グラント：5RO1GM086447-02。

1。試料調製<ol><li>ひずみJB281の単一コロニーをLB培地に接種[BW25113 / pJB042（P ラック ：FtsZ-mEos2）]。 37℃で振とう機で一晩増殖℃、 </li><li> M9 +最少培地[M9塩、0.4％グルコース、2mMのMgSO 4を 、0.1 mMのCaCl 2、MEMアミノ酸やビタミン]に文化1:1,000希釈し、中期対数期（OD 600 = 0.2から0.3）に成長室温（RT）でクロラムフェニコール（150μg/ ml）をプレゼンスインチ</li><li> 20μMのは、（注1を参照）2時間IPTGで文化を誘導する。 </li><li>ペレットのマイクロ遠心（8,000 rpmで、1分）の文化とM9 +等量の再懸濁する。繰り返し。第二再懸濁した後、2時間室温で成長を続けています。 </li><li> 40分間室温でPBS中4％パラホルムアルデヒド液（pH = 7.4）で誘導した培養を修正しました。等容量のPBSでペレット培養再懸濁し、リピート。ライブセルイメージングする場合、等量の固定、ペレット培養、再懸濁しをスキップM9の- [M9塩、0.4％グルコース、2mMのMgSO 4を 、0.1 mMのCaCl 2、MEMアミノ酸];繰り返し。 </li><li>再懸濁培養で1:10にゴールドビーズを希釈します。 （ステップ2.4​​を参照）準備イメージング室にサンプルをアプライ。 </li></ol> [1]注：上記の誘導プロトコール（ステップ1.1から1.3までは）株JB281の発現系に最適化されています。詳細な誘導条件は、関心のある他の発現系またはタンパク質によって異なる場合があります。 2。イメージング会議所の組立<ol><li> M9の3％（w / v）のアガロース溶液を作る- 。 40分間ベンチトップヒートブロックで70℃アガロース°Cを溶かす。ストアは、最大5時間までを50℃でアガロースを溶かし。 </li><li>下向きに電極を有するイメージング室の上半分にきれいmicroaqueductスライドを配置します。灌流チャンネルを覆うようにmicroaqueductスライド上下部ガスケットの位置を合わせます。 </li><li>ガラスの中央に溶けたアガロースの〜50μlをスライド。清潔で乾燥したカバースリップと直ちにトップアガロースゲル滴。ゲルは室温で30分間凝固させる。 <ol><li>カバーガラスをきれいにするには：セラミックホルダーでカバーガラスを手配し、アセトン、エタノール、ガラスジャーに1M KOHの浴場を回転させることで20分間超音波洗浄します。のdH 2 Oに単一の超音波処理し、続いて9 sonicationsの合計のため、サイクルを3回繰り返す新鮮なのdH 2 Oで洗浄カバースリップを保管使用前に、ろ過された空気と乾いたカバーガラスを吹く。 </li></ol></li><li>慎重microaqueductスライドにゲルパッドを残して、カバースリップを削除します。直ちにゲルパッドの上部に細胞培養サンプルを1μl（ステップ1.6を​​参照）を追加します。溶液がゲルパッドで吸収されるように、約2分間待ちます。新しい、きれいな乾いたカバースリップを持つトップゲルパッド。製造元の指示に従って、全体のイメージングチャンバーを組み立てます。 </li></ol> 3。画像収集<ol><li>顕微鏡、カメラとレーザーの電源をオンにします。 MetaMorphソフトを開く陶器（Molecular Devices社）。 </li><li>イメージングパスの適切な励起/発光フィルタ（ 図1）を配置します。 </li><li>それに応じてレーザーパワーおよび取得の設定を行います。 <ol><li> 488 nmのレーザー= 15 MW（注2を参照） </li><li> 561 nmのレーザー= 75 mWの</li><li> 405 nmのレーザー= 2 mWで±減光フィルター （注3を参照） </li></ol></li><li>補完的なステージアダプタを介してステージにイメージング室をロックします。 </li><li>均一にすべての3つのレーザーで照らされている適切な撮像領域（100×100ピクセル）を指定します。 </li><li>近接セルと基準マーカー（ゴールドビーズ）の両方が含まれていますが、重複しないサンプル領域を識別します。 </li><li>カバーガラスに最も近い細胞の表面に焦点を当てています。 50ミリ秒の積分時間で1明視野画像を取得します（ 図3AI）のサンプルに焦点を0.5μmに移動します。 </li><li> 488-nから励起によるアンサンブル緑色蛍光画像を取得<html>メートルレーザーは、50ミリ秒の積分時間（ 図3Aii）を使用。 </li><li> 405 nmおよび561 nmのレーザーからの連続的な照明と赤のチャンネルでストリーミングビデオを取得します。固定した細胞では、50ミリ秒のフレームレートは1,000フレーム〜10％上昇させ405 nmのレーザーパワーで20,000フレーム（〜17分の合計）の合計（注＃4を参照）のために使用されます。生きている細胞は、10ミリ秒のフレームレートを一定に405 nmのレーザーパワーで3000フレーム（約30秒合計）の合計のために使用されます。 </li><li>細胞の下面にフォーカスを移動し、ステップ3.7のような別の明視野画像を取得する。 </li></ol> [2]注：セルの緑色蛍光の積分強度は、細胞内で発現FtsZ-mEos2分子の総数に正比例します。 488 nmの励起パワーとアンサンブル蛍光買収の設定が異なるセル内の相対FtsZ-mEos2発現レベルを比較することができるように、すべての細胞のための一定に保たれるべきです。 ontent &quot;&gt; [3]注：固定セルは、個々の分子を正確に識別することができるように遅い活性化率を達成するために所定の位置にニュートラルデンシティ（ND）フィルター（ 図1、光コンポーネント＃5）で撮像する。回折限界の領域で同時にアクティブにされて2分子の低確率を維持しながら、イメージング、細胞が活性化率を高めるために生きるときにNDフィルターが除去された。速い速度は、ライブセルイメージングに適用総取得時間を短縮するために必要とされる、それによって時間にZ-リングを &quot;凍結&quot;とセルに光損傷の効果を制限する。 [4]注：取得したフレームの数が当社のシステムに最適化されており、特定の細胞構造に依存していた、密度のラベリング活性化率と蛍光団のプール全体を排気するかどうかは、分析のために重要である。生きた細胞では、TIのように短期間でローカライズ十分な数を得ることが重要である私はできるだけ細胞構造の動きによる画像のブレを防ぐことができます。 4。 PALM画像構築<ol><li>検出された各スポットの重心位置を決定します。 <ol><li> MATLAB（MathWorks社、株式会社）に画像スタックをロードします。 </li><li>すべての基準ビーズを除いた1セルの周囲の領域に画像スタックをトリミング。 </li><li>バックグラウンドレベルを超えるが、平均スポット強度を下回っているスポットの検出のために強度のしきい値を選択します。我々は、150フレームウィンドウを使用して最大強度の平均値を算出することで、実験を通じてバックグラウンドレベルの変動を考慮する。各フレームの強度のしきい値は、実行中の平均値から補間されます。 </li><li>各フレームからそれぞれのしきい値を減算します。将来のスポットがしきい値以上の強度を持つ3つの隣接するピクセルとして識別されます。 </li><li>二次元Gaussiaにそれぞれの将来のスポットの蛍光強度を合わせるn個の関数[式＃1]非線形最小二乗アルゴリズム（ 図2）を使って 。各スポットのローカライズ精度が検出された光子の総数[式＃2]を使用して計算されます。 20nmの（固定された細胞）または45ナノメートル（生きた細胞）を超えるローカリゼーション精度で任意の悪いフィットスポットは（ノート＃5を参照）は破棄されます。重複エミッタが原因の可能性平均強度の2倍以上の強度を持つ任意のスポットが、また廃棄されます。 </li><li>固定した細胞は、その重心位置の45 nm以内で任意の場所を無視して同じ分子の繰り返し観測を削除 6フレーム以下でそれに先行した他のスポットの。生きている細胞は、全てのスポットは保持されます。 </li></ol></li><li>基準マーカの動きを使用して、サンプル·ドリフトをキャリブレーションします。 <ol><li>基準マーカの周りに10×10画素領域外作物。 </li><li>各フレームから4.1.3で求めたそれぞれのしきい値を減算します。 </li><li>それぞれの強度プロファイルに適合最小二乗フィッティングアルゴリズムを介してフレームには2次元ガウス形を仮定。 </li><li>フレーム1に対して相対的に重心位置のずれを計算します。 </li></ol></li><li> 4.2で計算された適切な試料ドリフトを4.1で識別された各ユニークな分子の重心位置を修正してください。 3.7と3.10で取得明視野画像を比較してください。細胞は基準マーカーに対して相対的に移動することが観察されている場合、データは放り出されます。 </li><li> 15x15 nmの画素で構成される単一のイメージ上のすべての補正された重心位置を重ね合わせる。ローカライズの精度[式＃2]に等しい標準偏差が重心位置を中心と単位面積、2次元ガウスプロファイルとしてそれぞれユニークな分子をプロットします。画素の強度は、そのピクセルに分子を見つける可能性（ 図3Aiv）に比例した確率密度マップ、この結果。 </li><li>アンサンブル画像にPALM画像を比較。 <ol><li>それから再セントロ4.4のようですが、150×150 nmの画素と250nmに等しい標準偏差を持つ平面上のID位置。これは回折限界、3.8（ 図3Aiii）で取得アンサンブル画像と比較するために使用することができ、回折限界像を模倣PALM画像を生成する。 </li><li>検出された分子は、全人口の代表的なものであることを確認するには、両方のイメージが同じような形状の構造を示していることを確認するために実験的なアンサンブル蛍光画像（ 図3Aii、ステップ3.8）を用いて再構成されたアンサンブル画像（ 図3Aiii、ステップ4.5.1）を比較、向きや相対強度。 </li></ol></li></ol> [5]注意：最低限必要なローカリゼーションの精度が指定されているサンプルのためにすべての分子の精度をプロットして、適切なカットオフを選択することにより、各撮像法について経験的に決定した。 5。 PALM画像解析<ol><li> Z-リングWidtを測定hと直径。 <ol><li>なるように垂直に配向し、細胞の長軸方向（ 図4A）にPALM画像を回転させます。 </li><li> Z-リングを含む細胞外領域の作物。 </li><li>細胞の長軸に沿った強度分布を投影することによって累積強度を計算します。 </li><li>ガウス分布に強度プロファイルに適合。リング幅はフィットガウス分布（ 図4B）の半値全幅（FWHM）として定義されています。 </li><li>セルの短軸に沿って5.1.2の累積強度プロファイルを投影。リング径は強度プロファイルの全長（ 図4C）として定義されています。 </li></ol></li><li> （注＃6を参照）FtsZ密度をプロットする。 <ol><li> （4.4）のように重心位置を再プロットが、それぞれのユニークな分子が1の値を与えられ、その重心位置に対応する単一の画素に割り当てられるようガウシアンプロファイルなし。このように、各々の強度のピクセルは、そのピクセルで検出分子の総数を表します。密度PALM画像も等高線図（ 図5E）として可視化することができる。 </li></ol></li><li>空間分解能を決定する。 <ol><li>理論的に達成可能な空間分解能：検出されたすべての分子の平均決定ローカリゼーション精度を使用して、すべてのサンプルで代表PSFを作成し、半値幅（式第3）を計算します。 </li><li>実験的に達成された空間分解能：同じ分子の繰り返し観測間の平均変位を計算します。 </li></ol></li></ol> [6]注：我々は、細胞/ガラス界面上記の薄層（〜200 nm）の活性化と励起を制限するために、内部全反射パーム（TIR-PALM、 図1および図5）を用いた。カバースリップに近い膜に関連付けられている唯一のFtsZ分子が検出されるようにします。

