著者は、彼女の技術支援のためのニーナファムに感謝します。この作品は、アメリカ心臓協会（12POST11920023）、およびNIH（K23DK088833、K23DK087859）によってサポートされていました。

このプロトコルは、コロラド州の複数の治験審査委員会（COMIRB）のガイドラインに従っています。 テストセッションのために1。準備<ol><li>参加者は、最も正確な測定のために、これらの制限に従う必要があります。薬から喫煙による食品やカフェインからの高速12時間、12時間の拘束運動から、12時間の拘束、該当する場合は、&gt; 4半減期拘束可能な場合（に可能でないかもしれませんこのようなCKD患者人口）、および閉経前の女性はホルモンの影響を最小限に抑えるために、月経周期の日数1-7にテストする必要があります。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の476.8ミリリットルにする2ミリリットルの0.5Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ヘパリン（180 USP単位/ mg）を0.05g、及びウシ血清アルブミンを2.5gを添加して解離緩衝液を500mlを調製7.4のpH。これは、数ヶ月間、4℃で保存することができる。 </li><li>超音波、コンピュータ、および非侵襲血行動態をオンにするワークステーション（NIHem、動脈硬化装置）。ケーブルは、コンピューターR波トリガーボックスに超音波を出力に接続します。 </li></ol>血管内皮細胞の2。収集および処理<ol><li>訓練を受けた看護師や医師がコレクションを実行（2.2から2.5、2.7ステップ）、および研究者は、ワイヤを収集し、処理します（2.6、2.8から2.19ステップ） </li><li>準備局所消毒薬と肘サイト、止血帯を適用し、静脈を見つけ、18のGカテーテルとカニューレを挿入する。 IVの端にheplockアダプタを配置します。 </li><li>滅菌手袋を着用し、サイト上での滅菌有窓ドレープを置く。 </li><li>ドレープに2点のワイヤを配置します。両方のワイヤから「J」形状を解くために「J」の弧を引く。 </li><li> heplockを暴露すると静脈約8センチメートルに、J-ワイヤーを養う。ワイヤーを取り外す前に、前後に数回押してください。ワイヤ上の総血を避けてください。 </li><li>彼らは内に収まるように配線を切り取るためにワイヤーカッターを使用解離緩衝液約30 mlを入れた50mlコニカルチューブ</li><li>第2のワイヤについて、手順2.5。 </li><li>第2のワイヤについて、手順2.6。ウェットラボにチューブを返します。 </li><li>ピンセットでワイヤーを留め金、チューブの内側に電線を保持するが、溶液上。 10分間、繰り返し50ミリリットルコニカルチューブから解離緩衝液を収集するために、電動ピペッターを使用して、チューブにワイヤーから余分な液体を振り払う、その後、ワイヤーをすすぎ、振動さのワイヤの長さに沿って実行されますので、それを解放します。 </li><li> 400 XG、4℃で7分間遠心</li><li> 100ミリリットルホルムアルデヒド溶液+ 900ミリリットルのPBSを組み合わせることにより、ホイルカバーチューブ内のホルムアルデヒド溶液を調製する。 </li><li>ゆっくりと、遠心分離器からチューブを取り外し、真空ポンプの電源を入れ、吸引ホースの先端にピペットチップを配置し、 ペレットを乱すことなく 、残りをオフに掃除、チューブ内〜400ミリリットルにしておきます。 </li><li>箔ピペットを1mlのホルムアルデヒド溶液で覆うにサンプルを固定するためのチューブ。再懸濁されない。室温で10分間インキュベートする。 </li><li>件名と研究訪問情報で標識し、PAPペンで各スライドに楕円形を描画することで8スライドを準備します。 </li><li> 15ミリリットルのPBS、再懸濁を追加し、400×gで5分間遠心分離し、4℃ </li><li>繰り返しステップ2.15、12ミリリットルのPBS、再懸濁を追加し、400×gで6分間遠心し、4℃ </li><li>ゆっくりと、遠心分離器からチューブを取り外し、真空ポンプの電源を入れ、吸引ホースの先端にピペットチップを配置し、 ペレットを乱すことなく 、残りをオフに掃除、チューブ内〜2ミリリットルを残す。 </li><li>均等に楕円形の地域で8スライド全体で再懸濁し、ピペット。 </li><li> 5時間、37℃のインキュベーター内で配置し、（サンプルは、長年の罰金となります）分析の準備ができるまで-80℃で保存する。 </li></ol>口蹄疫BAおよびaPWVの3。