Gli autori ringraziano Nina Bispham per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (12POST11920023), e il NIH (K23DK088833, K23DK087859).

Questo protocollo segue le linee guida del Colorado multipla Institutional Review Board (COMIRB). 1. Preparazione per il test Session <ol><li> I partecipanti dovrebbero seguire queste restrizioni per misure più accurate: 12 hr veloce dal cibo e caffeina, 12 ore moderazione da esercizio fisico, 12 ore moderazione dal fumo, se del caso,&gt; 4 moderazione emivita dai farmaci, se possibile (potrebbe non essere fattibile in un popolazione come i pazienti con insufficienza renale cronica), e le donne in pre-menopausa dovrebbero essere testati in 1-7 giorni del ciclo mestruale per ridurre al minimo le influenze ormonali. </li><li> Preparare 500 ml di tampone di dissociazione aggiungendo 2 ml di 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,05 g di eparina (180 unità USP / mg) e 2,5 g di albumina di siero bovino a 476,8 ml di tampone fosfato salino (PBS) a pH di 7,4. Questo può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi. </li><li> Accendere ultrasuoni, computer e il emodinamico non invasivoWorkstation (NIHem; attrezzature rigidità arteriosa). Collegare i cavi in ​​uscita dalla ecografia alla scatola grilletto onda R computer. </li></ol> 2. Raccolta ed elaborazione di cellule vascolari endoteliali <ol><li> Un infermiere o un medico esperto esegue la raccolta (passi 2,2-2,5, 2.7) e un ricercatore raccoglie e tratta i fili (passi 2,6, 2,8-2,19) </li><li> Preparate il sito antecubitale con un antisettico topico, applicare un laccio emostatico, individuare vena, e cannulate con un catetere G 18. Posizionare un adattatore heplock sull&#39;estremità del IV. </li><li> Indossare guanti sterili e mettere teli sterili fenestrated sul sito. </li><li> Mettere 2 J-fili delle tende. Tirare l&#39;arco della &quot;J&quot; Srotolare la forma &quot;J&quot; di entrambi i fili. </li><li> Stappare la heplock e mangimi J-wire in vena di circa 8 centimetri. Spingere avanti e indietro diverse volte prima di rimuovere il filo. Evitare di sangue lordo sul filo. </li><li> Utilizzare tronchesi per tagliare i fili in modo da adattarsi in unProvetta conica da 50 ml contenente ~ 30 ml di tampone di dissociazione </li><li> Ripetere passo 2.5 per secondo filo. </li><li> Ripetere passo 2.6 per il secondo filo. Tubo di ritorno al laboratorio bagnato. </li><li> Stringere i fili con un paio di pinze e tenere i fili all&#39;interno del tubo, ma soprattutto la soluzione. Per 10 min, utilizzare un pipetter motorizzato per raccogliere ripetutamente il buffer dissociazione dalla provetta conica da 50 ml e rilasciarlo in modo che corre per tutta la lunghezza dei fili per risciacquare e vibrare i fili, quindi agitare il fluido in eccesso da fili nel tubo. </li><li> Centrifugare per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di formaldeide in un foglio coperto tubo unendo 100 ml di soluzione di formaldeide + 900 ml di PBS. </li><li> Rimuovere lentamente il tubo da centrifuga, accendere la pompa del vuoto, mettere un puntale sulla estremità del tubo di aspirazione e lasciare ~ 400 ml nella provetta, passare l&#39;aspirapolvere fuori il resto senza disturbare il pellet. </li><li> Coprire con un foglio e una pipetta 1 ml di soluzione di formaldeide inil tubo per fissare il campione. Non risospendere. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 8 scivoli, mediante l&#39;etichettatura con oggetto e informazioni visita di studio e disegnare un ovale su ogni vetrino con una penna pap. </li><li> Aggiungere 15 ml di PBS, risospendere e centrifugare per 5 minuti a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Ripetere il passaggio 2.15, aggiungere 12 ml di PBS, risospendere, e centrifugare per 6 min a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Rimuovere lentamente il tubo da centrifuga, accendere la pompa del vuoto, mettere un puntale sulla estremità del tubo di aspirazione e lasciare ~ 2 ml nella provetta, passare l&#39;aspirapolvere fuori il resto senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere e pipetta in modo uniforme le 8 diapositive nelle aree ovali. </li><li> Posto in incubatore a 37 ° C per 5 ore e poi conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi (campioni andrà bene per molti anni). </li></ol> 3. Valutazione della FMD BA e aPWV <ol><li> Avere ricerca sul cambiamento soggetto in bicchierini usa e getta e hanno him / lei supina si trovano in una zona tranquilla, dim, camera climatizzata. </li><li> Collocare il numero appropriato di ECG per l&#39;ecografia specifico e il dispositivo rigidità arteriosa (questa procedura utilizza la non invasiva emodinamico Workstation [NIHem] per misurare la rigidità arteriosa, che richiede 4 elettrodi), e la pressione sanguigna bracciale in materia. </li><li> Dopo 20 minuti, iniziare a valori di pressione sanguigna. Effettuare almeno 3, e ripetere fino a misure sono all&#39;interno di 5 mmHg, riposo 2 minuti tra ogni lettura. </li><li> Inizia tonometria palpando per il polso brachiale e mettendo il tonometro a registrare forme d&#39;onda brachiale utilizzando il programma software. