YLにNIHの助成金（R43/44CA122444）とDOD BRCP助成金（W81XWH-06-1から0682）によって部分的にサポート。

1。サンプル、機器、試薬の調製<ol><li>室温（25℃）で16から32時間、新鮮な10％​​中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込んで、厚さが3〜4程度のブロックに組織標本をカット。 FFPEブロックから5±1μmの厚さのセクションにFFPEをカットし、スライドや空気乾燥に関するセクションをマウントします。注：スライドは最大3ヶ月間乾燥下、室温で保存することができる。マウント組織スライドの前RNAscopeアッセイを1時間にわたって60℃で乾燥した状態でベーキング処理をお願いします。 </li><li> 40℃へのハイブリダイゼーションオーブンをもたらす湿度制御トレイに加湿紙を置きます。それを完全に濡らすために加湿紙に50ミリリットルのdH 2 Oを追加します。使用前に少なくとも30分間予熱し、オーブンに覆われたトレイを挿入します。 </li><li>のdH 2 Oに10倍の前処理溶液を希釈して700ミリリットル1X前処理2溶液（10 NL、pHが6クエン酸緩衝液）を作る沸騰し1X前処理2ソリューションを加熱し、舞過沸騰防止しながら100-104℃の間の温度ntain。 </li><li>のdH 2 Oに予め温め50X洗浄バッファーを希釈することにより、3 L 1X洗浄バッファー（0.1×SSC）を作る</li><li>ヒュームフードの下で脱パラフィンキシレンの2×200ミリリットル、100％エタノールで2回200ミリリットルを用意します。 </li><li>ヒュームフードの下でポスト染色に50％ヘマトキシリン​​染色液とブルーイング試薬（0.01％アンモニア水）を準備します。 </li><li>ヒュームフードの下に脱水キシレン200ミリリットル、200ミリリットルの70％、および2×200ミリリットル100％エタノールを準備します。 </li><li> 10分間40℃で予熱し標的プローブおよびRTU Amp1と、Amp2の、増幅器（Error Amp3）、AMP4、アンプ5 - ブラウン、およびAMP6ブラウンを含め、室温にRTU検出キットの試薬をもたらす、DAB発色ブラウン-Aとブラウン-Bを除く。 </li></ol> 2。 RNAscopeアッセイ脱パラフィンおよび脱水焼成後、頻繁に攪拌しながら、2×5分間、キシレン中で組織切片を脱パラフィンし、脱水頻繁に撹拌しながら、2×3分間の100％EtOH中。空気が5分間乾燥し、疎水性バリアペンで組織切片の周囲に疎水性のバリアを描く。 前処理<ol><li>のdH 2 Oにすすぎ、内因性ペルオキシダーゼ活性のクエンチングをRTで10分間前処理1で組織切片をインキュベート</li><li>をdH 2 Oで二回すすぎ、RNA検索のための15分間沸騰温度に維持前処理2で組織切片をインキュベート</li><li> HybEZオーブン内タンパク質消化のために40°Cで30分間前処理3で組織切片をインキュベートし、をdH 2 Oで二回すすぎ</li></ol>ターゲットプローブハイブリダイゼーション標的プローブのHPV-HR 7プールが含まれます：HPV16、18、31、33、35、52、および58を。 3隣接組織切片上に別途のHPVプローブ、ユビキチンC（UBC）と細菌の遺伝子のdapBプローブを追加します。 2オーブンで40℃でハイブリダイズHRは、次いで室温で2×2分間1X洗浄緩衝液中ですすいでください。 シグナル増幅<ol><li> 15分間、40°C、40°Cで30分間増幅器（Error Amp3）（アンプ）、及びAMP4（標識プローブ）で15分間、40°C、Amp2の （バックグラウンド低減）で30分間Amp1と （前置増幅器）を用いて組織切片をインキュベートHybEZオーブンで40℃で。各ハイブリダイゼーション工程の後、RTで2×2分間、1×洗浄緩衝液でリンスする。 </li><li> RTで15分間、30分間、AMP5およびAMP6で組織切片をインキュベートする。各インキュベーション工程の後、RTで2×2分間、1×洗浄緩衝液でリンスする。 </li></ol>信号検出 RTで10分間ブラウン-Aとブラウン-Bの等量混合DAB 1:1混合物で組織切片をインキュベートし、をdH 2 Oで二回すすぎ対比染色<p組織は紫のままスライドが明確になるまで、クラス= &quot;jove_content&quot;&gt;室温で2分間50％ヘマトキシリン溶液で染色組織切片は、D.H. 2 Oですすいでください。ディップは5倍ののdH 2 O中0.01％のアンモニアにスライドとDH 2 O中5ディップで追跡スライド取り付け 2分毎に70％、100％、および100％EtOH中で組織切片を脱水し、キシレンで5分間、キシレン系封入剤でマウントする。

