ここで説明する手動突っ込み方法は、透過電子顕微鏡用サンプルを調製するための費用対効果の高い、信頼性の高い方法です。このビデオでは、手動プランジャーを設定し、クライオゲンを準備し、EMグリッドの手動ブロッティングと突っ込みを行う方法を紹介します。手動の突っ込み環境を準備します。
この手順は、湿度が95%を超える摂氏40度に維持された冷たい部屋で行う必要があり、手動ブロッティングと突っ込みのためのオンラインプロトコルに記載されているように、ここに示されている材料を使用することをお勧めします。クライオゲンデュワーとマニュアルプランジャーを準備します。クライオゲンデュワーを組み立てるには、まず、それが平らでレベルであることを確認し、青い発泡スチロールデュワーの下部にプラットフォームベースをインストールします。
次に、エタン容器ホルダーをプラットフォームベースの上に置き、真鍮エタン容器を挿入します。最後に、回転グリッドストレージプラットフォームを配置します。次に、マニュアルプランジャーのベースに突っ込んだデュワーを見つけます。
突っ込んだ腕の下にエタン船を中心に、突っ込んだデュワーをベースに固定します。手動の突っ込み高さを設定するには、最初に突っ込んだ腕のベースに新鮮なテープを取り付けます。次に、突っ込んだ腕とピンセットベースにテープをしっかりと巻き付けて、ピンセットを締めます。
ピンセットを軽くタップしてしっかりと取り付けられるようにします。突っ込んだ腕を持ち、足のペダルを落としてピンセットを真鍮のエタン容器にゆっくりと下ろします。ピンセットが真鍮エタン容器の真ん中に位置するように、突っ込むデュワーの位置を調整します。
ピンセットの先端は、ピンセットおよび手動プランジャーへの損傷を避けるために、真鍮エタン容器のサイズまたは底部に接触してはならない。位置を設定したら、手動の突っ込みアームをリセットします。クライオゲンを準備します。
クライオゲンの準備は換気の良い部屋で行われるべきであり、適切な個人的な保護具は常に着用する必要があります。まず、液体窒素が急落したデュワーに直接入り、液体窒素レベルが真鍮エタン容器の上部に達すると停止します。液体窒素が激しく泡立つのを止めた後に進むのに十分な寒さでなければなりません。
これには約5分かかります。エタンは圧縮ガスとして来て、凝縮する必要があります。最適なエタン凝縮のためにガスの流れを設定するには、エタンガスラインの先端を250ミルビーカーの水に挿入し、泡立ちを観察します。
ガスの流れは、激しく水面を破壊しない気泡の安定した流れを生成する必要があります。エタンの凝縮を開始するには、真鍮エタン容器の底部にエタンガスラインの先端を置きます。金属チップをゆっくりとかき混ぜ、エタンの液化を開始します。
エタンが冷え始めるとすぐに、それは聞こえる音を出すでしょう。真鍮のエタン容器を液体エタンでいっぱいの4分の3に満たします。液体窒素で急落したデュワーを上にして、真鍮のエタン容器に触れますが、それにこぼれないようにします。
均一なエタン凍結には液体窒素の添加が必要である。青い突っ込みデュワーに泡のふたを置き、エタンが完全に固まるようにします。エタンガスの流れを再開し、気体ラインの先端を固体エタンに慎重に入れます。
先端を容器の中に縦に置き、底部にエタンを分配することが重要です。金属チップをゆっくりとかき混ぜてエタンを溶かし、液体エタンのレベルを容器の上部に持ち上げます。蓋を約1分間閉じ、2~3ミリメートルの固体エタンが見えるまで、真鍮容器の縁の周りにエタンを固めます。
エタンは現在、生物学的サンプルを凍結するのに理想的な温度に達しています。突っ込んだデュワーを手動プランジャーのベースに注意深く取り付けます。突っ込んだ腕とピンセットベースにテープをしっかりと巻き付けて、ピンセットを締めます。
