3D相関FIBミリングにより、特定の、さらにはまれな細胞イベントがクライオTEMにアクセス可能になります。このイベントの超構造をネイティブ環境内で直接明らかにすることができます。相関ワークフローは、希少な細胞構造を標的とする成功率を向上させ、混雑した細胞環境でそれらを明確に識別するのに役立ちます。
この手順を実演するのは、相関クライオ電子線トモグラフィーの専門家であるアンナビーバーとクリスティーナキャピタニオです。細胞播種グリッドのクライオ蛍光顕微鏡観察は、蛍光および反射モードの広い視野概要を取得することから始めます。次に、蛍光シグナルを有する適切なグリッド正方形を選択する。
セルとビーズが各正方形の中心に向かって均等に分布していることを確認した後、FIB-SEMとTEM機器の両方にアクセスでき、グリッドエッジから少なくとも3正方形離れている200メッシュグリッド上の正方形を選択します。選択されたグリッド正方形のそれぞれで、適切なフォーカスステップを有する蛍光スタックを取得する。高い開口数対物レンズを使用して、光子数と位置特定精度を高める必要があります。
開口数0.9の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡で、300ナノメートルのステップサイズでナイキスト値をオーバーサンプリングしたスタックを取得します。複数のカラースタックを記録し、グリッドを液体窒素の下に保管します。カットアウトマークまたはオリエンテーションマークのいずれかを使用して、後でTEMに配置するためにグリッドの適切な向きを確保します。
グリッドをクライオFIB-SEM装置にロードします。フライス加工方向がTEMの傾斜軸に垂直であることを確認してください。グリッドを保護有機金属層でコーティングするには、FIB-SEMセットアップで事前定義されたステージ位置でプラズマコーダーとガス注入システムを使用します。
次に、SEM グリッド概要を記録し、FLM 概要との 2D 相関を実行します。記録されたグリッドの概要を手動で検査するか、ソフトウェアパッケージを使用して、グリッドの正方形を見つけます。FLMおよびSEMグリッド概要の正方形に対応する4つの位置を選択してマークし、FLM-SEM相関のためにマークされたポイント間の変換を計算します。
次に、SEMビューでの位置を予測する前に、FLMスタックが取得された対応するグリッド正方形の中央にマーカーを配置します。相関グリッドの正方形ごとに、選択したFIBミリング角度で低電流イオンビーム画像を撮影し、蛍光データに一致する目的の位置と倍率の視野を選択します。200メッシュグリッドの場合、グリッドバーを含む単一のグリッド正方形を含むFIB-SEMデータを取得します。
次に、同じ正方形のSEM画像を撮影して、蛍光およびイオンビームビューで対応するビーズの識別に役立てます。対応する再スライスされた3D FLMスタックとイオンビームビューを3Dでロードすることにより、3D相関ツールボックス、3D CTを使用して、生またはデコンボリューションされた3D FLMスタックと各位置の2Dイオンビームビューの登録を実行します 蛍光データ CT.In、4つの基準ビーズを選択し、位置リストを右クリックして、Xの信号のガウスフィッティングを介してビーズの3D位置を決定します。 次に、イオンビーム画像内の対応するビーズを選択して、最初の3D相関を実行します。同様に、登録にビーズを追加して、相関の精度を確認します。
蛍光とイオンビームの両方で明確に識別可能な基準ビーズを除外し、イオンビーム画像内の予測位置と実際の位置を確認します。3D CTでは、二乗平均平方根誤差(RMSE値)を表示して、相関の一貫性を評価できます。RMSE 値が小さく、ローカリゼーション精度のオーダーであることを確認してください。
次に、ターゲットのセルラー信号を選択し、FLMスタック内の3D位置を適合させてから、変換を適用してイオンビームビューのターゲット位置を予測します。相関する正方形ごとに、関心のある特徴の予測位置をFIB-SEM装置に転送して、ラメラミリングパターンを配置します。セルごとに複数の信号がある場合は、同じラメラに可能な限り最大の関心点が含まれるようにパターンを配置します。
ラメラを粗く粉砕し、続いて微細粉砕して、150〜250ナノメートルの最終厚さを得る。グリッドを透過型電子顕微鏡にロードするときは、ラメラの向きが傾斜軸に垂直であることを確認してください。ラメラを含む各グリッド正方形のグリッドモンタージュと概要を適切な倍率と露光時間で取得し、総電子線量を大幅に増やすことなくTEM画像内の基準ビーズを視覚化します。
各ラメラの高解像度TEMマップを取得します。レジスタと3D-2Dは、FLMスタックを3D CTのTEMグリッド正方形およびラメラオーバービューと相関させます。TEMでFLMとTEMの低倍率から高倍率までの相関を行います。位置を転送した後、相関位置でチルトシリーズをセットアップして実行します」次に、適切な倍率、デフォーカス、および総線量を使用して、線量対称傾斜スキームを使用してラメラによって決定されたプレチルトで画像取得を開始します。
画像の手動取得またはバッチ取得に従います。代表的な分析では、粉砕部位の低倍率TEM概要が、関心のある生物学的特徴を局在化することが示されている。その後、より高い倍率のビューがFLMの最大強度投影と相関し、断層撮影のための位置が設定されました。
取得した画像では、エンドサイトーシスタンパク質沈着物をその天然環境で視覚化することができました。サンプルの最適化は非常に重要です。グリッド調製は、ミルする細胞の分布が良好で、ほとんどのグリッドの正方形に多数の目に見える基準ビーズがあるように最適化する必要があります。
3D相関ミリングは、各細胞におけるオートファジーの段階的な進行など、さまざまな細胞プロセスの微細構造を明らかにするのに役立ち、新しい相分離コンパートメントをキャプチャするために使用されます。
