The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

1試料の調製<ol><li> Bの準備イメージングのための枯草菌細胞 <ol><li> Bの単一コロニーPenassayブロス（抗生物質中3としても知られているPAB）の10ミリリットルを接種するズブチリス株 SU570（168 TRPC2のFtsZ ::のFtsZ-GFP-仕様 ）16。 30℃で低速（100 rpm）で振とう機中で一晩培養する。 </li><li>高速（215 rpm）で振とうしながら30℃で新鮮なPABに0.05 600（600 nmで測定した吸光度）に一晩培養を希釈し、中期対数期（600〜0.4）まで成長する。 </li><li>スクリューキャップのガラス瓶に100ミリリットル1×増殖培地（PAB）での電気泳動グレードのアガロースの2グラムを追加します。オートクレーブでアガロースを溶解する。これは、数ヶ月間、4℃で保存し、必要に応じて、アガロースを溶融させるマイクロ波処理することができる。室温に設定できるようにします。 </li><li>標準GLA上に、接着剤をフレーム（ 材料の表を参照してください65μlの容量）を取り付けssの顕微鏡スライド。これを行うには、薄いポリエステルシートを取り外します（各接着フレームが2ポリエステルシート、薄い1と厚い1との間に位置し、正方形の取り外しセンターがあります）と、顕微鏡スライドの表面にフレームの露出した粘着面を適用します。これは事実上のスライドの上に四角いうまく作成されます。これはその後の工程でそれにこだわってカバースリップを防止するようにフレームに取り付けられた厚さのポリエステルシートのままにしておきます。 </li><li>接着剤フレームに67μlの沸騰ピペットまで電子レンジでアガロース溶液メルト。すぐに平坦な表面を作成し、5〜10分間室温で残すように上にカバースリップを配置。サンプルが採取されている間1〜2分間、カバースリップを削除します。 </li><li> 30秒間5,900×gで、サンプルと遠心分離機の1ミリリットルのアリコートを収穫。上清を除去し、200μlの新鮮なPABにペレットを再懸濁します。 </li><li>事前prepaに濃縮サンプルピペット2.5μlのを取る赤アガロースパッド。アガロースパッドの平らな面に沿って均等にサンプルを広げた。アガロースパッドに触れずにピンセットを用いて顕微鏡スライドからの接着フレームを削除します。 </li><li>カバーガラスの底直径35mmのペトリ皿に顕微鏡スライドからアガロースパッドを転送します。ペトリ皿の細胞懸濁液とカバーガラスとが直接接触するようにアガロースパッドを反転させる。ペトリ皿の底には、高分解能イメージングのための1.525の屈折率を有する。 </li></ol></li><li>ライブS.の調製イメージング用ブドウ球菌細胞<ol><li> S.の単一コロニーをLブロス10mlに接種黄色ブドウ球菌株のSA94（鋤-のFtsZ-GFPおよびpGL485を含むSH1000あり、r ERMは、のCm r）の25。 37℃での低速（100 rpm）でロータリーシェーカーで一晩培養する。 </li><li> 0.05のIPTG（イソ新鮮なL-ブロス中0.05 600（600 nmで測定した吸光度）の一晩培養物を希釈融合タンパク質の産生を誘導するためプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）。 </li><li>高速（215 rpm）で振とうしながら37℃で培養し、中期対数期（600〜0.4）まで成長する。 </li><li> Bについて説明したように1.1.8 - 1.1.3、手順に従ってください枯草生細胞調製物。 注：誘導性の制御下に蛍光融合タンパク質を発現する菌株について、ステップ1.1.3にアガロース溶液に誘導物質の適切な濃度を追加します。 </li></ol></li></ol>顕微鏡の調製このメソッドは、ブレイズモジュールを装着しDeltaVision OMX（光学顕微鏡、実験的な）3D-SIMイメージングシステムを使用しています。記載される実験のために、唯一つのレーザとつのカメラが使用される。照明光路は、 図1に記載されている。この方法では、顕微鏡は、適切な較正、光学伝達関数（OTF）を有していることを前提としファイルや光視準メンテナンスを実施。 <ol><li>生細胞イメージング実験のために、加熱ステージを対物（60X 1.42のNA油浸対物）に取り付けられ、セラミックステージと客観加熱の襟に接続されていることを確認してください。 </li><li>イメージングは​​少なくとも4時間前に、客観的かつ段階のヒーターの電源を入れ、ゆっくりと5℃/時間の最大レートで必要な設定温度をランプアップします。