<ol>
	<li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002.">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li><li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States.">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen.">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity.">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li><li>Yan, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+situ+measurement+of+estrogen+receptor+mRNA+predicts+response+to+tamoxifen.">Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen.</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantitative+RNA+in+situ+hybridization+for+resolution+of+equivocal+and+heterogeneous+ERBB2+(HER2)+status+in+invasive+breast+carcinoma.">Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma.</a> J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).</li><li>Tubbs, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders.">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li><li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-risk+human+papillomavirus+E6/E7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal/hypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization.">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma:+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status.">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization+method.">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Schache AG, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li><li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck:+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus.">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li><li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials.">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer+(unabridged+version).">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version).</a> Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).</li></ol>

すべての著者は、アドバンスト·セル診断社の株式でかつ独自の採用されている

RNAscope HPVアッセイは、HPV関連頭頸部扁平上皮癌においてその場で E6/E7 mRNAの直接可視化を可能にした。 RNAscopeアッセイは、日常的に固定された腫瘍組織との完全な互換性があり、病理組織学的な相関（ 図2）のための組織形態を維持します。 CISH従来の方法に比べてRNAscopeアッセイの重要な利点は、それが特異的に背景雑音（ 図2Cおよび2F）を増幅することなくハイブリダイゼーションシグナル（ 図2Bおよび2E）を増幅することである。 実際には、RNAscope HPVアッセイ手順は、8時間以内に完了することができ、または好都合に2日間にわたって分割されている。 RNAscope HPVアッセイは参照方法16として定量RT-PCRを用いて、97％の感度および93％の特異性を示し、頭頸部扁平上皮癌におけるHPV 12-16状態を決定するために使用されている。従来のCHRHR-HPVのDNAのためomogenic ISHは非常に特異的であるが、約80〜12％の感度を持っています。携帯代理マーカーのP16のための免疫組織化学（IHC）染色は、優れた感度を示していますが、特にnonoropharyngeal頭頸部癌15における偽陽性の結果15,18を生成することができる。 HPV E6/E7 mRNA検出のための定量RT-PCRの現在の「ゴールドスタンダード」メソッドは、研究室にその使用を制限し、最適な結果を得るために、新鮮な凍結組織が必要であり、技術的に複雑である。また、それは不可能で組織病理HR-HPV E6/E7のmRNA発現を相関させることができるRNA抽出を必要とする。 RNAscopeアッセイの成功のためのいくつかの重要な要因があります。まず、最良の結果を得るために、組織は、ASCO / CAPガイドライン19に従って16から32時間室温で新鮮な10％中性緩衝ホルマリンで固定してください。それは有効なので、二番目、HybEZオーブンを強くお勧めしますプローブハイブリダイゼーションおよびシグナル増幅工程のための温度および湿度の最適制御。第三に、各工程の前に過剰の残留緩衝剤を除去し、それでも、これらのステップのいずれかの間に、乾燥から組織切片を維持することが重要である。 ここで説明する手動RNAscope手順が完全に商業スライド自動染色システム10に自動化されている。これは大幅にアッセイ条件の標準化を促進し、臨床病理検査室での貴重な肉体労働を節約する必要があります。また、専用の画像解析ソフトウェアは、自動的に主観性を排除し、得点に再現性を向上させるために役立つはずデジタルスライド上の細胞と染色シグナルを同定するために10に開発された。 要約すると、RNAscope HPVアッセイは、FFPE組織におけるその場での HR-HPV E6/E7のmRNA転写物の存在を検出する。それは、臨床病理学実験室によく知られているワークフローを持って組織切片において、これらの直接可視化を可能にすることによって保守党。それは、（FFPE）組織サンプルを検査するための理想的なプラットフォームを提供しており、簡単に診断病理学研究室で採用することができる。