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per le arterie radiali, femorali e carotidee. </li><li> Misurare la distanza da ognuno di questi luoghi dalla tacca supersternal utilizzando un metro a nastro (brachiale, radiale e carotideo) e righello custom / pinza (femorale). </li><li> Calcola carotide-brachiale, carotideo-radiale e carotidea-femorale (aPWV) utilizzando il programma software. </li><li> Luogosangue dell&#39;avambraccio polsino di pressione appena distale al processo olecranico e registrare almeno 10 cicli cardiaci di immagini ecografiche brachiale base e misurazioni della velocità del flusso sanguigno, con un software vascolare impostare la modalità per attivare. Un braccio meccanico può essere usato per stabilizzare la sonda ecografica se desiderato. </li><li> Gonfiare avambraccio bracciale della pressione arteriosa a 250 mmHg e cominciare timer. Istruire partecipante a rimanere molto ancora. </li><li> Inizia velocità di registrazione con una serie di software vascolare modalità per attivare quando il timer si legge 04:45. Rilasciare il grilletto il bracciale alle 5:00 e cambiare gli ultrasuoni per registrare B-mode (diametro) immagini quando l&#39;orologio segna 5:10. </li><li> Si effettua la registrazione fino a quando l&#39;orologio segna 7:00. </li><li> Record almeno 10 cicli cardiaci di base di immagini dell&#39;arteria brachiale ultrasuoni con software vascolare impostare la modalità di innescare. </li><li> Prendere la pressione del sangue del soggetto. Se la pressione arteriosa sistolica&gt; 100 mmHg, collocare 0,4 mg di nitroglicerina sublinguale sotto il soggetto &amp;# 39; s lingua e cominciare timer, a meno che il paziente ha un&#39;altra controindicazione. </li><li> Iniziare a registrare B-mode (immagini di diametro) quando l&#39;orologio segna 3:00 con il software vascolare impostare la modalità per attivare. </li><li> Interrompere la registrazione quando l&#39;orologio segna 8:00. </li><li> Monitorare la pressione sanguigna fino a tornare al valore iniziale </li></ol> Preparazione umano Vena ombelicale cellule endoteliali (HUVEC) vetrini di controllo 4. <ol><li> Crescere HUVECs al passaggio 5-6 e ~ 80% di confluenza. </li><li> Trypsinize con 3 ml di tripsina o tutto ciò che è necessario per il piatto / boccetta. </li><li> Neutralizzare tripsina usando un volume uguale di soluzione di tripsina neutralizzante. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 5 min ~ e rimuovere tripsina e soluzione neutralizzante da vuoto. </li><li> Risospendere in ~ 10 ml di PBS per lavare. </li><li> Centrifugare a 200 xg ~ 5 min. Rimuovere PBS. </li><li> Rimuovere PBS e fissare nel 1800 microlitri di PBS + 200 ml di formaldeide. </li><li> Risospendere in PBS (~ 10 ml). </li><li> Centrifugare a 200 xg ~5 min. Rimuovere PBS, risospendere in un volume adeguato di aggiungere ~ 200 microlitri per vetrino. </li><li> Conservare i vetrini a -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi (campioni andrà bene per molti anni). </li></ol> 5. Colorazione di cellule vascolari endoteliali <ol><li> Prendete le diapositive di -80 ° C freezer ed attendere 5 minuti a temperatura ambiente (questa procedura è per un lotto di 10 diapositive, tra cui uno scivolo di controllo HUVEC). </li><li> Eliminare l&#39;acqua in eccesso con un compito delicato wipe (non toccare il centro della slitta). </li><li> Re-idratare i vetrini aggiungendo alterata PBS a ogni diapositiva e lasciare per 10 min. </li><li> Mentre le diapositive sono in piedi, preparare del siero di asino 5% e altre soluzioni. <ol><li> Preparare siero asino 5% con l&#39;aggiunta di 300 ml di siero asino per 5.700 ml di PBS alterato (ad un pH di 7,4) per un massimo di 10 diapositive (aumentare questo importo per di più). </li><li> Diluire l&#39;anticorpo primario di interesse in 1,000 ml di siero 5%. Ad