評価<ol><li>使い捨てショーツに研究課題の変更があり、時間があるIM /静かで薄暗い、気候制御された部屋で彼女の嘘仰臥位。 </li><li>適切な特定の超音波および動脈硬化装置のための心電図の数（この手順は、非侵襲的血行動態Workstationは[NIHem] 4の電極を必要とする動脈硬化を測定するために使用しています）、および主題の血圧カフを配置します。 </li><li> 20分後、血圧の読みを開始する。少なくとも3を実行し、測定は5 mmHgの範囲内になるまで繰り返し、各読み取りの間に2分休止。 </li><li>上腕動脈パルスを触診し、ソフトウェアプログラムを使用して上腕波形を記録するために眼圧計を配置することにより、眼圧測定を開始する。 </li><li>ラジアル大腿及び頸動脈のために繰り返します。 </li><li>巻尺（上腕、半径方向および頸動脈）やカスタム定規/キャリパー（大腿骨）を使用してsupersternalノッチから、これらの各サイトとの距離を測定します。 </li><li>ソフトウェアプログラムを使用して頸動脈 - 上腕、頚動脈ラジアル、および頸動脈 - 大腿（aPWV）を計算します。 </li><li>場所モードをトリガするように設定血管ソフトウェアと肘頭処理およびレコードのベースライン上腕動脈の超音波画像および血流速度測定値の少なくとも10個の心周期のすぐ遠位前腕血圧カフ。機械式アームは、必要に応じて超音波プローブを安定するために使用することができる。 </li><li> 250 mmHgのに前腕血圧カフを膨張させ、タイマーを開始します。非常にまだ残っているため、参加者に指示する。 </li><li>タイマが午前4時45分を読み取るときのモードをトリガするために、血管のソフトウェアを設定して記録速度を開始します。トリガーは、午前5時00分にカフを解放し、時計は午前5時10分を読み込むとき、Bモード（直径）の画像を記録するために、超音波を変更してください。 </li><li>時計は7時を読み取るまで録画を継続する。 </li><li>レコードモードをトリガするように設定血管ソフトウェアベースライン上腕動脈の超音波画像の少なくとも10の心臓サイクル。 </li><li>対象の血圧を取る。収縮期血圧&gt; 100 mmHgの場合は、件名の下に舌下ニトログリセリンの0.4 mgのプレース＆＃39;舌、患者が他の禁忌がない限り、タイマーを開始します。 </li><li>クロックモードをトリガするように設定血管ソフトウェアで3:00読み取るときB-モード（直径画像）を記録し始める。 </li><li>時計が8時を読み込む際に、録音を停止します。 </li><li>それがベースラインに戻るまで、血圧を監視する</li></ol> 4。ヒト臍帯静脈内皮細胞を調製する（HUVEC）コントロールスライド<ol><li>流路5-6にHUVECを伸ばして約80％の集密度。 </li><li> 3トリプシンmlまたはどんなお料理/フラスコのために必要であるとトリプシン処理。 </li><li>トリプシン中和液に等量のを使用してトリプシンを中和する。 </li><li> 〜5分間200×gで遠心分離し、真空によってトリプシン中和液を除去。 </li><li>洗う〜10mlのPBSに再懸濁。 </li><li> 〜5分で200×gで遠心します。 PBSを除去します。 </li><li> PBSを削除し、1800μLのPBS + 200μlのホルムアルデヒドで固定します。 </li><li> PBSに再懸濁し（約10 ml）を加えた。 </li><li> 200×gで遠心します〜5分。 PBS、スライドあたり〜200μLを追加するには、適切な量の再懸濁を削除します。 </li><li> -80℃で保存したスライドは、分析の準備ができるまで（サンプルは、多くの年の罰金になります）。 </li></ol>血管内皮細胞の5。染色<ol><li> -80℃の冷凍庫からスライドしてください（この手順では、1 HUVECコントロールスライドを含め、10のスライドのバッチのためである）を、室温で5分間待ってください。 </li><li>繊細な作業に余分な水分を乾いた布で拭き取ってください（スライドの中央には手を触れないでください）​​拭きます。 </li><li>水和物-REスライド各スライドに変更されたPBSを加えることで、10分間置いておく。 </li><li>スライドが立っているが、5％ロバ血清や他のソリューションを用意します。 <ol><li>最大10のスライドの（7.4のpHに）変更されたのPBS 5700μlにロバ血清を300μlを加えることにより、5％ロバ血清を準備します（詳細については、この量を増加させる）。 </li><li> 5％血清を1,000μlの目的の一次抗体を希釈する。