この技術は、最も一般的に使用されているランゲンドルフ装置技術と比較して、より信頼性が高く効率的であり、広範な練習やトレーニングを必要としません。この技術の主な利点は、最初の灌流がインビボで起こるので虚血時間を制限することである。この技術を実行している間、マニホールド内の気泡を避け、消化中の心臓の過度の動きを避けることが不可欠であり、これらは収率を低下させる可能性があります。
このテクニックを実演するのは、マーク・ジオロ博士の研究室の大学院生であるサラ・スターギルです。まず、新たに調製した灌流バッファーを使用して温度制御されたマニホールドをクリアします。これを行うには、27ゲージの針をねじ込み、ルアーロックコネクタを使用して気泡を取り除きます。
気泡が残っていないことを確認します。心筋細胞を単離するには、完全に麻酔をかけたマウスの胸骨を露出させ、正中線の外側を肋骨と腋窩まで近位に切断します。次に、横隔膜を切り取り、心臓を避けるために浅い切り傷を確保します。
胸骨を止血剤で固定し、肋骨を後方に折りたたんで胸腔を露出させます。心臓のすぐ遠位にある下大静脈を切断する前に、心臓から心膜を静かに取り除きます。27ゲージの針を使用して、3ミリリットルの氷冷クリアリングバッファーを1分間にわたって心臓の右心室に注入します。
次に、ピンセットを使用して心臓を保持します。それを体から引き離し、できるだけ多くの大動脈を露出させます。次に、止血剤を使用して上行大動脈をクランプし、心臓を切除します。
クランプされた心臓を、10ミリリットルの温かい灌流バッファーを含むポリプロピレンペトリ皿の蓋にすばやく移します。クランプされた心臓を支持プラットフォームに置き、マニホールドに取り付けられた安定した27ゲージの針を使用して、摂氏37度で10ミリリットルの温度制御灌流バッファーを左心室に5分間注入します。次に、クランプされた心臓と支持プラットフォームを約5ミリリットルの消化バッファーを含むペトリ皿に移します。
入力シリンジを、25ミリリットルの消化バッファーを含む50ミリリットルのシリンジと交換します。注入する前に、マニホールドから気泡と残りの灌流バッファーを取り除きます。針を左心室頂点の同じ針位置に慎重に交換します。
灌流ポンプの助けを借りて、50ミリリットルの注射器を使用して15分間、摂氏37度の消化バッファーを左心室に注入します。摂氏37度の溶液を排出するように校正されたウォータージャケットを使用して、溶液の温度を制御します。心房から心室を取り除き、10ミリリットルのビーカーに移します。
ビーカーに3ミリリットルの消化バッファーを加え、鋭いハサミを使用して心室を大きな塊に切ります。ビーカーをアルミホイルで覆い、摂氏37度に予熱した振とう水浴に5分間入れます。上清を廃棄した後、組織チャンクを3ミリリットルの消化バッファーに再懸濁し、約4分間、または均質な混合物が得られるまで粉砕します。
完了したら、70マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを使用して、セルを50ミリリットルのポリプロピレンチューブにろ過します。ナイロンセルストレーナーを3ミリリットルの消化バッファーで洗浄します。ろ液を14ミリリットルの丸底ポリプロピレンチューブに戻し、遠心分離します。
ペレットを3ミリリットルのストップバッファーに再懸濁する前に、上清を廃棄してください。細胞懸濁液に、54マイクロリットルの100ミリモル塩化カルシウムストックを加えて、最終的な塩化カルシウム濃度を1.8ミリモルにします。生細胞を10分間沈降させ、死細胞を含む上清を除去する。
ペレットを保存溶液に再懸濁した後、細胞は機能実験および培養に使用することができる。単離された細胞の明視野顕微鏡画像は、マウス心筋細胞の単離が、膜のブレブまたは丸みを帯びたエッジのない棒状の静止細胞を生成することを示しました。細胞は約80%の収量と高い生存率を示し、単離技術の成功を決定しました。
分離を成功させるには、マニホールドから気泡を取り除き、心臓の同じ穴に針を挿入することが最も重要です。単離されると、心筋細胞は細胞および分子機能実験に使用できます。