esempio, nitrotirosina e NADPHossidasi (1:300 e 1:1,500) potrebbero essere utilizzati come marcatori di stress ossidativo. </li><li> Preparare AF568 secondario diluendo 5 ml di AF568 a 1.500 μll di siero 5%. </li><li> Preparare VE caderina diluendo 2 ml di VE caderina a 1.000 ml di siero 5%. </li><li> Preparare AF488 diluendo 5 ml di VE caderina a 1.000 ml di siero 5%. </li><li> Tenere AF568, VE caderina e AF488 sotto un foglio attraverso l&#39;intero processo e quindi inserire il rocker a 4 ° C frigorifero durante la preparazione di vetrini. </li></ol></li><li> Dopo 10 min di reidratazione, scivoli asciutti con un compito delicato pulire. </li><li> Aggiungi siero asino 5% per 60 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica. </li><li> Eliminare la pellicola di paraffina plastica e scivoli asciutti con un compito delicato pulire. Non lavare. Aggiungere l&#39;anticorpo primario per 60 min e posizionare un pezzo di pellicola plastica paraffina sull&#39;area cerchiata garantirecopertura completa della chimica. </li><li> Eliminare il film di paraffina plastica, sciacquare con alterata PBS dalla bottiglia spruzzo e immergersi in colonne di scorrimento per 5 min. Mentre le diapositive sono ammollo, spostarli in una stanza buia. Lavorare al buio per tutti i passaggi rimanenti. </li><li> Diapositive a secco con Kimwipes, aggiungi AF568 (anticorpo secondario) per 45 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica. Coprire dalla luce. </li><li> Eliminare la pellicola di paraffina plastica nel contenitore per rifiuti biologici. Risciacquare con PBS alterato dalla bottiglia schizzo, e poi immergere in colonne per 5 min. </li><li> Diapositive a secco con Kimwipes, quindi aggiungere VE caderina per 60 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica. Coprire dalla luce. </li><li> Eliminare la pellicola di paraffina plastica nel contenitore per rifiuti biologici. Risciacquare con PBS alterato dalla bottiglia schizzo, e poi immergere in colonne per 5 min. </li><li> Diapositive a secco conun compito delicato wipe, aggiungi AF488 per 30 minuti e mettere un pezzo di pellicola di paraffina plastica sopra la zona cerchiata per garantire una copertura completa della sostanza chimica. Coprire dalla luce. </li><li> Eliminare la pellicola di paraffina plastica nel contenitore per rifiuti biologici. Risciacquare con PBS alterato dalla bottiglia schizzo, e poi immergere in colonne per 5 min. </li><li> Diapositive a secco con un compito delicato pulire e lasciare i vetrini ad asciugare per 20 min. Coprire dalla luce. </li><li> Aggiungere una goccia solo fluoroshield mezzo di montaggio con 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole cloridrato (DAPI) per ogni diapositiva e coprire ciascuna con una scivolata di copertura. </li><li> Porre i vetrini in 4 ° C frigorifero coperto con un foglio. Imaging deve essere completata entro 48 ore. </li></ol> 6. Imaging e analisi delle cellule vascolari endoteliali <ol><li> Preparare microscopio per l&#39;imaging cellule endoteliali colorate secondo le specifiche del microscopio specifico. Un unico tecnico cieco dovrebbe analizzare qualsiasi proteina particolare per un pipistrelloch di cellule. </li><li> Scansione di diapositive in modo sistematico. Identificare le cellule endoteliali dalla colorazione positiva per VE caderina e confermare l&#39;integrità nucleare colorazione positiva per DAPI. </li><li> Immagine 30 cellule per vetrino per la successiva analisi. Ripetere l&#39;operazione per ogni diapositiva nel batch macchiato, compreso il HUVEC. </li><li> Analizzare l&#39;intensità della colorazione per l&#39;anticorpo primario di interesse utilizzando un software qualitativa. </li><li> Per minimizzare il possibile effetto confondente di differenze di colorazione intensità tra diverse sessioni di colorazione, i valori del rapporto come rapporto di espressione proteica nelle cellule endoteliali raccolti alla stessa espressione proteica in HUVEC. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ottenere risultati accurati per l&#39;afta epizootica BA e aPWV richiede l&#39;acquisizione di immagini ecografiche di alta qualità e le forme d&#39;onda di pressione, rispettivamente. Al centro di questo è la formazione appropriate e continue e utilizzo di ogni tecnica dall&#39;operatore 44. Inoltre, è fondamentale per controllare a molte variabili esterne che possono influenzare i risultati possibili standardizzando la sessione di test (ad esempio, prima 12 hr veloce, camera climatizz...