例えば、ニトロチロシンおよびNADPHオキシダーゼ（1:300および1:1,500）は、酸化ストレスのマーカーとして使用することができる。 </li><li> 5％の血清の1500μllにAF568の5μLを希釈することにより、二次AF568を準備します。 </li><li>準備の2液を希釈することによりVEカドヘリン、5％血清の千μlにカドヘリンを見る。 </li><li> 5％の血清千μlにカドヘリンをVEの5μLを希釈することによりAF488を準備します。 </li><li>プロセス全体を通して、箔の下カドヘリン及びAF488 VE、AF568を維持して、スライドを準備しながら4℃の冷蔵庫内にロッカー上に置きます。 </li></ol></li><li>再水和の10分後に、繊細なタスクのドライスライドは拭いてください。 </li><li> 60分間、5％ロバ血清を追加し、化学物質の完全なカバレッジを確保するために丸で囲んだ領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置します。 </li><li>繊細な作業にプラスチックパラフィンフィルムとドライスライドを捨てる拭きます。 洗浄しないでください 。 60分間、一次抗体を追加し、確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置化学を完全にカバー。 </li><li>噴霧ボトルから変更されたPBSで洗浄し、5分間のスライドの列に浸し、プラスチックパラフィンフィルムを破棄。スライドを浸漬している間、暗い部屋に移動します。すべての残りのステップを暗所で働いています。 </li><li>キムワイプドライスライドは、45分間AF568（二次抗体）を追加し、化学物質の完全なカバレッジを確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置します。光からカバーしています。 </li><li>バイオハザード廃棄物容器内のプラスチックパラフィンフィルムを破棄。噴霧ボトルから変更されたPBSですすぎ、その後、5分間の列に浸します。 </li><li>キムワイプドライスライドは、その後60分間カドヘリンをVE、化学の完全なカバレッジを確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置追加。光からカバーしています。 </li><li>バイオハザード廃棄物容器内のプラスチックパラフィンフィルムを破棄。噴霧ボトルから変更されたPBSですすぎ、その後、5分間の列に浸します。 </li><li>ドライスライド繊細な作業では、30分間のAF488を追加し、化学物質の完全なカバレッジを確保するために円で囲まれた領域の上にプラスチック製のパラフィンフィルム片を配置し、拭いてください。光からカバーしています。 </li><li>バイオハザード廃棄物容器内のプラスチックパラフィンフィルムを破棄。噴霧ボトルから変更されたPBSですすぎ、その後、5分間の列に浸します。 </li><li>繊細なタスクドライスライドワイプやスライドを20分間乾燥させます。光からカバーしています。 </li><li>各スライドに4媒体を装着するだけfluoroshield一滴 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール塩酸塩（DAPI）を追加し、カバースリップそれぞれを覆う。 </li><li>ホイルで覆われた4℃の冷蔵庫にスライドを置きます。イメージングは​​、48時間以内に完了する必要がある。 </li></ol> 6。イメージングおよび血管内皮細胞の分析<ol><li>具体的な顕微鏡の仕様に合わせて染色した内皮細胞を画像化するための顕微鏡を準備します。シングル盲目技術者は、バットのための任意の特定のタンパク質を分析する必要があります細胞のCH。 </li><li>体系的にスライドをスキャンします。カドヘリンをVEおよびDAPIのポジティブ染色により、核の完全性を確認するための陽性染色により内皮細胞を識別します。 </li><li>後の分析のためにスライドあたりの画像30細胞。 HUVECを含め、染色されたバッチ内の各スライドについて、この手順を繰り返します。 </li><li>定性的なソフトウェアを使用して、目的の一次抗体の染色の強さを分析する。 </li><li>異なる染色セッション、HUVECにおける同じタンパク質の発現に収集内皮細胞におけるタンパク質発現の比として報告する値の間の強度の染色における差異の可能な交絡効果を最小限にするために。 </li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

