y mantener en hielo hasta que la digestión con tripsina. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 15 min a 20 min. Enjuague el 3x tripsina con HBSS, siendo extremadamente cuidadoso para no descartar las partes del cerebro digeridos. </li><li> Resuspender en 500 l (hipocampos) hasta 1 ml (corteza) DMEM más 10% de SFB y pipetear hacia arriba y abajo varias veces con una micropipeta 1 ml equipado con una punta de 1 ml, a continuación, equipada con 1 ml en 200 l consejos, hasta que haya sin agregado visible. </li><li> Distribuir 100-200 l de suspensión celular a cada 35 mm de vidrio Bottom plato que contiene DMEM más 10% de SFB y dejar que las neuronas se adhieren a 37 ° C durante al menos 3 horas. Reemplazar por medio completo neurona precalentado (medio Neurobasal suplementado con 250 mM de L-glutamina y NS21, preparado como se describe en Chen et al. 19) y dejar a 37 ° C para permitir el crecimiento neuronal. Transfectar las neuronas en 5 a 14 días in vitro (div) (la eficiencia de transfección es mayor después de un par de conexiones sinápticas div pero son mejores estableció 7-10 div). </li></ol> 3. La transfección de los Constructos EGFP-G3BP1 Transfectar las células con un vector que contiene el ADNc de la proteína de interés (cualquier componente de SGS) fusionado a un marcador fluorescente (GFP, YFP, etc), utilizando 3 g de plásmido purificado por placa de 35 mm. <ol><li> Transfectar las MEFs utilizando un método comercial, siguiendo el protocolo del fabricante (Véase la Tabla de Materiales / Reactivos). </li><li> Transfectar las neuronas con un calciométodo del fosfato adaptado de Xia et al 20 Brevemente.: <ol><li> Preparar las soluciones: DMEM-wash: DMEM que contiene 25 mM KCl; solución de transfección: DMEM-lavado que contiene 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, rojo fenol); y la solución de choque: HeBS 1x, 1x DMKY, y DMSO al 2% (v / v); y mantenerlos a 37 ° C. </li><li> Retire el papel de las neuronas, filtrado, y la mantendrá a 37 ° C. Lavar con DMEM-wash luego vuelva a colocar con medio de transfección y mantenerse a 37 ° C durante la preparación de los precipitados de calcio en el ADN plásmido de fosfato. </li><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir (en este orden) de agua Braun (volumen final 50 l), 5 l de CaCl2 2,5 M, y 3 g de ADN plásmido. Deja esta mezcla en 50 l de HeBS 2x ya introducidos en un tubo de polipropileno de fondo redondo. Mezclar el tubo por rotación junto con la caída. Que la forma precipitado a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Añadir el precipitantee gota a gota sobre las neuronas y dejar a 37 ° C durante 30 a 50 min. </li><li> Reemplace con una solución de choque durante 1 minuto y luego enjuague con DMEM-lavado y finalmente reintroducir el medio preacondicionado. Mantener las células a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualización de G3BP Contiene Asamblea SG y Dinámica <ol><li> Sustituya el medio de las células que contiene rojo fenol por medio libre de rojo fenol. </li><li> Utilice un microscopio confocal equipado con fluorescencia para las adquisiciones. Encienda los sistemas de microscopios: lámpara de mercurio, el ordenador y los láseres. Calentar la cámara a 37 ° C al menos 20 min antes del comienzo de las adquisiciones. </li><li> La expresión más de G3BP induce la formación espontánea de un tipo de SGS. Las células pueden por lo tanto ser observadas para el montaje de SG de 24 horas después de la transfección sin inducción de estrés. Alternativamente, la tensión puede ser inducida para inducir aún más el montaje de SGS. Añadir arsenito de sodio 0,5 mM y la estrellat la adquisición justo después de la adición del compuesto (gránulos serán bien formadas dentro de 1 hora). </li><li> Añadir aceite al objetivo de inmersión (40X o 63X utilizar objetivos) e instale la placa de Petri sobre el objetivo en el soporte de microscopio adaptado 35 mm, estabilizado en el soporte de la platina. Compruebe que el plato es plana lo contrario las adquisiciones serán alterados. Encienda la luz de fluorescencia de acuerdo con el fluoróforo relevante y visualizar las células transfectadas. Apagar la fluorescencia una vez una célula de interés está en el campo con el fin de minimizar la decoloración y la citotoxicidad. </li><li> En el &quot;adquirir ficha&quot;, seleccione los láseres en función de la longitud de onda de excitación del fluoróforo tag (488 nm en el protocolo que utiliza G3BP etiquetados-EGFP) y seleccionar la longitud de emisión adaptado al PMT (tubo fotomultiplicador). Ajustar la potencia del láser (por lo general no más de 10%) para minimizar el ruido y la sobresaturación, así como la toxicidad, y establecer la ganancia y el desplazamiento para modificar la relación señal a ruido.Escaneado rápido (1000 Hz) con el fin de reducir al mínimo la duración de la exposición láser (línea media 2, promedio cuadro 1). Si lo desea, configure los parámetros de la pila de Z a ser capaz de reconstruir la imagen en 3D (un paso Z de 1 micra es generalmente muy bien con las células). Determinar el tiempo de intervalo entre cada adquisición: intervalos más pequeños permiten obtener una película más coherente pero esto puede inducir fotoblanqueo y la toxicidad (un intervalo de 20 seg se usó en los experimentos descritos). Duración de adquisición total puede variar dependiendo del tipo de estrés. Muchos SGS contiene G3BP-se forman muy rápidamente bajo tratamiento arsenito y son bien visibles después de 1 hora de tratamiento: en ese caso, elegir rápidamente las células para filmar y comenzar las adquisiciones justo después del estrés, con una duración total de las adquisiciones de 15 - 20 min más que suficiente para observar el montaje de varias Comisiones de Estudio. </li><li> Guardar las imágenes y la reconstrucción de las pilas y la película utilizando el software ImageJ. </li></ol>