Malattia renale cronica (CKD) è un importante problema di salute pubblica che ha raggiunto proporzioni epidemiche, che colpisce ~ 11,5% della popolazione nel solo 1 negli Stati Uniti. Il rischio di morte cardiovascolare o di un evento cardiovascolare nei pazienti con insufficienza renale cronica è significativamente aumentata rispetto alla popolazione generale 2-4. Anche se i pazienti con insufficienza renale cronica presentano un&#39;alta prevalenza di fattori tradizionali di rischio cardiovascolare, questo spiega solo una parte del loro maggiore incidenza di malattie cardiovascolari (CVD) 5. Disfunzione vascolare è un importante fattore di rischio cardiovascolare non tradizionale guadagnando maggiore riconoscimento nel campo della nefrologia 6-9. Mentre molte modifiche che contribuiscono allo sviluppo di disfunzione arteriosa, tra quelli di maggiore interesse sono lo sviluppo di disfunzione endoteliale vascolare, più comunemente valutata come deteriorato dilatazione endotelio-dipendente (EDD), e irrigidimento del laRGE arterie elastiche 10. Esistono varie tecniche per valutare EDD e rigidità delle grandi arterie elastiche, ma il più comunemente usato sono brachiale dilatazione flusso-mediata FMD BA e la velocità di propagazione dell&#39;onda aortica (aPWV), rispettivamente. Un&#39;altra tecnica comunemente usata per valutare EDD sta misurando avambraccio risposta il flusso di sangue ad agenti farmacologici come l&#39;acetilcolina mediante occlusione venosa pletismografia 11,12. Tuttavia, questa metodologia richiede il cateterismo dell&#39;arteria brachiale, che è più invasiva rispetto FMD BA e può essere controindicato nei pazienti con insufficienza renale cronica. Una tecnica alternativa per valutare la rigidità arteriosa è misurare la compliance arteriosa locale (l&#39;inverso della rigidezza) della carotide, anche se questo non è così ampiamente usato o convalidato con endpoint clinici come aPWV 13. I pazienti con insufficienza renale cronica dimostrano sia compromessa l&#39;afta epizootica BA 14-16 e una maggiore velocità di propagazione dell&#39;onda aortica aPWV 13,17,18, anche prima che necessitano di dialisi. Soprattutto dal punto di vista clinico, entrambe queste misure non invasive della disfunzione vascolare sono predittori indipendenti di futuri eventi cardiovascolari e mortalità sia in pazienti con CKD 19-21, così come in altre popolazioni 22-26. Queste tecniche possono essere applicate allo studio di diverse popolazioni a rischio di CVD, inclusi i pazienti con insufficienza renale cronica. I meccanismi esatti con cui la disfunzione arteriosa si sviluppa in CKD non sono completamente comprese; Tuttavia, l&#39;ossido di azoto ridotto (NO) biodisponibilità è un contributo critico 27-30 e un meccanismo comune di entrambi EDD compromessa e una maggiore rigidità arteriosa 10,31. In CKD, stress ossidativo è aumentato e contribuisce alla riduzione NO biodisponibilità 32-34. Lo stress ossidativo è definito come eccessivo biodisponibilità delle specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) relativi alle difese antiossidanti. Stimoli fisiologici, incLuding segnalazione infiammatoria, promuovere sistemi enzimatici ossidanti per la produzione di ROS, tra cui anione superossido (O 2 ● -) (ad esempio, l&#39;ossidante dell&#39;enzima NADPH ossidasi.) 35. Produzione di superossido conduce infine alla riduce biodisponibilità di ossido nitrico (NO). Alterata NO biodisponibilità può a sua volta contribuire allo sviluppo di CKD, come disfunzione endoteliale è un predittore indipendente di incidente CKD 36. Questo è coerente con i dati nell&#39;animale indicano che eNOS inibizione induce ipertensione (sistemica e glomerulare), ischemia glomerulare, glomerulosclerosi, e tubulo-interstiziale pregiudizio 37. Infatti, ridotto appare necessario NO biodisponibilità per lo sviluppo e la progressione della malattia renale sperimentale che imita la malattia umana, suggerendo un ruolo chiave per la disfunzione endoteliale in CKD umana 38,39. Marker di stress ossidativo vascolare possono essere valutati in vascular cellule endoteliali raccolti da soggetti umani di ricerca, utilizzando una tecnica originariamente sviluppata da Colombo et al. 40 e modificato Guarnizioni et al 41-43. Usando 2 sterili J-fili, le cellule sono raccolti dalla vena antecubitale, recuperate, fisso, e successivamente identificati come cellule endoteliali e analizzati per l&#39;espressione di proteine ​​di interesse mediante immunofluorescenza. Forniamo qui una discussione di questa metodologia che può essere utilizzata per a) misura FMD BA; b) misurare aPWV; c) misurare vascolare espressione proteica delle cellule endoteliali dei marcatori di stress ossidativo. L&#39;attenzione si concentra su pazienti con CKD, che non richiedono dialisi cronica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="736">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:244px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">J-wire</td>
			<td style="width:109px;">St. Jude</td>
			<td style="width:244px;">404584</td>
			<td>2 per collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Disposable shorts (MediShorts)</td>
			<td>Quick Medical&#160;</td>
			<td>4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem)</td>
			<td style="width:109px;">Cardiovascualr Engineering</td>
			<td style="width:244px;">N/A</td>
			<td>Includes custom ruler.&#160; An alternate system is the Sphygmocor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ultrasound</td>
			<td style="width:109px;">G.E.</td>
			<td>Model: Vivid7 Dimension</td>
			<td>We use a G.E., but there are many companies and models</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vascular software (Vascular Imager)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Medical Imaging Applications</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">R-wave trigger box</td>
			<td style="width:109px;">Medical Imaging Applications</td>
			<td>N/A</td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Rapid Cuff Inflation System</td>
			<td style="width:109px;">Hokanson</td>
			<td style="width:244px;">Model: Hokanson E20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Forearm blood pressure cuff</td>
			<td style="width:109px;">Hokanson</td>
			<td style="width:244px;">N/A</td>
			<td>custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HUVECs</td>
			<td style="width:109px;">Invitrogren&#160;</td>
			<td>C-015-5C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:109px;">Jackson&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Pap pen</td>
			<td style="width:109px;">Research Products International</td>
			<td>195505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">VE Cadherin</td>
			<td style="width:109px;">Abcam</td>
			<td style="width:244px;">ab33168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">AF568</td>
			<td style="width:109px;">Life Technologies</td>
			<td>A11011</td>
			<td>depends on specifications of microscpe&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">AF488</td>
			<td style="width:109px;">Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td>depends on specifications of microscpe&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Nitrotyrosine antibody&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Abcam</td>
			<td>ab7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NADPH oxidase antibody</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>07-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Vector</td>
			<td style="width:244px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Delicate task wipe (Kimwipe)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic paraffin film (parafilm)&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Olympus&#160;</td>
			<td>Model: FV1000 FCS/RICS</td>
			<td>many options exist&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of vascular function in patients with chronic kidney disease