FMD BAとaPWVための正確な結果を得ることは、それぞれ、高品質の超音波画像および圧力波形を取得することが必要である。これの中心は、オペレータ44による各手法の適切かつ継続的なトレーニングと使用することである。また、テストセッション（ 例えば 、前に12時間の速い、気候制御室など ）44,45を標準化することによって、可能な結果に影響を与?...

慢性腎臓病（CKD）は、米国だけで1の人口の〜11.5％に影響を与え、大流行に達している公衆衛生上の大きな関心事である。 CKDの患者での心血管死亡または心血管イベントのリスクが大幅に一般集団2-4と比較して増加する。 CKDの患者は、従来の心血管危険因子の高い有病率を示すが、これは心血管疾患の彼らの発生率の増加（CVD）5の一部を説明しています。血管機能不全は、腎臓6-9の分野で増加した認識を得ることが重要非伝統的な心血管の危険因子である。 多くの変更は、おそらく最大の関心事のものの中に最も一般的に損なわれる内皮依存性拡張（EDD）と、LAの補強として評価され、血管内皮機能障害の開発である、動脈機能不全の発展に貢献しながら、RGE弾性動脈10。様々な技術が、EDDと大きな弾性動脈の硬さを評価するために存在するが、最も一般的に使用され、それぞれ、上腕動脈の流れ依存性血管拡張反応FMD BAおよび大動脈脈波速度（aPWV）です。 EDDを評価するための別の一般的に使用される技術は、例えば静脈閉塞プレチスモグラフィー11,12を用いて、アセチルコリンなどの薬理学的薬剤に対する前腕血流応答を測定する。ただし、この方法論は、口蹄疫BAよりも侵襲的であり、CKD患者では禁忌である上腕動脈のカテーテル挿入を必要とします。これはのように広く使われているかaPWV 13などの臨床的エンドポイントで検証されていないが、動脈硬化を評価するための代替技術は、頸動脈のローカル動脈コンプライアンス（剛性の逆数）を測定することです。 CKDの患者は、損なわれた口蹄疫BA 14から16と増加し、大動脈脈波速度aPの両方を実証WV 13,17,18、前であっても、透析を必要とする。重要なことは、臨床的観点から、血管機能不全のこれらの非侵襲的措置の両方がCKDを19〜21の患者では、だけでなく、他の人口22〜26の両方の将来の心血管イベントおよび死亡率の独立した予測因子である。これらの技術は、CKDの患者を含め、CVDのリスクのある様々な集団を研究に適用することができます。 動脈機能不全は、CKDに発症する正確なメカニズムは完全には理解され;しかし、減少した一酸化窒素（NO）の生物学的利用能は、重要な貢献者27〜30及び減損EDD両方の共通のメカニズムと増加動脈硬化10,31です。 CKDにおいて、酸化ストレスが増加し、NO生物学的利用能32-34の低減に寄与する。酸化ストレスは、抗酸化防御に対して反応性酸素種（ROS）の過剰な生物学的利用能として定義される。生理的刺激株式会社炎症性シグナリングをluding、酸化剤酵素系を促進するスーパーオキシドアニオン（O 2● - ）を含め、ROSを生成する（ 例えば 、酸化酵素NADPHオキシダーゼ。）35。スーパーオキシドの産生は、最終的に一酸化窒素（NO）の生物学的利用能を減少させるために導く。 内皮機能障害は、入射CKD 36の独立した予測因子であるように今度は、CKDの発展に貢献するかもしれない、NO生物学的利用能が損なわれていない。これは、eNOSの阻害は、高血圧（全身性および糸球体）、糸球体虚血、糸球体硬化症、尿細管間質性、および損傷37を誘導することを示す動物データと一致する。実際には、NO生物学的利用能は、人間のCKD 38,39の内皮機能不全のために重要な役割を示唆し、人間の病気を模倣実験的腎疾患の発症および進行のために必要な表示されません減少した。 血管の酸化ストレスのマーカーはVで評価することができるもともとコロンボら 40によって開発され、シールら 41-43改変技術を用いて、ヒト研究対象から採取した内皮細胞をascular。 2滅菌Jワイヤを用いて、細胞は、肘正中静脈から採取回収し、固定し、後で正に内皮細胞と同定し、免疫蛍光を用いて目的のタンパク質の発現について分析する。 私たちは、口蹄疫BAを測定する）、ここに使用することができ、この方法論の議論を提供する; B）aPWVを測定する。 c）の酸化ストレスのマーカーの血管内皮細胞のタンパク質発現を測定する。焦点は、慢性透析を必要としない、CKDの患者である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:244px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">J-wire</td>
			<td style="width:109px;">St. Jude</td>
			<td style="width:244px;">404584</td>
			<td>2 per collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Disposable shorts (MediShorts)</td>
			<td>Quick Medical&#160;</td>
			<td>4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem)</td>
			<td style="width:109px;">Cardiovascualr Engineering</td>
			<td style="width:244px;">N/A</td>
			<td>Includes custom ruler.&#160; An alternate system is the Sphygmocor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ultrasound</td>
			<td style="width:109px;">G.E.</td>
			<td>Model: Vivid7 Dimension</td>
			<td>We use a G.E., but there are many companies and models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vascular software (Vascular Imager)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Medical Imaging Applications</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">R-wave trigger box</td>
			<td style="width:109px;">Medical Imaging Applications</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Rapid Cuff Inflation System</td>
			<td style="width:109px;">Hokanson</td>
			<td style="width:244px;">Model: Hokanson E20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Forearm blood pressure cuff</td>
			<td style="width:109px;">Hokanson</td>
			<td style="width:244px;">N/A</td>
			<td>custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HUVECs</td>
			<td style="width:109px;">Invitrogren&#160;</td>
			<td>C-015-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:109px;">Jackson&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Pap pen</td>
			<td style="width:109px;">Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">VE Cadherin</td>
			<td style="width:109px;">Abcam</td>
			<td style="width:244px;">ab33168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">AF568</td>
			<td style="width:109px;">Life Technologies</td>
			<td>A11011</td>
			<td>depends on specifications of microscpe&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">AF488</td>
			<td style="width:109px;">Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>depends on specifications of microscpe&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Nitrotyrosine antibody&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Abcam</td>
			<td>ab7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NADPH oxidase antibody</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Vector</td>
			<td style="width:244px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Delicate task wipe (Kimwipe)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic paraffin film (parafilm)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Olympus&#160;</td>
			<td>Model: FV1000 FCS/RICS</td>
			<td>many options exist&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of vascular function in patients with chronic kidney disease