高リスクヒトパピローマウイルス（HR-HPV）感染アカウントのすべての癌の約5％のための世界的な1。 HPV関連口腔咽頭癌の発生率は、特に男性の間で、過去数十年の間に増加している。 HPV陽性中咽頭扁平上皮癌（OPSCC）おそらく今後20年間2年に米国のすべての頭頸部癌の大部分を構成する。 HPVに起因する口腔咽頭扁平上皮がんは、良好な生存と関連し、腫瘍のHPVの状態は、生存のための3強力かつ独立した予後因子であり、されています。 ウイルス性癌遺伝子E6およびE7の転写活性化のための証拠は、臨床的に関連するHPVの4の存在のためのゴールドスタンダードとみなされている。しかしながら、RT-PCR法による新鮮な腫瘍組織からのE6/E7のmRNAの検出は、日常的な臨床実践において実用的ではなく、研究室に限定されている。最近では、HAVeは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本の単一のRNA分子感度（FFPE）5-10個々の細胞におけるマルチプレックス検出を可能にRNAscopeと呼ばれる新規RNA ISH技術を開発した。我々は、単一分子検出5の証拠の3行を提供した。まず、RNAscopeプローブの設計およびシグナル増幅システムは、HeLaおよびSK-BR-3細胞株における単一コピーHER2ゲノムDNA標的の検出を可能にした。 HER2ゲノムDNAシグナルと比較して第二の、HeLa細胞におけるHER2 mRNAシグナルドットの蛍光強度の分布は、ドット毎に1つの分子と一致した。第三に、細胞当たりのHER2 mRNAシグナルドットの数は、さらに、単一分子検出をサポートする、密接に溶液ベースの定量アッセイによって推定されたHER2 mRNAのコピー数と一致した。さらに、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡またはヘマトキシリン​​とDAPIで核の対比はWH、個々の核の可視化を可能にする今度はICHは、単一セル単位10上にRNA標的の検出及び定量を可能にする。日常の臨床検体で、その場での遺伝子発現を分析する能力は、特にFFPE組織切片をベースとするアッセイ10,11、RNAscope診断病理学のための有望なプラットフォームになります。我々は、遺伝子型特異的プローブのプールを使用して7高リスクHPV遺伝子型（HPV16、18、31、33、35、52、および58）のE6/E7のmRNAを検出するためのRNAscopeベースのHPVアッセイを開発した。 OPSCC我々の最近の研究は、RNAscope HPVアッセイはFFPE組織12-17にHPVの状態を決定するのに高感度かつ特異的であり、また、OPSCC 12,16の予後に通知することが示されている。 RNAscope技術の原理は、以前5に記載されている。ここでは、完全なRNAscopeアッセイプロトコルを記述し、FFPE腫瘍組織切片におけるHR-HPVの検出におけるその使用を実証する。

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:145px;">SuperFrost Plus slides</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-550-15</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">HybEZ Oven, Tray, and Rack</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310011, 310012, 310014</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310035</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:145px;">RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">312351</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:145px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:145px;">Vector Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">H-4000</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">100% EtOH</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">ALREAGAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Xylene&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">X3P-1GAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">HXGHE1LT</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Ammonia hydroxide</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">320145-500mL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Cover Glass 24x50 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-545-F</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Hot Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">11-300-49SHP</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Drying Oven</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 60 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Water Bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 40 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnascope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma

発癌性HPV検出のための「ゴールドスタンダード」は、腫瘍組織における転写的に活性な高リスクHPVのデモンストレーションです。しかしながら、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）によってE6/E7 mRNAの検出は、形態学的相関のための重要な腫瘍組織コンテキストを破棄し、日常的な臨床実践において採用することが困難であったRNA抽出を必要とする。 in situハイブリダイゼーション技術、RNAscope我々 の最近開発されたRNA、任意のRNAバイオマーカーのin situ分析の高感度かつ特異可能にする、単一分子感度および単細胞解像度のホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織でのRNAの直接可視化を可能にする日常の臨床検体中。 RNAscope HPVアッセイは、遺伝子型特異的プローブのプールを用いてE6/E7 7高リスクHPV遺伝子型のmRNA（HPV16、18、31、33、35、52、および58）を検出するように設計された。それは、優れた感度を示したおよび定量RT-PCRによりE6/E7 mRNAを検出する現在の「ゴールドスタンダード」法に対する特異。 RNAscopeによって決定HPVの状態は、中咽頭癌患者の臨床転帰の強力な予後である。