I pazienti con malattia renale cronica (CKD) hanno aumentato significativamente il rischio di malattia cardiovascolare (CVD) rispetto alla popolazione generale, e questo è solo parzialmente spiegata da fattori di rischio cardiovascolare tradizionali. Disfunzione vascolare è un importante fattore di rischio non tradizionale, caratterizzato da disfunzione endoteliale vascolare (più comunemente valutata come deteriorato endotelio-dipendente dilatazione [EDD]) e irrigidimento delle grandi arterie elastiche. Mentre esistono varie tecniche per valutare EDD e rigidità delle grandi arterie elastiche, il più comunemente utilizzati sono la dilatazione dell&#39;arteria brachiale flusso-mediata (FMD BA) e la velocità di propagazione dell&#39;onda aortica (aPWV), rispettivamente. Entrambe queste misure non invasive della disfunzione vascolare sono predittori indipendenti di eventi cardiovascolari futuri in pazienti con e senza malattia renale. I pazienti con insufficienza renale cronica dimostrano sia compromessa l&#39;afta epizootica BA, e aumento aPWV. Mentre gli esatti meccanismi mediante i quali disfunzione vascolare sviLops in CKD sono completamente compresi, aumento dello stress ossidativo e una conseguente riduzione di ossido nitrico (NO) biodisponibilità contribuiscono in modo rilevante. Cambiamenti cellulari a stress ossidativo possono essere valutate attraverso la raccolta di cellule endoteliali vascolari dalla vena antecubitale e misurando l&#39;espressione di proteine ​​marker di stress ossidativo mediante immunofluorescenza. Forniamo qui una discussione di questi metodi per misurare l&#39;afta epizootica BA, aPWV e vascolari espressione della proteina delle cellule endoteliali.