慢性腎臓病（CKD）を有する患者は、有意に、一般集団と比較して、心血管疾患（CVD）のリスクが増加し、これは部分的にのみ従来のCVD危険因子によって説明される。血管機能不全は、血管内皮機能障害（最も一般的に減損内皮依存性拡張[EDD]として評価さ）と大きな弾性動脈の硬直が特徴の重要な非伝統的な危険因子です。様々な技術がEDDと大きな弾性動脈剛性を評価するために存在するが、最も一般的に使用される上腕動脈流依存性血管拡張反応（FMD BA）及び大動脈の脈波速度（aPWV）である。血管機能不全のこれらの非侵襲的措置の両方を持つと腎臓疾患のない患者では、将来の心血管イベントの独立した予測因子である。 CKDの患者は両方の障害をFMD BAを発揮し、aPWVを増加させた。しばらくする正確なメカニズムは、血管機能不全DEVECKDでのLOPは完全には理解され、増加した酸化ストレスおよび一酸化窒素（NO）の生物学的利用能におけるその後の低下が重要な要因である。酸化ストレスの細胞変化は、肘正中静脈から血管内皮細胞を採取し、免疫蛍光法を用いて酸化ストレスのマーカーのタンパク質発現を測定することによって評価することができる。ここではFMD BA、aPWV、および血管内皮細胞のタンパク質発現を測定するためのこれらの方法の議論を提供する。

FMD BAが反応性充血次上腕動脈の直径のピーク変化として定量化される。したがって、安静時の直径は、5分間血圧カフ閉塞期間（ 図1）の端部以下の直径と比較される。パネルAは、上腕動脈の代表的な超音波画像を示しており、市販のソフトウエアを用いて得られたパネルBは、以下の2分のカフから放出直径がR波ゲートさ変化のグラフを表示する。変更は（ 図1</stro...