これは、画像化の前に、夕方、このプロセスを開始し、3℃/ 4時間で上昇することをお勧めします。 Bとの生細胞実験のために枯草菌は 、ほとんどの実験は30℃で実施されている。 S.のために黄色ブドウ球菌は 、全ての実験は37℃で行われる。 </li><li>実験の日に、システムおよびレーザーが完全に安定するまで画像化の前に少なくとも1時間電源を入れます。予熱する加熱されたステージに小皿段階インサートをロードします。 <ol><li>マスタコントローラワークステーションの電源を入れます。 </li><li>画像処理WORKSTATをオンにしますイオン。 </li><li>顕微鏡柵の外階にあるカメラのクーラーの電源をオンにします。 </li><li> （これらはすべて使用されませんが）sCMOSカメラのすべての電源をオンにします。 </li><li>レーザーと電子エンクロージャの内部には、オンに： <ol><li>インストゥルメント·コントローラシャーシ。 </li><li> Nanomotionシャーシ。 </li><li> Zピエゾのためのイエナコントローラ。 </li><li>すべての4ガルボモータコントローラ。 </li><li>一次レーザ制御モジュール。 </li><li>二次レーザ制御モジュール。 </li><li>すべてのカメラワークステーション。 </li><li> OMXICワークステーション。 </li></ol></li><li>マスタコントローラワークステーションで、アイコンをクリックしてOMXソフトウェアを開きます。適切なデータのフォルダに保存するデータのファイルパスを設定します。 </li><li>ハードウェアを初期化するには、 ハードウェアのメニューに移動し、ハードウェアを選択し、 再起動ハードウェアのボタンをクリックします。ウィンドウを閉じる。 </li><li> 4（実験に必要なレーザーにsoftWoRx software.Turnを開始88）である。 </li><li>レーザー安全インターロック用のキースイッチをオンにします。 </li><li>正しいのダイクロイックフィルタ引き出しが目的の下に挿入されていることを確認。 GFPのためには、標準（または固定）引出しである。 </li><li> OMX SFでは、[ファイル ] メニューから[ 設定]を選択し、 引き出しドロップダウンメニューから固定ドロワーを選択します。ウィンドウを閉じる。 </li><li> ライトパラメータ]セクションで、ソフトウェアのメイン画面から次の操作を行います。 <ol><li> チャンネル選択からの励起レーザーおよび発光フィルター（FITC）カメラに適したカメラをアクティブにします。 </li><li> モードが シーケンシャルに設定されている画像を確認してください。 </li><li> 光路が SIに設定されている確認してください。 </li><li>チェックモードが 95 MHzに設定されています。 </li><li> 488レーザー励起で選択されて確認してください。 </li><li>設定する<stroNG&gt; 1×1のウィンドウサイズとビニングのための512×512サイズ。 </li></ol></li><li> 実験タブで、 タイプドロップダウンメニューからSIに設定されていることを確認。 </li><li> セクショニングがアクティブになっていることを確認し、 光学部の間隔は、0.125に設定されていること。 </li><li> スキャン開始が 中間のときのフォーカスポイントを確認してください。 </li></ol></li></ol> 3画像取得<ol><li>対物レンズの先端にオイルを一滴を適用します。 37°Cの場合、推奨される原料油は最高37℃で細菌細胞をマウントするために使用されるゲルパッドの屈折率と一致するように1.518の屈折率を有し（ ステップ1.1.3参照）。 </li><li>ステージインセットに準備された細胞を含む試料ペトリ皿を置き、円形の加熱蓋でカバーしています。オイルの底に触れるまで、ステージを下げサンプルペトリ皿。 </li><li>料理は段階で15分間加熱し、平衡化することを許可する。 （ ライトパラメータセクションにあります）5ミリ秒以下の低露出の設定を使用して、（ ナノ位置決め部に位置dZと 、）ナノ位置決めステージコン ​​トロールを使用してサンプルに焦点を当てる。アップフォーカスダウンサンプルを通る光が均等にサンプル焦点面の上下に広がっているかどうかを判断する。点広がり関数は、偶数（球面収差）でない場合、試料皿クロロホルムで対物レンズの底をきれい。