RNAscope HPVアッセイワークフロー RNAscopeアッセイは、IHC（ 図1）に類似する高度に合理化されたワークフローを有する。前処理、ハイブリダイゼーション、シグナル増幅、検出：これは、4つの主要なステップで構成されています。これは、高忠実度の信号増幅5を確実にユニークプローブ設計戦略を採用している。 RNAscope HPVアッセイにおいて、七HR-HPVプローブセットは、すべての西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に連結された同一の信号増幅系によって認識され、プールされる。 HRPにより形成された褐色の析出物が、標準の明視野顕微鏡によって可視化することができる基質としてDABを用いた発色反応を触媒される特異的なハイブリダイゼーションシグナルが検出される。 HPV検出のための代表的な染色 図2は、頭頸部扁平上皮癌の染色されたFFPE切片からの画像例を示す図である。 HPV陽性の場合（ 図UREの2A）、HR-HPVプローブは、腫瘍細胞に特異的に強い点状の信号を検出した。 UBCプローブは、腫瘍細胞および間質細胞（ 図2B）の両方で多数の点状細胞質シグナルを検出した。細菌遺伝子のdapBプローブは、きれいな背景（ 図2C）を示した。強い信号がUBCプローブ（ 図2E）を用いて検出したのに対し、HPV陰性の場合、HR-HPVプローブとのdapBプローブの両方は、全く信号（ 図2Dおよび2F）を検出していない。このアッセイでは、UBCは、バックグラウンド信号のための陰性対照として、組織RNAの品質とのdapBを評価するための陽性対照として役立つ。 HPVの状態を決定するためのスコアリングは、各ケースのすべての3つのスライドを検査することを含む。陰性コントロールスライド（ジピコリン酸）スライド上の染色レベルがカットオフとして使用されます。、HPV陽性が点状細胞質および/またはdabpBスライド上の信号を超えていた核染色の存在によって定義されます。 <pキープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt;：FOクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> 図1。 RNAscopeアッセイのフローチャート。RNAscopeアッセイワークフローのイラスト。 RNAscopeアッセイは、4つの主要なステップ、前処理、標的プローブハイブリダイゼーション、信号増幅や信号の検出が含まれています。全体アッセイ手順は、8時間で完了することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> 図2。 RNAscope染色スライドの画像例。HR-HPV、UBC（陽性対照）とのdapBためのプローブで染色されたFFPE切片（陰性対照）2患者147名から。 交流 。 HPV陽性の場合。腫瘍細胞において、HR-HPV E6/E7のmRNA発現。挿入図、点状の信号を示す40X倍率。B及びC）は、正のUBC染色（B）及びジピコリン酸（C）に対して陰性を示し、隣接する組織セクション。DF）HPV陰性の場合をD）HPV E6/E7 mRNAについて染色なし、ジピコリン酸ネガティブコントロール（F）E）UBC陽性染色に似ています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a>

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RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

頭頸部腫瘍組織において高リスクHPVの存在は、良好な転帰と関連している。 RNAscopeと呼ばれるin situハイブリダイゼーション法における最近開発されたRNAは、FFPE組織切片におけるHPV E6/E7 mRNAの直接可視化を可能にします。

用RNAscope<em&gt;その場で</em&gt;ヘッドの転写的に活性なヒトパピローマウイルスの検出および頸部扁平上皮癌

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

rnascope-for-situ-detection-transcriptionally-active-human

Research

JoVE Journal

Medicine

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

27.0K ビュー.  Advanced Cell Diagnostics, Inc.. 頭頸部腫瘍組織において高リスクHPVの存在は、良好な転帰と関連している。 RNAscopeと呼ばれるin situハイブリダイゼーション法における最近開発されたRNAは、FFPE組織切片におけるHPV E6/E7 mRNAの直接可視化を可能にします。 

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

医学

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

人間の前庭神経鞘腫の初代培養

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

ザ・<em&gt;卵内</em肝細胞癌の効率的な異種移植モデルとして&gt;ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイ

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

新生児マウス内耳遺伝子デリバリーの後半規管アプローチ

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

生体内でMenière の病気耳と健聴耳の磁気共鳴イメージ投射を使用して人間の脳神経の形態計測的解析

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes have been available for years in many surgical fields. We used the female (because they are easy to handle for the procedure) Yorkshire pigs for the head and neck reconstruction by harvesting the deep inferior epigastric artery perforator or the superior epigastric artery perforator flap. The anastomosis site (neck skin defect or tracheal wall defect) was prepared via the dissection of the common carotid artery and the internal jugular vein, in which 3.5&#215; loupe magnification was used for anastomosis as we use on human cases in real life. This procedure demonstrates a new training method using a reliable learning model and provides a detailed anatomy in a live scenario. We focused on the ischemia time, harvesting, vessel anastomosis, and designing the flap to fit the defect site. This model improves tissue handling and with the use of proper instruments can be repeated many times so that the surgeon is fully confident before starting the surgery on humans.

Here we present a protocol for the use of the pig superior epigastric artery perforator flap as a learning module for head and neck microvascular reconstruction.

頭頸部血管再建のトレーニング ・ モジュールとしてブタ

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous cell carcinoma and other cancers. Mechanistic studies have shown that the molecular crosstalk between nerves and tumor cells occurs prior to physical interaction. There are only a few in vivo models to study perineural invasion, especially to investigate early progression, before physical nerve-tumor interactions occur. The chick chorioallantoic membrane model has been used to study cancer invasion, because the basement membrane of the chorionic epithelium mimics that of human epithelial tissue. Here we repurposed the chick chorioallantoic membrane model to investigate perineural invasion, grafting rat dorsal root ganglia and human head and neck squamous cell carcinoma cells onto the chorionic epithelium. We have demonstrated how this model can be useful to evaluate the ability of cancer cells to invade neural tissue in vivo.&#160;

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is an aggressive phenotype for head and neck squamous cell carcinomas and other tumors. The chick chorioallantoic membrane model has been used for studying angiogenesis, cancer invasion, and metastasis. Here we demonstrate how this model can be utilized to assess perineural invasion in vivo.

頭頸部癌のペリオラル侵食を評価する生体内モデルにおけるひよこチョリオアラントIC膜

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Learning Modern Laryngeal Surgery in a Dissection Laboratory

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is almost completely reserved to a few referral centers that deal with a large proportion of this pathology. Practice on human specimens is not always possible for ethical, economic, or availability reasons. The aim of this study is to provide a reproducible method for the organization of a laryngeal laboratory on ex vivo animal models where it is possible to approach, learn, and refine laryngeal techniques. Porcine and ovine larynges are ideal, affordable, models to simulate laryngeal surgery given their similarity to the human larynx in their anatomical layout and tissue composition. Herein, the surgical steps of transoral laser surgery, open partial horizontal laryngectomy, and total laryngectomy are reported. The merging of endoscopic and exoscopic views guarantees an inside-out perspective, which is vital for the comprehension of the complex laryngeal anatomy. The method was successfully adopted during three sessions of a dissection course &#34;Lary-Gym&#34;. Further perspectives on robotic surgical training are described.

The purpose of this paper is to illustrate how to organize a reproducible laboratory for laryngeal surgery on affordable and closely similar animal laryngeal models in order to improve anatomical and surgical knowledge and skills.

解剖学室での現代喉頭手術の学習

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is ...

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs to replace diseased or damaged organs. Scaffolds are needed to facilitate the generation of three-dimensional organs or tissues using differentiated stem cells in vivo. In this report, we describe a novel method for developing vascularized scaffolds using decellularized rat kidneys. Eight-week-old Sprague-Dawley rats were used in this study, and heparin was injected into the heart to facilitate flow into the renal vessels, allowing heparin to perfuse into the renal vessels. The abdominal cavity was opened, and the left kidney was collected. The collected kidneys were perfused for 9 h using detergents, such as Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate, to decellularize the tissue. Decellularized kidney scaffolds were then gently washed with 1% penicillin/streptomycin and heparin to remove cellular debris and chemical residues. Transplantation of stem cells with the decellularized vascular scaffolds is expected to facilitate the generation of new organs. Thus, the vascularized scaffolds may provide a foundation for tissue engineering of organ grafts in the future.

This protocol introduces a method to develop a scaffold using decellularized rat kidneys. The protocol includes decellularization and recellularization processes to confirm bioavailability. Decellularization is performed using Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate.

ラットにおける脱細胞化腎臓足場の調製

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...