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Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

血管機能不全および生理学的メカニズムに寄与する度合いは、上腕動脈流依存性血管拡張反応、大動脈の脈波速度、および血管内皮細胞のタンパク質発現を測定することにより、慢性腎疾患を有する患者で評価することができる。

慢性腎臓病患者における血管機能の評価

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.1K ビュー.  University of Colorado, Denver. 血管機能不全および生理学的メカニズムに寄与する度合いは、上腕動脈流依存性血管拡張反応、大動脈の脈波速度、および血管内皮細胞のタンパク質発現を測定することにより、慢性腎疾患を有する患者で評価することができる。 

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Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer's Disease

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic mild cognitive impairment (aMCI) and Alzheimer's disease (AD). Whereas behavioral data inform us about the patients' performance, ERPs allow us to record discrete changes in brain activity. Further, ERPs can give us insight into the onset, duration, and interaction of independent cognitive processes associated with memory retrieval. In patient populations, these types of studies are used to examine which aspects of memory are impaired and which remain relatively intact compared to a control population. The methodology for collecting ERP data from a vulnerable patient population while these participants perform a recognition memory task is reviewed. This protocol includes participant preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis. In addition to basic setup and acquisition, we will also demonstrate localization techniques to obtain greater spatial resolution and source localization using high-density (128 channel) electrode arrays.

Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer&#039;s Disease

The methodology for collecting high-density event-related potential data while patients with Alzheimer's disease perform a recognition memory task is reviewed. This protocol will include subject preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis.

アルツハイマー病患者における事象関連電位を用いたエピソード記憶の特性を調べる

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic ...

医学

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

多発性嚢胞腎疾患で、ヒトとマウスの染色体異常を研究するためにスペクトル核型分析

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this experiment, we demonstrate the administration of low-frequency repetitive TMS (rTMS) to an optimal stimulation site in the right hemisphere in patients with chronic non-fluent aphasia. A battery of standardized language measures is administered in order to assess baseline performance. Patients are subsequently randomized to either receive real rTMS or initial sham stimulation. Patients in the real stimulation undergo a site-finding phase, comprised of a series of six rTMS sessions administered over five days; stimulation is delivered to a different site in the right frontal lobe during each of these sessions. Each site-finding session consists of 600 pulses of 1 Hz rTMS, preceded and followed by a picture-naming task. By comparing the degree of transient change in naming ability elicited by stimulation of candidate sites, we are able to locate the area of optimal response for each individual patient. We then administer rTMS to this site during the treatment phase. During treatment, patients undergo a total of ten days of stimulation over the span of two weeks; each session is comprised of 20 min of 1 Hz rTMS delivered at 90% resting motor threshold. Stimulation is paired with an fMRI-naming task on the first and last days of treatment. After the treatment phase is complete, the language battery obtained at baseline is repeated two and six months following stimulation in order to identify rTMS-induced changes in performance. The fMRI-naming task is also repeated two and six months following treatment. Patients who are randomized to the sham arm of the study undergo sham site-finding, sham treatment, fMRI-naming studies, and repeat language testing two months after completing sham treatment. Sham patients then cross over into the real stimulation arm, completing real site-finding, real treatment, fMRI, and two- and six-month post-stimulation language testing.

We explore the use of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to improve language abilities in patients with chronic stroke and non-fluent aphasia. After identifying a site in the right frontal gyrus for each patient that responds optimally to stimulation, we target this site during ten days of rTMS treatment.