油を変更し、適切な一致が、球面収差を最小限に抑えるために、石油·サンプルの屈折率との間で発見されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li> 0.5μmのdZとステップ·サイズを使用して、画像スタックの頂部および底部をマークする。サンプルの中央に戻ります。サンプル取得の厚さを設定するための実験タブのGet厚ボタンをクリックします。ケーP Zリングの上部と下部を切断しないように注意している間最小限にスタックの高さ。 B.の典型的な厚さ枯草菌のサンプルは2〜3μmのです。 </li><li>現在のエクスポージャーおよび％Tの設定でサンプル画像の最大輝度値 （Max） を決定します。この値は、イメージウィンドウの下に発見された。タイムラプスイメージングのために、イメージのバックグラウンドを超える1,100-1,400の最大強度を得るために、 露出および％Tを調整します。千上記の背景の最小強度は、画像再構成を得るために必要とされる。一回限りの画像の場合、4,000〜5,000に最大強度を増加させる。 </li><li> 実験タブでタイムラプスセクションをアクティブにします。必要なフレームレートと合計時間を設定します。 データファイルで、適切なファイル名を入力します。画像取得を開始するために[実行 ] ボタンをクリックします。 注：画像取得が完了したときにグラムREEN プログレスバーが終了し、ログファイルには、適切なデータのフォルダに設定されたデータのために表示されます。 </li></ol>データ品質のチェック4。 <ol><li>画像取得の開始時に、時系列の最初のフレームのための画像取得の開始時に画像の最大輝度値を確認します。最初のフレームの取得の終了時に、この最初のフレームのためのzスタックを介してシグナル強度が10％低下以上に存在していないことを確認する。最初の時点で光退色このレベル以上あった場合、時系列を介したデータは、分析のために不十分な品質のものとなり、時系列の取得を停止することができる。 </li><li>時系列の取得の終了時に、といった拡張子得られた原画像ファイルを開き、最終的な画像の時系列の先頭から最大信号強度の減少を把握する。蜂が持つ任意の時点を捨てるnは30％以上の光退色。 </li></ol> 5。再構築、3D-SIM像<ol><li> Processメニューから、SI再構成ウィンドウをアクティブにします。すべてのパラメータのための既存の設定を使用します。 </li><li> 利用チャネル固有OTFボタンをアクティブにして、 標準のフィルタセットに設定されています。 KOボタンを角度および標準フィルタセットに設定を使用してチャンネルの特定をアクティブにします。 </li><li> 入力ファイル·スペースにファイル（の.Dv）生をドラッグ＆ドロップします。 それを行う ]をクリックします。 _SIと入力ファイルが最後に追加されたように、出力ファイルは同じ名前になります。 注：複数のファイルが処理される場合、この再構成プロセスは、 プロセス·メニューからタスクビルダ機能を使用してタスクとして実行することができる。 </li></ol> 6。データのエクスポートおよび分析<ol><li>モードとexを上回るに3D画像を視覚化するImarisを使用して、TIFF（300 dpi）のまたはAVIファイル（圧縮なし）としてポート画像データ。 Imarisサイズ測定は上回るモードでの測定ツールを用いて行うことができる。 </li><li> 3D-SIM画像データからZ環の3次元の強度プロットを生成する。 <ol><li> Zリングの周りのFtsZの分布を調べ、3D強度プロットを作成する<ol><li>個別のz軸のスライスを表示するには、3D画像ファイルを開きます。関心領域をトリミングするビューメニュー]タブの下にあるボリュームビューアツールを使用します。 </li><li>入力ウィンドウに、この3D画像用のウィンドウ番号を入力し、出力ウィンドウに新しい、未使用のウィンドウ番号を入力してください。地域を選択ボタンは、ビューの元の40×40μmのフィールドから関心のある個別のZリングをトリミングするために利用可能になります。 </li><li>回転タブで目的の軸と回転の度合いを調整します。それを行う]ボタンをクリックします。 Zリングの所望の視点を得るために、ボリュームをスクロールします。 </li><li>データインスペクタツールを使用とtを調整彼の列/行の寸法は、個別のZリングの周りに関心のある新しい領域を作成します。この関心新しい領域を配置するために画像の中心をクリックします。テキスト画像データは、関心領域内の各画素の蛍光強度を表示し、自動的に生成されたテーブルである。 </li><li>最初は強度プロットを表示するには、3Dグラフ]ボタンをクリックします。 </li><li>別の方法として、テキスト画像データは、ファイルメニューで保存するテーブルデータ]ボタンをクリックしてエクスポートすることができます。 </li><li>新しいスプレッドシートに保存されたテキストフ​​ァイルから画像データをコピーする。スプレッドシート内のすべてのセルを選択して、新しい3Dサーフェスグラフを作成します。出版物のための3D強度プロットグラフをフォーマットします。 </li></ol></li><li> 3D画像ファイルとは別の時点のそれぞれに6.2.1.7 -時系列データの繰り返しの場合は6.2.1.1を繰り返します 。 </li></ol></li><li>時間にわたる平均蛍光強度の追跡<ol><li> fluorescenを追跡するために、テキスト、画像データを使用する関心領域の経時CE強度。 </li><li>関心領域に対応するセルを選択します。 </li><li>この関心領域についての各時点での平均蛍光強度を算出する。 </li><li>独立した折れ線グラフを生成するために、平均蛍光強度値を使用します。 </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

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蛍光ライブセルイメージングは​​、時間とともに細胞内の動的変化の観察を可能にする強力なツールです。細菌細胞生物学のライブイメージングは​​小さいため、セルサイズが挑戦されて励起光への反復曝露に耐える細菌細胞の能力が低下している。 F3D-SIMは、すべての細胞生物学を調べるために利用可能なツールを拡大してきましたが、それは不十分な実装されていればアーティファクトが導入することができるように、慎重にこのテクニックを行う必要がある。この技術の使用の成功のための重要な考慮事項がいくつかあります。それが放出された光の点広がり関数の使用に依存広視野蛍光イメージング法であるように、放出された光の屈折率不整合と球面収差が正確な画像再構成を可能にするために避けなければならない。高品質0.17ミリメートルの厚さのカバースリップの使用は、カバーガラスの厚さのばらつきによる信号強度の変化を避けるために唇を強くお勧めします。これは、慎重にすべての実験の初期段階の間に放出される光の球面収差を評価し、必要に応じて、液浸油の屈折率を調整することが非常に重要である。それは、温度と試料の封入剤/基板の両方に依存しているので、これは、日常的に異なる場合があります。間違ったオイルの使用は、ハローやエコー信号などのアーチファクトを有する画像の劣っ再建になります。 画像再構成プロセスの最後に、各相毎に再構成の品質の尺度は、照明の各相/角度「KO角に対するベストフィット」することによって得ることができる。この値は、各角度は1未満である場合には、再構成された品質がおそらく高くなる。この値が6を超える場合には、再構成画像は、アーチファクトを含むことになる可能性が最も高い。コモンアーティファクト）が対応して、画像内のストライプの外観を私を含むグリッドの角度のいずれかに。これは、グリッドの角度から低い信号から生じ得る。 ⅱ）構造体の周囲ハローイング。これは周囲の構造に比べて明るい構造からの信号の非常に不均一なレベルに起因する、オイルの屈折率の不整合およびサンプルやイメージがするのに十分な「構造」を含むすぎ非晶質ではなく、中の構造が原因である可能性がありアルゴリズムによって認識;通常、高いバックグラウンド信号を、画像内のノイズ比の低い信号から生じるiii）の「蜂巣 &#39;; iv）はオイルによる試料の屈折率不整合にすることができる延伸/のxyに細長い構造。このアーティファクトは、不慣れなユーザのために識別することは困難である。それは、この技術の使用を開始するときに、新しいユーザーが読影と分析に関するアドバイスを経験豊富な研究者のSIMに相談することをお勧めします。 全ての蛍光生細胞イメージング実験と同様に、インポートされ慎重に最小限のアーチファクトを有する画像を再構成するために必要十分な発光信号が光退色し、細胞の光毒性の程度を最小限にするために、励起エネルギーの入力をバランスさせるアリ。過度の光退色（シングルzスタック取得全体で30％を超える）は、再構成画像内のストライピングパターンにつながる。 sCMOSカメラを用いて、超解像画像が正常にバックグラウンドより上のカウント数千程度の低い放射信号と原画像から再構成することができる。これは、非常に短い露光時間がそれによって光退色を低減し、各フレームの迅速な捕捉を可能にするために可能にすることができる。