FMD BA è quantificato come la variazione di picco di diametro dell&#39;arteria brachiale seguente iperemia reattiva. Così, il diametro a riposo viene confrontato al diametro successivo alla fine di un periodo di 5 min sfigmomanometro occlusione (Figura 1). Pannello A mostra un&#39;immagine rappresentativa ecografia dell&#39;arteria brachiale, quindi su Pannello B mostra un grafico del onda R cambiamento gated di diametro dalla versione bracciale a 2 minuti dopo, come ottenuto utilizzando il...

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Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Il grado di disfunzione vascolare e contribuendo meccanismi fisiologici può essere valutata in pazienti con malattia renale cronica, misurando brachiale dilatazione dell&#39;arteria flusso-mediata, velocità di propagazione dell&#39;onda aortica e vascolare espressione della proteina delle cellule endoteliali.

Valutazione della funzione vascolare nei pazienti con malattia renale cronica

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.1K Views.  University of Colorado, Denver.  Il grado di disfunzione vascolare e contribuendo meccanismi fisiologici può essere valutata in pazienti con malattia renale cronica, misurando brachiale dilatazione dell'arteria flusso-mediata, velocità di propagazione dell'onda aortica e vascolare espressione della proteina delle cellule endoteliali. 

Video: Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer's Disease

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic mild cognitive impairment (aMCI) and Alzheimer's disease (AD). Whereas behavioral data inform us about the patients' performance, ERPs allow us to record discrete changes in brain activity. Further, ERPs can give us insight into the onset, duration, and interaction of independent cognitive processes associated with memory retrieval. In patient populations, these types of studies are used to examine which aspects of memory are impaired and which remain relatively intact compared to a control population. The methodology for collecting ERP data from a vulnerable patient population while these participants perform a recognition memory task is reviewed. This protocol includes participant preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis. In addition to basic setup and acquisition, we will also demonstrate localization techniques to obtain greater spatial resolution and source localization using high-density (128 channel) electrode arrays.

Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer&#039;s Disease

The methodology for collecting high-density event-related potential data while patients with Alzheimer's disease perform a recognition memory task is reviewed. This protocol will include subject preparation, quality assurance, data acquisition, and data analysis.

Esaminando le caratteristiche della memoria episodica con potenziali evento-correlati nei pazienti con malattia di Alzheimer

Our laboratory uses event-related EEG potentials (ERPs) to understand and support behavioral investigations of episodic memory in patients with amnestic ...

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Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

Cariotipo spettrale allo studio anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia del rene policistico

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this experiment, we demonstrate the administration of low-frequency repetitive TMS (rTMS) to an optimal stimulation site in the right hemisphere in patients with chronic non-fluent aphasia. A battery of standardized language measures is administered in order to assess baseline performance. Patients are subsequently randomized to either receive real rTMS or initial sham stimulation. Patients in the real stimulation undergo a site-finding phase, comprised of a series of six rTMS sessions administered over five days; stimulation is delivered to a different site in the right frontal lobe during each of these sessions. Each site-finding session consists of 600 pulses of 1 Hz rTMS, preceded and followed by a picture-naming task. By comparing the degree of transient change in naming ability elicited by stimulation of candidate sites, we are able to locate the area of optimal response for each individual patient. We then administer rTMS to this site during the treatment phase. During treatment, patients undergo a total of ten days of stimulation over the span of two weeks; each session is comprised of 20 min of 1 Hz rTMS delivered at 90% resting motor threshold. Stimulation is paired with an fMRI-naming task on the first and last days of treatment. After the treatment phase is complete, the language battery obtained at baseline is repeated two and six months following stimulation in order to identify rTMS-induced changes in performance. The fMRI-naming task is also repeated two and six months following treatment. Patients who are randomized to the sham arm of the study undergo sham site-finding, sham treatment, fMRI-naming studies, and repeat language testing two months after completing sham treatment. Sham patients then cross over into the real stimulation arm, completing real site-finding, real treatment, fMRI, and two- and six-month post-stimulation language testing.