慢性非流暢失語症脳卒中患者における言語機能を改善するために反復経頭蓋磁気刺激の活用

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

高塩ダイエットとルイスラットにおける慢性腎臓病を誘発するために一酸化窒素合成酵素阻害と組み合わせた5/6thの腎摘出

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic conditions. As part of a diagnostic assessment, the early detection of postural deficits is important so that appropriate and targeted interventions can be prescribed. The Sensory Organization Test (SOT) on the EquiTest determines an individual&#39;s use of the sensory systems (somatosensory, visual, and vestibular) that are responsible for postural control. Somatosensory and visual input are altered by the calibrated sway-referenced support surface and visual surround, which move in the anterior-posterior direction in response to the individual&#39;s postural sway. This creates a conflicting sensory experience. The Motor Control Test (MCT) challenges postural control by creating unexpected postural disturbances in the form of backwards and forwards translations. The translations are graded in magnitude and the time to recover from the perturbation is computed.
Intermittent claudication, the most common symptom of peripheral arterial disease, is characterized by a cramping pain in the lower limbs and caused by muscle ischemia secondary to reduced blood flow to working muscles during physical exertion. Claudicants often display poor balance, making them susceptible to falls and activity avoidance. The Ankle Brachial Pressure Index (ABPI) is a noninvasive method for indicating the presence of peripheral arterial disease and intermittent claudication, a common symptom in the lower extremities. ABPI is measured as the highest systolic pressure from either the dorsalis pedis or posterior tibial artery divided by the highest brachial artery systolic pressure from either arm. This paper will focus on the use of computerized dynamic posturography in the assessment of balance in claudicants.

Individuals with intermittent claudication exhibit poor balance compared to healthy controls. Computerized dynamic posturography is an objective method for measuring an individual's postural responses to balance disturbances. This provides an objective reflection of the person&#x2019;s ability to respond to situations under which sensory stimuli are altered and unexpected perturbations occur.

間歇性跛行患者における姿勢制御評価のためのコンピュータ化されたダイナミックPosturography

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

慢性血栓塞栓性肺高血圧症とピグレットにおける右室機能の評価

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Semi-quantitative Assessment Using [18F]FDG Tracer in Patients with Severe Brain Injury

Patients with severe traumatic brain injury (sTBI) have difficulty knowing whether they are accurately expressing their thoughts and emotions because of disorders of consciousness, disrupted higher brain function, and verbal disturbances. As a consequence of an insufficient ability to communicate, objective evaluations are needed from family members, medical staff, and caregivers. One such evaluation is the assessment of functioning brain areas. Recently, multimodal brain imaging has been used to explore the function of damaged brain areas. [18F]-fluorodeoxyglucose positron emission tomography-computed tomography ([18F]FDG-PET/CT) is a successful tool for examining brain function. However, the assessment of brain glucose metabolism based on [18F]FDG-PET/CT is not standardized and depends on several varying parameters, as well as the patient&#39;s condition. Here, we describe a series of semiquantitative assessment protocols for a region-of-interest (ROI) image analysis using self-produced [18F]FDG tracers in patients with sTBI. The protocol focuses on screening the participants, preparing the [18F]FDG tracer in the hot lab, scheduling the acquisition of [18F]FDG-PET/CT brain images, and measuring glucose metabolism using the ROI analysis from a targeted brain area.

Semi-quantitative Assessment Using [18F]FDG Tracer in Patients with Severe Brain Injury

[18F]-fluorodeoxyglucose (FDG) positron emission tomography-computed tomography is useful for studying glucose metabolism related to brain function. Here, we present a protocol for an [18F]FDG tracer set-up and semiquantitative assessment of the region-of-interest analysis for targeted brain areas associated with clinical manifestations in patients with severe traumatic brain injury.

重症脳損傷患者 [18F] FDG トレーサーを用いた定量的評価

Patients with severe traumatic brain injury (sTBI) have difficulty knowing whether they are accurately expressing their thoughts and emotions because of ...