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	<li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. 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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los pasos más importantes en el Protocolo se refieren a la transfección y más particularmente las adquisiciones de lapso de tiempo, que tienen que ser cuidadosamente monitoreados para bajar abajo de la citotoxicidad. Cultivo de células primarias no es una parte difícil, siempre y cuando se mantengan las condiciones estériles y la precaución se toma con el fin de evitar daños durante las etapas de disección y disociación celular. MEFs se puede mantener congelado a principios de los ...

Gránulos de estrés (SGS) son focos citoplásmica no membranosa formada como una respuesta protectora celular al estrés ambiental, tal como temperatura elevada, el estrés oxidativo, la hipoxia, choque osmótico, la irradiación UV, la privación de glucosa, o infección viral 1. Ellos pueden ser inducidas químicamente por tratamiento con compuestos como el arsenito de sodio, lo que provoca el estrés oxidativo. SG acumulan estancado traducción detenido ribonucleoproteína mensajero (mRNPs) Complejos de 2, el secuestro de ARNm a partir de la maquinaria de traducción, y su montaje puede ser desencadenada por la fosforilación de eIF2α (factor de iniciación eucariota 2 α). SG son estructuras dinámicas que intercambian los componentes con los polisomas y otros gránulos como los P-cuerpos. Constituyen un &quot;centro de triage&quot;, donde los ARNm se clasifican y procesan, ya sea para la traducción, el reinicio, la degradación o el paquete en mRNPs no polysomal estables 3. El conjunto de SGS es rápido but es un proceso gradual con numerosos pequeños agregados iniciales, que se unen en gránulos más grandes. El uso de inhibidores químicos que interrumpen o estabilizar los microtúbulos muestra que se requiere la red de microtúbulos para la dinámica de SG incluyendo los procesos de montaje, coalescencia y desmontaje. El ensamblado dinámico de SGS también es promovida por la agregación de proteínas de unión de ARN-específicos (ARN-BP) como TIA-1 (de células T antígeno interna-1) y TIAR (proteína relacionada con el TIA-1), que son capaces de dimerizar y promover polysome desmontaje y el encaminamiento de los ARNm en SGS 4. G3BP (proteína de unión a dominio SH3 de RasGAP) es una ARN-BP tales que localiza a SGS cuando las células están estresados ​​con arsenito o alta temperatura, y la sobreexpresión de G3BP desfosforilado pueden inducir conjunto de SG 5. G3BP es un conservadas evolutivamente ARN-BP que se caracterizó inicialmente a través de su interacción con una proteína activadora de GTPasa Ras-(p RasGAP120 6); pero esta interacción ha sido recientemente revisada 7. La familia G3BP incluye dos miembros en los mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) y G3BP2 8. Ambas proteínas colocalize en SG, cuando las células son sometidas a estrés 9. G3BPs comprenden un dominio N-terminal NTF2 sugerido para influir en su localización y oligomerización, seguido de prolina ricos (PxxP) los motivos, a continuación, los motivos C-terminales asociados con RNA vinculante: la canónica ARN-Reconocimiento Motif (RRM) con RNP1 y RNP2 motivos conservados , seguido de una rica cuadro de arginina-glicina (RGG). Curiosamente, el análisis de diferentes partes de la proteína mediante la construcción de diferentes dominios fusionados a EGFP mostró que el dominio NTF2-y el dominio de unión al ARN fueron la reclutó más eficiente a SGS, lo que sugiere la importancia de las propiedades de la dimerización y de unión al ARN en la asamblea de SGS. Diversos modelos han revelado diferentes funciones de las proteínas G3BP in vitro 10-13.La interrupción de la G3BP en ratones han demostrado la importancia de esta proteína en el desarrollo del crecimiento y la supervivencia 14, así como un papel importante para G3BP en el Sistema Nervioso Central (SNC), caracterizado por ataxia y defectos en memoria de trabajo espacial 15. Deficiencia G3BP conduce a la alteración neuronal plasticidad y calcio homeostasis, estableciendo un vínculo directo entre la formación de SG y enfermedades neurodegenerativas 15. Es por lo tanto importante ser capaz de estudiar la dinámica de SG en células primarias como las neuronas. Este protocolo proporciona una manera simple de observar el conjunto de contener G3BP1-SG en células primarias bajo tratamiento arsenito. Se puede utilizar para estudiar el montaje SG bajo diferentes condiciones, por ejemplo, diferentes tipos de tensiones. También se puede adaptar a otros gránulos u otros constituyentes de SGS. De hecho, este protocolo se centra en G3BP1, pero hay otros marcadores de gránulos de estrés como TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (proteína X Frágil Retraso Mental Síndrome) 16, (proteína de unión a DNA respuesta transactivo 43) TDP-43 17 o Staufen 18. En particular, las proteínas como TIA-1 / R son, como G3BP, nucleación proteínas de unión de ARN que pueden inducir conjunto de SG cuando se sobreexpresa, incluso si los diferentes SG formados pueden diferir en función, regulación y transcripciones asociadas. La transfección de versión fluoróforo de etiquetado de cualquiera de estos componentes clave o nucleadores de SGS se puede realizar para la imagen de montaje y la dinámica particular, SGS.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Prewarm at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)</td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Very thin, tips 0.1 mm</td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Can be useful to remove hippocampi</td></tr><tr><td>Polyplus transfection JetPEI reagent&amp;nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td></tr><tr><td>Inverted laser scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