We explore the use of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to improve language abilities in patients with chronic stroke and non-fluent aphasia. After identifying a site in the right frontal gyrus for each patient that responds optimally to stimulation, we target this site during ten days of rTMS treatment.

Utilizzando la stimolazione magnetica transcranica ripetitiva per migliorare la funzione Language in pazienti con ictus con cronica non-fluente Afasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

5/6th nefrectomia in combinazione con dieta di sale e di ossido nitrico sintasi Inibizione di indurre la malattia renale cronica nel ratto Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic conditions. As part of a diagnostic assessment, the early detection of postural deficits is important so that appropriate and targeted interventions can be prescribed. The Sensory Organization Test (SOT) on the EquiTest determines an individual&#39;s use of the sensory systems (somatosensory, visual, and vestibular) that are responsible for postural control. Somatosensory and visual input are altered by the calibrated sway-referenced support surface and visual surround, which move in the anterior-posterior direction in response to the individual&#39;s postural sway. This creates a conflicting sensory experience. The Motor Control Test (MCT) challenges postural control by creating unexpected postural disturbances in the form of backwards and forwards translations. The translations are graded in magnitude and the time to recover from the perturbation is computed.
Intermittent claudication, the most common symptom of peripheral arterial disease, is characterized by a cramping pain in the lower limbs and caused by muscle ischemia secondary to reduced blood flow to working muscles during physical exertion. Claudicants often display poor balance, making them susceptible to falls and activity avoidance. The Ankle Brachial Pressure Index (ABPI) is a noninvasive method for indicating the presence of peripheral arterial disease and intermittent claudication, a common symptom in the lower extremities. ABPI is measured as the highest systolic pressure from either the dorsalis pedis or posterior tibial artery divided by the highest brachial artery systolic pressure from either arm. This paper will focus on the use of computerized dynamic posturography in the assessment of balance in claudicants.

Individuals with intermittent claudication exhibit poor balance compared to healthy controls. Computerized dynamic posturography is an objective method for measuring an individual's postural responses to balance disturbances. This provides an objective reflection of the person&#x2019;s ability to respond to situations under which sensory stimuli are altered and unexpected perturbations occur.

Computerized dynamic posturography with the EquiTest is an objective technique for measuring postural strategies under challenging static and dynamic ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

Tromboembolica cronica Ipertensione polmonare e valutazione dei ventricolare destra Funzione nel Maialino

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Semi-quantitative Assessment Using [18F]FDG Tracer in Patients with Severe Brain Injury

Patients with severe traumatic brain injury (sTBI) have difficulty knowing whether they are accurately expressing their thoughts and emotions because of disorders of consciousness, disrupted higher brain function, and verbal disturbances. As a consequence of an insufficient ability to communicate, objective evaluations are needed from family members, medical staff, and caregivers. One such evaluation is the assessment of functioning brain areas. Recently, multimodal brain imaging has been used to explore the function of damaged brain areas. [18F]-fluorodeoxyglucose positron emission tomography-computed tomography ([18F]FDG-PET/CT) is a successful tool for examining brain function. However, the assessment of brain glucose metabolism based on [18F]FDG-PET/CT is not standardized and depends on several varying parameters, as well as the patient&#39;s condition. Here, we describe a series of semiquantitative assessment protocols for a region-of-interest (ROI) image analysis using self-produced [18F]FDG tracers in patients with sTBI. The protocol focuses on screening the participants, preparing the [18F]FDG tracer in the hot lab, scheduling the acquisition of [18F]FDG-PET/CT brain images, and measuring glucose metabolism using the ROI analysis from a targeted brain area.

Semi-quantitative Assessment Using [18F]FDG Tracer in Patients with Severe Brain Injury

[18F]-fluorodeoxyglucose (FDG) positron emission tomography-computed tomography is useful for studying glucose metabolism related to brain function. Here, we present a protocol for an [18F]FDG tracer set-up and semiquantitative assessment of the region-of-interest analysis for targeted brain areas associated with clinical manifestations in patients with severe traumatic brain injury.

Valutazione semi-quantitativa utilizzando [18F] FDG Tracer in pazienti con trauma cranico severo

Patients with severe traumatic brain injury (sTBI) have difficulty knowing whether they are accurately expressing their thoughts and emotions because of ...