Interventional Diagnostic Procedure: A Practical Guide for the Assessment of Coronary Vascular Function

Approximately 40% of patients undergoing invasive coronary angiography for investigation of angina are found to have no obstructive coronary artery disease (ANOCA). Abnormal coronary function underlies coronary vasomotion syndromes including coronary endothelial dysfunction, microvascular angina, vasospastic angina, post-PCI angina and myocardial infarction with no obstructive coronary arteries (MINOCA). Each of these endotypes are distinct subgroups, characterized by specific disease mechanisms. Diagnostic criteria and linked therapy for these conditions are now established by expert consensus and clinical guidelines.
Coronary function tests are performed as an adjunctive interventional diagnostic procedure (IDP) in appropriately selected patients during coronary angiography. This aids differentiation of patients according to endotype. The IDP includes two distinct components: a diagnostic guidewire test and a pharmacological coronary reactivity test. The tests last approximately 5 minutes for the former and 10-15 minutes for the latter. Patient safety and staff education are key.
The diagnostic guidewire test measures parameters of coronary flow limitation (fractional flow reserve [FFR], coronary flow reserve [CFR], microvascular resistance [index of microvascular resistance (IMR)], basal resistance index, and vasodilator function [CFR, resistive reserve ratio (RRR)]).
The pharmacological coronary reactivity test measures the vasodilator potential and propensity to vasospasm of both the main coronary arteries and the micro-vessels. It involves intra-coronary infusion of acetylcholine and glyceryl trinitrate (GTN). Acetylcholine is not licensed for parenteral use and is therefore prescribed on a named-patient basis. Vasodilatation is the normal, expected response to infusion of physiological concentrations of acetylcholine. Vascular spasm represents an abnormal response, which supports the diagnosis of vasospastic angina.
The purpose of this practical guide is to provide information on the preparation and administration of the IDP in clinical practice. It discusses some key preparation and safety considerations, as well as tips for procedural success. The IDP supports stratified medicine for a personalized approach to health and wellbeing.

The purpose of this practical guide is to provide information on the preparation and administration of an interventional diagnostic procedure in clinical practice. It discusses some key preparation and safety considerations, as well as tips for procedural success.

介入診断手順:冠状血管機能の評価のための実用的なガイド

Approximately 40% of patients undergoing invasive coronary angiography for investigation of angina are found to have no obstructive coronary artery ...

Muscle Function Obtained with Motion Mode Ultrasound and Surface Electromyography during Core Endurance Exercise

Motion mode (M-mode) ultrasound allows researchers and clinicians to measure the change of muscle thickness across time. Muscle thickness can be measured between fascial borders at a given time point during an exercise. This selected time point produces a one-dimensional image resulting in real-time, live observation of anatomy. Ultrasound used during functional movement can be referred to as dynamic ultrasound; this is feasible and reliable with the use of a linear transducer, elastic belt, and foam block to secure consistent transducer placement. The lateral abdominal wall is commonly investigated using ultrasound due to the overlapping nature of the muscles. Surface electromyography (sEMG) can complement M-mode ultrasound imaging because it measures the electrical representation of muscle activation. There is minimal evidence using M-mode ultrasound and sEMG simultaneously during core exercise. Exercises that challenge the core musculature involve both isometric holds (e.g., side plank), as well as oscillatory extremity movements (e.g., dead bug). In this study, both instruments will be used simultaneously to measure core muscle function during exercise. Ultrasound measurements will be obtained using a linear transducer and ultrasound unit, and sEMG measurements will be acquired from a wireless sEMG system. To make comparisons between participants and exercises, normalization methods using static, exercise starting positions for both instruments will be used. An activation ratio will be used for ultrasound and calculated by dividing the contracted thickness (thickness during a time point of exercise) by the rested (starting position) thickness. Muscle thickness will be measured in centimeters from the superior inferior fascial border to inferior superior fascial border. These methods aim to offer an innovative and practical measurement of muscle function with M-mode ultrasound and sEMG during core endurance exercises.

This protocol uses motion mode ultrasound and surface electromyography simultaneously to measure muscle function of the core. Muscle thickness and activation of the local stabilizers (e.g., transverse abdominis, internal oblique) and global movers (e.g., external oblique) is achievable during specific time points of the side plank and dead bug exercises.

コア持久力運動中のモーションモード超音波と表面筋電図で得られる筋機能

Motion mode (M-mode) ultrasound allows researchers and clinicians to measure the change of muscle thickness across time. Muscle thickness can be measured ...