この方法は、タンパク質の局在化と光合成生物のダイナミクスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。超解像顕微鏡とフォトブラチ法を組み合わせることで、光合成生物のタンパク質ダイナミクスを極力詳細に検出することができます。この方法は、プロクロロコッカスのタンパク質ダイナミクスに関する洞察を提供するだけでなく、
また、ラジオ再ドップ歌とバクテロクロロフィルを含む他の多くの生物にも適用することができます。この手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるYanxin Liuです。まず、5ミリリットルの海水ベースのPro99培地を培養フラスコに加え、プロクロロコッカスMED4の1ミリリットルで接種します。
1平方メートルあたり35マイクロモル光子の強度を持つ光の下で摂氏23度でプロクロロコッカスを成長させます。5日後、培養液を1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットル回収する。培養液を固定するために、作りたてのホルムアルデヒドを100マイクロリットル加えます。
室温で暗闇の中で20分間インキュベートします。その後、13、500回Gで1分間サンプルをスピンダウンする。上清を取り除き、Pro99培地の100マイクロリットルで細胞を再懸濁します。
サンプルは、免疫染色を行う準備ができるまで暗闇の中で摂氏4度で保存します。まず、ポリスチレンビーズのバイアルを渦に入れる。50%エタノールを使用し、働くスラリーとして1対20,000希釈を調製する。
ホットプレートをオンにし、温度を摂氏120度に設定します。次に、ホットプレートにカバースリップを置きます。作業スラリー100マイクロリットルを各カバースリップに積み込み、ホットプレートのカバーリップを10分間インキュベートします。
その後、慎重に室温で保存するためにペトリ皿ビーズサイドにカバースリップを転送します。カバースリップをコーティングする準備ができたら、1つを取り出し、ビーズサイドアップであることを確認します。カバースリップの中央に1ミリグラム1ミリグラムの1ミリグラムの1ミリリットルをカバースリップの中心に加え、30分間室温に座らせます。
この後、ピペットを使用して、取り付けられていないポリL-リジンを慎重に吸引し、1.5ミリリットルのチューブに移します。後で使用するために摂氏4度でこのポリL-リジンを保存します。60ミリメートルのペトリ皿に10ミリリットルの超ろ過水でカバースリップを洗い流し、ペーパータオルで簡単に乾かします。
コーティングされたカバースリップを下部にパラフィルムを持つ新しいペトリ皿に移し、染色皿として使用します。固定サンプル100マイクロリットルをカバースリップに積み込み、30分間座らせてセルを取り付けます。次に、ペーパータオルを使用して残りの溶液を吸収し、カバースリップを12ウェルプレートのウェルに移して洗浄します。
PBSバッファーを1ミリリットルのウェルに加えてカバースリップを洗います。その後、PBSを取り出し、新鮮なPBSを1ミリリットル加え、カバースリップを2回洗います。ピペットを使用してPBSを取り除き、作りたてのパーメアビライゼーションバッファーの1ミリリットルに置き換えます。
37°Cで20分間、洗浄皿をインキュベートします。次に、パーメアビライズバッファーを除去します。新鮮なPBSバッファーを1ミリリットル加えて洗浄プロセスを開始します。
シェーカーの上に洗い物皿を置き、皿を5分間軽く混ぜます。この後、PBSを取り除き、洗浄工程を3回繰り返します。洗ったカバースリップを染色皿に移します。
カバースリップの上部に50マイクロリットルのブロッキングバッファを追加します。氷の上に全体の染色皿を置き、少なくとも60分間光漂白のためにキセノン光源の下に移動します。フォトブリーチとブロッキングの後、ペーパータオルの端を使用してブロッキングバッファを取り外します。
まず、抗FtsZ抗体の1マイクロリットルを99マイクロリットルのブロッキングバッファーに希釈します。希釈した一次抗体の50マイクロリットルをカバースリップに置き、室温で30分間インキュベートします。カバースリップを洗濯皿の井戸に移します。
洗浄を開始するには、PBSを1ミリリットル加えます。その後、洗う皿をシェーカーに移し、5分間軽く振ります。PBSを取り出し、洗浄プロセス全体を3回繰り返します。
次に、カバースリップを染色皿に移します。希釈した二次抗体の50マイクロリットルをカバースリップに置き、暗闇と室温で30分間インキュベートします。カバースリップを洗濯皿に戻します。
洗浄を開始するには、PBSを1ミリリットル加えます。洗浄皿をアルミニウム箔で包み、光から守ります。プレートをシェーカーに移し、5分間軽く振ります。
PBSを取り出し、洗浄プロセス全体を3回繰り返します。STORMイメージングの直前に、テキストプロトコルで概説されているように、イメージングバッファを1ミリリットル用意します。カバースリップをローディングチャンバーに積み込みます。
作りたてのイメージングバッファーを追加し、シアノバクテリア細胞を洗い流さないように穏やかです。この後、画像バッファーの上に長方形のカバースリップを置き、空気中の酸素と反応するのを防ぎます。カメラ、LEDライト、レーザーの電源を入れ、STORMソフトウェアを開きます。
レンズの上に浸漬油の半分の滴を追加します。チャンバーをロードし、対物レンズがカバースリップに接触していることを確認します。そして、750ナノメートルのレーザーで信号を調べます。
細胞と受託マーカーの両方を含むサンプル領域を特定します。次に、サンプルドリフト補正用のソフトウェアを起動します。カメラの電子乗算ゲインが300、露光時間が30ミリ秒の画像を基準として、1つのワイドファイル画像を取得します。
750ナノメートルの励起レーザー強度を平方センチメートルあたり約4.5キロワットに増加させます。蛍光ホルがまばらな点滅パターンに移行したら、33ヘルツで10,000フレームを収集して1つの超解像度画像を取得します。次に、テキスト プロトコルで説明されているように、生データから超解像度イメージを再構築します。
本研究では、STORMを用いて、個々のフォトスイッチ可能蛍光体をストカストに活性化させることで、超解像イメージングを達成する。すべての蛍光素の位置が記録され、これらの場所に基づいて超解像度の画像が構築されます。プロクロロコッカスの吸収スペクトルは447ナノメートルと680ナノメートルでピークを迎え、700ナノメートル以上の最小吸収を有するが、Prochlococcus MED4細胞は、STORMイメージングに必要な750ナノメートルレーザーの極めて高い強度にさらされたときに依然として高い自己蛍光を発する。
ここで説明した光漂白法を30分間使用した後、自己蛍光を有する細胞は数個も検出されているが、細胞の自己蛍光は減少することが分かる。60分に光漂白を伸長させると、大部分の細胞が自家蛍光を失う。これらの結果は、開発された光漂白法が光合成生物の自己蛍光を大幅に低減できることを示している。
フォトブリーチングの後、STORMは細胞内の細胞分裂タンパク質FtsZを視覚化するために使用されます。STORMを用いて、FtsZリングの詳細な形態が明らかになる。3D STORM 画像を回転させることにより、4 種類の形態、クラスタ、不完全なリング、完全なリング、およびダブル リングが特定されました。
光の強度とフォトブリーチの持続時間は、異なる生物によって異なる可能性があることを覚えておくことが重要です。その開発後、この方法は、タンパク質組織と光合成細胞の潜在的な機能を詳細に研究したい研究者のための道を開きます。