また、細胞が励起エネルギー入力から回復するためのフレーム間の時間の量を増加させる。各個別のフレームのキャプチャ時間は非常に短くすることができるように、さらに、個別の取り込み中に「モーションブラー」によって導入されるアーティファクトの程度は、この方法を用いて低減される。 このバリ3D-SIMのationは、細菌の細胞生物学者のライブイメージングのための他の利用可能な超高解像度イメージング技術よりも、他の多くの利点を提供しています。サンプルにすべての3次元で解像度が2倍の増加とイメージする能力、最大30ミクロンは、実験中に全体の細菌（および哺乳動物）細胞の画像化を可能にします。一般的にエバネッセント波で行われているような単一分子の局在化などの技術は、サンプルへの浸透の深さを達成することはできませんし、細胞全体についての情報を提供していません。この技術のためのより高いサンプリング深さを可能にする最近の進歩は、細胞全体のより良い距離分解能になることがあります。さらに、取得する原画像の数千を必要単一分子局在化技術は、空間分解能が依存するように、捕獲することができ、キャプチャフレームレートと究極達成空間分解能との間の妥協を必要とすることが、フレームレートが制限されている前夜の数規定された空間内に記録NTS。キャプチャされたフレームの数を減らすと、より低い空間分解能をもたらすが、目的の生物学的プロセスに必要な時間分解能を達成するの​​に十分であり得る。フレーム間の回復時間の量は、それによって、時系列を得ることが可能な期間および頻度を制限する生細胞における毒性を最小限にするために増加する必要があるかもしれない。そのような電子顕微鏡（EM）または電子cryotomographyなどの高解像技術（ECT）オファーは、3D-SIM（​​および他の超解像光顕微鏡技術）上の解像度を増加したが、固定したサンプルを実行する必要があります。固定及び処理がアーティファクトを導入する可能性およびラベリングの欠如は解釈が困難になる場合があります。ラベルフリーECTが悪いコントラストを有し、周囲に500から200 nmの24のサンプルの浸透深さを達成することができるので、目的のタンパク質が同定できたとしても、全細菌細胞中のタンパク質の構造を観察することはできない。標識は、免疫金と同様に、EMで使用することができる場合であっても、イメージングは​​、2Dのみで行われる。 3Dは、薄い切片とセクションの計算再建のみ達成可能である。薄い切片は、経験豊富な技術者が必要ですが、問題が発生するとアーティファクトにつながることができます。生細胞または固定細胞で、3D-SIMは、特定の様式で埋め込まれると、細胞が急速に近い天然の状態で画像化のために調製することができる必要はない。 この方法では、蛍光顕微鏡での最小限の経験を持つ研究者によって実施が比較的容易である。実験は、それが過度のバックグラウンド信号を発するか発生しないように、健康な細胞機能をサポートする媒体中で行うことができる。細菌細胞の場合、これは複雑で、最少培地又は細菌細胞の運動性を制御するための固体または半固体培地の使用の多くの種類の使用を可能にすることができる。すでに蛍光タンパク質（FP）の融合を設計しそれらの機能をテストしている多くの生物学者これらの融合は、新しい光活性化、FP融合でさらにエンジニアリングおよび検証されずに、急速にこの技術を取ることができます。私たちは、一般的な観察 ​​として、見られるS.黄色ブドウ球菌は、Bより、FP融合で撮像中に光退色をより受けました枯草菌 。グリッドパターンは、物理的な格子によって生成された独自の3D-SIM法を用いて、S.数と生細胞イメージングを行うことができなかった黄色ブドウ球菌 、FP融合。しかし、この高度なF3D-SIM法では、これらのFPの融合イメージすることができたし、これらのタグ付きタンパク質のダイナミクスをキャプチャするために、短い時系列を実行します。これはおそらく画像形成に必要な縮小露光時間によるものであり、細胞の回復のためのフレーム間の時間を増加させた。 OMXブレイズ3D-SIMは、比較的容易に、単一の実験室またはコアイメージング設備に実装することができる商業的に利用可能な技術である。ケア人工を回避するための技術を実行するように注意しなければならない貧弱な試料調製や貧弱な画像キャプチャのための事実。技術が習得されると、細菌などの小さな生物におけるタンパク質の構造およびダイナミクスの研究は、単色または多色の蛍光を行うことができる。