突っ込んだ腕を持ち、足のペダルを落としてゆっくりとピンセットを液体エタンに下げます。ピンセットが液体エタンの真ん中に位置し、固体エタンリングとの接触を避けるように、突っ込んだデュワーの位置を調整します。突っ込み素材とアクセサリーを準備します。
各円形のフィルターペーパーを約1センチメートル幅のストリップに切って、ブロッティング紙を準備します。ブロッティング紙の中心に触れないようにし、小さな端部を捨てます。ブロッティング紙のストリップが乾燥し、清潔で、汚染物質がないことを確認することが重要です。
突っ込む前に、グリッドボックスを突っ込んだデュワーに適切なスロットに入れます。グリッドが自由に回転できるようにしてください。プランジ凍結によりクライオエム標本を準備する。
グリッドとグリッドの準備の多様性のために、親水性グリッドをレンダリングするための推奨プロトコルに従ってください。グリッドを適切に処理するには、クリーンで乾燥したクランプピンセットを使用して、外輪の親水性グリッドを拾います。プラスチック製クランプをスライドさせてグリッドを固定し、ピンセットを軽くタップしてグリッドが適切にクランプされていることを確認します。
クランプピンセットに保持されているグリッドの前面にサンプルの3マイクロリットルを適用します。ピンセットベースにテープを巻いて手動突っ込みアームにピンセットをしっかりと取り付けます。サンプルは、今すぐ消え、凍結急落する準備が整いました。
人差し指と親指の間にきれいな紙の端を持ちます。安定した位置を確立するために、急激なデュワーの端に手を置きます。ブロッティング紙は、グリッドの表面から約1センチメートルでなければなりません。
中央がグリッドに接触するまで、ブロッティングペーパーを曲げます。ブロッティング紙は、均一な接触を可能にし、グリッドの損傷を防ぐために、グリッド面に平行にすることが重要です。移動式液体フロントが広がらなくなったら、カウントを開始します。
グリッドを5秒間ブロットします。指を離して、吸引紙を緊張させ、グリッドの表面から素早く取り除きます。同時に、フットペダルを押して手動突っ込みアームを解放し、グリッドを保持するピンセットを液体エタンに突っ込みます。
液体エタンに新鮮な凍結グリッドを維持し、慎重に手動突っ込みアームからピンセットを取り外します。グリッドが取り外し可能になるようにピンセットを慎重に取り外します。エタンから液体窒素への素早い動きで、真鍮エタン容器の下の液体窒素貯蔵所にグリッドを移動します。
グリッド ボックスにグリッドを配置します。代表結果。このビデオから、研究者は、高解像度イメージングのための亜真の氷の薄膜を含む多くの正方形で、このようなCryoEMグリッドを準備することができるはずです。
サンプル濃度とブロッティング時間を調整して、粒子密度を最適化することができます。ここでは、ブロットとプランジ法を使用してCryoEMサンプルを凍結するための完全なワークフローを示します。きれいなクランプ用のトゥイザーを使用して、新鮮なグリッドを拾い、グリッドを所定の位置に固定します。
グリッドの親水性側に3マイクロリットルのサンプルを塗布し、ピンセットハンドルにテープを巻いて手動突っ込みアームにピンセットを固定します。ブロッティングペーパーをグリッド表面に平行に配置し、ブロッティング紙をグリッドに向かってそっと曲げて、ブロッティングを開始します。所望の時間の後、突っ込んだ腕を解放するために足のペダルを押しながらグリッド表面から離れてスナップモーションでブロッティング紙を移動し、液体エタンにグリッドを突っ込みます。
ピンセットと手動の突っ込み腕の周りから慎重にテープを巻き戻します。1つの迅速な動きで、すぐに液体窒素貯蔵所にエタン容器からグリッドを移す。グリッドストレージボックスにグリッドを置き、ピンセットをキムワイプでラップして乾燥させます。