Interventional Diagnostic Procedure: A Practical Guide for the Assessment of Coronary Vascular Function

Approximately 40% of patients undergoing invasive coronary angiography for investigation of angina are found to have no obstructive coronary artery disease (ANOCA). Abnormal coronary function underlies coronary vasomotion syndromes including coronary endothelial dysfunction, microvascular angina, vasospastic angina, post-PCI angina and myocardial infarction with no obstructive coronary arteries (MINOCA). Each of these endotypes are distinct subgroups, characterized by specific disease mechanisms. Diagnostic criteria and linked therapy for these conditions are now established by expert consensus and clinical guidelines.
Coronary function tests are performed as an adjunctive interventional diagnostic procedure (IDP) in appropriately selected patients during coronary angiography. This aids differentiation of patients according to endotype. The IDP includes two distinct components: a diagnostic guidewire test and a pharmacological coronary reactivity test. The tests last approximately 5 minutes for the former and 10-15 minutes for the latter. Patient safety and staff education are key.
The diagnostic guidewire test measures parameters of coronary flow limitation (fractional flow reserve [FFR], coronary flow reserve [CFR], microvascular resistance [index of microvascular resistance (IMR)], basal resistance index, and vasodilator function [CFR, resistive reserve ratio (RRR)]).
The pharmacological coronary reactivity test measures the vasodilator potential and propensity to vasospasm of both the main coronary arteries and the micro-vessels. It involves intra-coronary infusion of acetylcholine and glyceryl trinitrate (GTN). Acetylcholine is not licensed for parenteral use and is therefore prescribed on a named-patient basis. Vasodilatation is the normal, expected response to infusion of physiological concentrations of acetylcholine. Vascular spasm represents an abnormal response, which supports the diagnosis of vasospastic angina.
The purpose of this practical guide is to provide information on the preparation and administration of the IDP in clinical practice. It discusses some key preparation and safety considerations, as well as tips for procedural success. The IDP supports stratified medicine for a personalized approach to health and wellbeing.

The purpose of this practical guide is to provide information on the preparation and administration of an interventional diagnostic procedure in clinical practice. It discusses some key preparation and safety considerations, as well as tips for procedural success.

Procedura diagnostica interventistica: una guida pratica per la valutazione della funzione vascolare coronarica

Approximately 40% of patients undergoing invasive coronary angiography for investigation of angina are found to have no obstructive coronary artery ...

Muscle Function Obtained with Motion Mode Ultrasound and Surface Electromyography during Core Endurance Exercise

Motion mode (M-mode) ultrasound allows researchers and clinicians to measure the change of muscle thickness across time. Muscle thickness can be measured between fascial borders at a given time point during an exercise. This selected time point produces a one-dimensional image resulting in real-time, live observation of anatomy. Ultrasound used during functional movement can be referred to as dynamic ultrasound; this is feasible and reliable with the use of a linear transducer, elastic belt, and foam block to secure consistent transducer placement. The lateral abdominal wall is commonly investigated using ultrasound due to the overlapping nature of the muscles. Surface electromyography (sEMG) can complement M-mode ultrasound imaging because it measures the electrical representation of muscle activation. There is minimal evidence using M-mode ultrasound and sEMG simultaneously during core exercise. Exercises that challenge the core musculature involve both isometric holds (e.g., side plank), as well as oscillatory extremity movements (e.g., dead bug). In this study, both instruments will be used simultaneously to measure core muscle function during exercise. Ultrasound measurements will be obtained using a linear transducer and ultrasound unit, and sEMG measurements will be acquired from a wireless sEMG system. To make comparisons between participants and exercises, normalization methods using static, exercise starting positions for both instruments will be used. An activation ratio will be used for ultrasound and calculated by dividing the contracted thickness (thickness during a time point of exercise) by the rested (starting position) thickness. Muscle thickness will be measured in centimeters from the superior inferior fascial border to inferior superior fascial border. These methods aim to offer an innovative and practical measurement of muscle function with M-mode ultrasound and sEMG during core endurance exercises.

This protocol uses motion mode ultrasound and surface electromyography simultaneously to measure muscle function of the core. Muscle thickness and activation of the local stabilizers (e.g., transverse abdominis, internal oblique) and global movers (e.g., external oblique) is achievable during specific time points of the side plank and dead bug exercises.

Funzione muscolare ottenuta con ultrasuoni in modalità movimento ed elettromiografia di superficie durante l'esercizio di resistenza al core

Motion mode (M-mode) ultrasound allows researchers and clinicians to measure the change of muscle thickness across time. Muscle thickness can be measured ...