異なるイメージング技術の数は、さまざまな電子及び光学顕微鏡技術を含む細菌を研究するために長年にわたって使用されてきた。電子顕微鏡は、非常に高い解像度を提供しながら、ナノメートルまで、真空および造影剤の使用の必要性が固定され、埋め込まれた標本にこの技術を制限している。アーチファクトに起因長い試料調製及び当業者にも導入することができるサンプルを調製し、得られた画像を分析し、解釈するために必要とされる。光学顕微鏡は、より単純なサンプル調製および電子顕微鏡に比べて比較的容易に複数のラベルを適用することの利点を提供しています。蛍光タンパク質および色素コンジュゲートを使用して、蛍光顕微鏡で生細胞を研究する能力もまた可能である。フルオロフォアの安定性と蛍光タンパク質サイズ/構造の改善低下細胞毒性をもたらすだけでなく、カメラの検出？と思ったらにおける進歩広視野および共焦点イメージングシステムを用いて、学問、蛍光顕微鏡を大幅細胞の空間動態の理解を拡大している。これらの技術を使用して、過去20年間の細菌細胞の私たちの知識は、細菌細胞1内の構造やタンパク質、組織の高いレベルを明らかにし、はるかに詳細な図にも大きく進んでいる。 しかし、光学顕微鏡の従来の方法は、固有の解像度が使用される励起光の波長の約半分であることを意味し、回折限界である。したがって、さらに最も最適な従来の光学顕微鏡システムを用いて、最良の横方向の解像度が約220〜250ナノメートルであり、軸方向の分解能は約500nmである（総説についてはSchermelleh ら 2参照）。特に細菌の細胞生物学者は、これはまだ深刻なこれらの小さな細胞の空間的構成の理解を制限します。 DIAMにわずか1〜2程度であることETER、長さが1〜10μmの。タンパク質の動的空間挙動が、インビトロのデータに補完するように分析することができる生きた細胞で行うことができる高解像度技術も必要である。 過去10年間、いくつかの超解像蛍光イメージング技術が開発されている。超解像顕微鏡は、従来の光学顕微鏡を用いて得られる少なくとも2倍、横方向の解像度が、それによって、回折限界を克服するイメージング技術を説明しています。これらの技術は、見かけの解像度の実質の増加を作成するために放出される光の照明および/または分析を操作します。超解像技術の3つの主要な種類がまだあり- i）の放出の枯渇顕微鏡3（STED）を刺激し;そのような光活性化ローカライゼーション顕微鏡4,5（PALM）、確率的光学再構築顕微鏡法などの技術を含むⅱ）単一分子の局在顕微鏡、 <s&gt; 6（STORM）まで、直接STORM 7（dSTORM）、および個別の分子復帰8（GDSIM）と基底状態の欠乏;およびiii）構造化照明顕微鏡9-12（SIM）。単一分子の局在技術は、生物学的サンプル中のダウンnmの10〜40の間に、横方向の解像度で最大の増加を提供しています。単一分子局在化顕微鏡法の多くの実装では、サンプリングの深さは、エバネッセント波に制限され、STEDの最初の実装はまた、サンプリング深さが制限された。しかし、放出された光の軸方向位置を推測するために二つの目的を用いた最近のこのような適応光学系の使用のような進歩は、異なる焦点位置での点広がり関数における非点収差の利用、マルチプレーン検出とは、軸方向の両方における改善を見ているSTEDと単一分子の局在13,14の両方の分解能とサンプリングの深さ。 STED用のデータ収集レートと単一分子の局在化技術原因（ローカリゼーション技術アップ50,000）の最大解像度で取得する必要がある大量の画像に対しても比較的遅い。この遅いデータ収集は、多くの場合、非常に高価でカスタム変更することなく、生試料のイメージングに適していない。これら二つの技術は現在、最適（レビューのために2,15を参照）固定したサンプルに適していますが、多くの仕事は、この制限に対処するために行われています。 三次元構造化照明顕微鏡（3D-SIM）は、それぞれ約110および280nmの決議結果として両側面と軸方向の解像度を向上させ、広い視野技法である。サンプリングの深さは、全細胞の画像化を可能にする、カバースリップから30ミクロンまでである。光学顕微鏡実験（OMX）プラットフォーム上セダト、AGARD、およびGustaffssonによって開発された3D-SIMの変化が異なる15内に移動される既知のグリッドパターンを試料に照射することを含む各z平面9-11の位置。観察可能領域外周波数空間で作成された結果として生じるモアレパターンの縞を測定する。周波数空間からの情報は、可視超解像画像10,11を生成することは、計算、再構成されている。生の画像は、この技術を用いて取得することが可能な相対速度は、生細胞のイメージングを可能にする。しかし、それは秒の時間スケールで発生する生物学的プロセスのために、生の画像の取得率は依然として動的な変更をキャプチャするには遅すぎることに注意することが重要です。秒の捕捉率との時系列については、十分な回復時間なしで繰り返さ買収は、特に小さな細菌細胞のライブイメージングの間に、光毒性および光退色につながることができます。 