SGS puede ser visualizado en las células mediante inmunotinción de los componentes específicos de la proteína o ARNm poliA +. SG son muy dinámicos y el estudio de su montaje y el destino es importante entender la respuesta celular al estrés. La deficiencia en los factores clave de la SG como G3BP (RasGAP dominio SH3 unión a proteínas) da lugar a defectos en el desarrollo en ratones y alteraciones del sistema nervioso central. Para el estudio de la dinámica de la SG en las células de un organismo, uno puede células primarias de cultivo y seguir la localización de un componente etiquetado transfectadas de SGS. Se describe el experimento de lapso de tiempo para observar SGS contiene G3BP1 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Esta técnica también se puede utilizar para estudiar SG que contiene G3BP en las neuronas en vivo, que es crucial, ya que ha demostrado recientemente que estas SG se forman en la aparición de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Este enfoque puede ser adaptado a cualquier otro cuerpo celular y proteína de los gránulos de componentes, y lleva a cabocon animales transgénicos, lo que permite el estudio directo de la dinámica de gránulos, por ejemplo, en la ausencia de un factor específico de estos gránulos.

La formación de estrés gránulo es importante en la respuesta de las células al estrés, lo que permite una adaptación celular con traducción estancado, hasta que la tensión ha despejado, asociado a la prevención de la apoptosis. Permisos de este ensayo para estudiar los SG en células primarias, siguiendo la localización de los componentes clave de proteínas SGs (Figura 1). G3BP, un factor clave de reunión SG, está presente en lugar de modo difuso en el citoplasma de neuronas o MEFs ...

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Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.2K vistas.  Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535.  Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés. 

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Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Biología del Desarrollo

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Inmunología e Infección

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Bioingeniería

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biología

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imágenes de células vivas de la actividad transcripcional en roturas de doble cadena de ADN

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Detección de focos de ADN monocatenario en fase G1 mediante tinción inmunofluorescente RPA2

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair necessitates collaboration between numerous proteins, responsible for covering a broad range of tasks from recognizing and signaling the presence of a DNA lesion to physically repairing it. During this process, tracks of single-stranded DNA (ssDNA) are often created, which are eventually filled by DNA polymerases. The nature of these ssDNA tracks (in terms of both length and number), along with the polymerase recruited to fill these gaps, are repair pathway-specific. The visualization of these ssDNA tracks can help us understand the complicated dynamics of DNA repair mechanisms.
This protocol provides a detailed method for the preparation of G1 synchronized cells to measure ssDNA foci formation upon genotoxic stress. Using an easy-to-utilize immunofluorescence approach, we visualize ssDNA by staining for RPA2, a component of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA). RPA2 binds to and stabilizes ssDNA intermediates that arise upon genotoxic stress or replication to control DNA repair and DNA damage checkpoint activation. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining is used to visualize DNA replication to exclude any S phase cells. This protocol provides an alternative approach to the conventional, non-denaturing 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-based assays and is better suited for the detection of ssDNA foci outside the S phase.

Autor destacado: Visualización del ADN monocatenario durante la reparación del ADN para obtener información terapéutica 

The following protocol presents the detection of single-stranded DNA foci in the G1 phase of the cell cycle utilizing cell cycle synchronization followed by RPA2 immunofluorescent staining.

Visualización de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...