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	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

PALMのイメージは、他の手段によって達成することは困難である標的タンパク質分子の分布および配置の詳細な分析を可能にする、セル内の分子数と位置に関する情報が含まれています。以下では、PALM画像の生物学的関連性を維持しながら、正確な定量的情報を抽出するために取られるべきである注意事項を概説しています。我々はまた、最高のライブ対固定された細胞を用いて得ることが?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 50×MEMアミノ酸</td><td>シグマ</td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100×MEMビタミン</td><td>シグマ</td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td>メディアテック</td><td> 46から102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td>電子Micrsocopyサイエンス</td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTGアガロース</td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50nmのゴールドビーズ</td><td>ミクロス-ナノスフェア</td><td> 790113-010 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2イメージング商工会議所</td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステージアダプター</td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NAは、60倍対物</td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCDカメラ</td><td>アンドール·テクノロジー</td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488 nmのサファイアレーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561 nmのサファイアレーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405 nmのCUBEのレーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

細菌の細胞分裂がmidcell 1,2で10以上必須タンパク質の協調アセンブリが必要です。このプロセスの中心には、分割計画3,4においてFtsZタンパク質によるリング状の上部構造（Z-リング）の形成である。 Z-リングは、複数の一本鎖FtsZのプロトフィラメントで構成されており、Z-リングの内側プロトフィラメントの配置を理解する力発生器5,6のように、Z-リングアセンブリとその機能のメカニズムへの洞察を提供します。この情報は、従来の蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で起因する電流制限にとらえどころのない推移している。従来の蛍光顕微鏡は、光の回折限界（〜200 nm）に起因し、Z-リングの高解像度の画像を提供することができません。電子cryotomographicイメージングは小さなCに散在FtsZのプロトフィラメントが検出されましたcrescentusセル 7が、そのようなのようなより大きなセルに適用することは困難である大腸菌または B 枯草 。ここでは、定量的にEの構造組織を特徴づけるために超解像蛍光顕微鏡法、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）のアプリケーションを記述する大腸菌 、Z-リング8。 PALMイメージングは​​、高空間分解能（〜35 nm）と標的タンパク質の明確な識別を可能にするために、特定のラベルの両方を提供しています。我々は405nmの9時に起動したときに赤色蛍光（励起= 561 nm）に緑色蛍光（励起= 488 nm）から切り替える光活性化蛍光タンパク質mEos2とFtsZのラベルが付いた。やし実験中、シングルFtsZ-mEos2分子は確率的に活性化され、単一分子の対応する重心位置が&lt;20 nmの精度で決定されます。 Z-リングの超解像は、すべての検出されたFtsZ-mEos2分子の重心位置を重ね合わせて再構築さ​​れます。 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;この方法を用いて、我々は、Z-リングが〜100nmの固定幅を持っており、三次元的に互いに重ならFtsZのプロトフィラメントの緩い束で構成されていることがわかった。これらのデータは、Z-リング10の細胞周期依存性の変化のさらなる調査のための足がかりを提供し、関心のある他のタンパク質に適用することができます。

図3Aivに示すが、上述のPALMイメージング法から生成Z-リングの二次元、超解像レンダリングです。以下では、私たちがそれらから得られる定性的および定量的な情報を要約したものです。 定性的には、我々は、Z-リング（ 図3A-DIIと iv を比較）従来の蛍光画像では区別できないので、複数の構成（シングルバンドまたはヘ...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。

細菌分裂機械の超解像イメージング

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K ビュー.  The Johns Hopkins University School of Medicine. 我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。

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Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

細菌細胞の電子Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

生物学

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.