これらの問題を克服するために、高速な3D-SIM（​​F3D-SIM）のための最近の進歩が開発されている。ここでは、私だったOMXブレイズ16として知られているものを説明しますこの技術は、以前のシステムで使用されたような物理的なグリッドを使用することなく、パターン化された照明は、後半に2011年に作成されますntroduced。光束と新しいシャッター技術干渉の使用は非常に急速な方法で、試料上のパターン化された光の生成を可能にする。既存のEMCCDカメラと比較した場合、画像取得の速度はさらに、特に、科学的な相補型金属酸化膜半導体（sCMOS）カメラの導入により増強された。これらの変更は、秒16以内に起こる細胞内の動的な変更の監視を可能にする、1ミクロン（512×512ピクセル、9のzスライス）のサンプリング深さのために、毎秒1フレームの可能な画像取得速度をもたらした。この方法を用いて細胞を生きて見かけ上のエクスポージャーの減少（励起）時間が延長された時間キャプチャするシリーズまたは捕捉率の増加のいずれかを可能にする。 ここでは、examinするF3D-SIM顕微鏡の適用を記述する電子構造と2細菌種の細胞内の細胞質分裂のZリングのダイナミックな動き：棒状のモデル生物の枯草菌と球形ヒト病原体黄色ブドウ球菌 。 FtsZは、細菌17,18における細胞分裂に重要な役割を果たしているチューブ状の細胞骨格タンパク質である。これは、分割装置17,18を形成する、少なくとも20の他の分割のタンパク質をリクルートする分割部位に局在し、細胞収縮19-23力を提供すると考えられている。この方法は、不均一のFtsZはビーズ状配置の両方の生物におけるZリングの周りに分布していることが明らかになった。クライオ電子断層撮影（ECT）24によって示唆されるように、従来の広視野蛍光顕微鏡、または不連続構造によって可視化されるように、Zリングは、セルの周囲に連続均一ベルトであるかどうかの長年の問題を解決することができる。私たちは、3D-SIMの能力は非常に小さな（1の空間的検査を改善する方法を示してミクロン径）S.のような丸い細胞3つの連続した垂直な平面（x、y、z）とに分割球菌 。これらの技術を用いてタイムラプス研究は、Z環の構造は、環内に、かなりのFtsZ分子が固定された足場24の内外に移動するよりも総組織変化と、動的であることを示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

蛍光顕微鏡を用いて生物学的試料の画像化は、生試料の超解像を可能にする光の回折の解像度の障壁を克服するための新しい技術と実質的に進んでいる。誘導放出の枯渇（STED）、（例えばPALM、嵐、そしてGDSIMなどの技術を含む）単一分子の局在顕微鏡、および構造化照明顕微鏡（SIM） - 超解像技術の3つの主要な種類が現在ありません。 STEDおよび単一分子局在化技術は、解像度が最大の増加を示したが、これらは、画像取得の増加速度を提供するために遅れている。三次元のSIM（3D-SIM）は、単一分子の局在とSTEDの両方に比べて多くの利点を提供する広視野蛍光顕微鏡法である。解像度は、それぞれ、110および280nmの典型的な横方向および軸方向の解像度で、改善され、カバーガラスから30μm程度までのサンプリングの深さ、を可能にされている全細胞のイメージング。かなりの光毒性および光退色を低減しつつ、原画像の捕捉率を増加させる技術の最近の進歩（高速3D-SIM）は、秒単位で発生する生物学的プロセスの迅速な取り込みを可能にします。ここでは、画像への細胞が分析されるかを示すために蛍光標識された細胞質分裂のFtsZタンパク質およびこの技術が提供できるユニークな情報のタイプを有する細菌細胞をそのような方法の使用を記載している。

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Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

19.8K ビュー.  University of Technology, Sydney. Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring. 

ビデオ: Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

生物学

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

細菌分裂機械の超解像イメージング

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...