私たちは親切ヴァーサとトラフィック·ジャム抗体を供給ルースリーマンとDorthea Godtに感謝しています。私たちは、NICHDの後援の下で開発し、アイオワ大学によって維持提供株式や発達研究ハイブリドーマバンクを維持するためのインディアナ大学ブルーミントンストックセンターを承認したいと思います。私たちは、彼らのアドバイスとサポートのためにWawersikラボのすべてのメンバーに感謝します。この作品は、モンロー学者プログラムグラントとNSF（AFとLBに）（MW）のIOS0823151を付与することによって資金を供給された。

コレクションケージの調製<ol><li> CO 2で、若い、肥沃なハエを麻酔。ケージに麻酔をかけたハエを転送します。最適な収率を得る4で生後2-7日に至るまで、100〜120大人のハエを使用するには、次の男性に、女性の1の割合。許可前固定のための試料を得るに〜24時間、適切な順応期間を飛ぶ。 48時間順応期間 - ケージは処女雌で設定されている場合は、使用36、オスと交配。 </li><li>ケージの開放端には、ケージの開口部に中央に酵母ペーストのダイムサイズのドロップで事前に準備されたリンゴジュース寒天プレートを配置。その後、テープで固定します。リンゴジュース寒天プレートとパラフィルムとケージとの間の接合部をシール。 </li><li>ベースとしてリンゴジュース寒天プレートと第2の容器にケージを置き、ハエが、実験によって決定される適切な期間のために定義温度で再現することができます。 注：サンプル収集時間のWI変化しちゃう。後期胚/早期のL1幼虫収集する際に、例えば、（17から24時間）、ハエは25℃で17時間前に、サンプルの老化に25℃で7時間、リンゴジュース寒天プレート上に卵を産むことができます。同様に、半ば後半最初の幼虫の収集のため（36から48時間）ハエが25℃で36時間前に、サンプルの老化に25℃で12時間、卵を産むことができます。 </li><li>期間が完了するとハエは麻酔なし離れリンゴジュース寒天プレートからドロップするように、テーブルの上にケージをタップします。すばやく酵母ペーストの低下を含む新鮮なものに用いられるプレートを交換してください。テープとパラフィルムで新しいプレートを固定し、ベースとしてリンゴジュース寒天プレートとケージを保管してください。 </li><li>慎重に金属スパチュラで使用されるプレートから酵母のドロップを削除します。使用リンゴジュースプレートに置き、蓋と実験的に必要であれば、年齢にレイド胚を可能にする。 注：サンプルをエージングしながら、より高い温度は、エクスペリない限り、このプレートを25℃で保存することができるLLY必要です。上記に記載されているコレクションのための胚を熟成する方法の例として（ステップ1.3のための注を参照）。老化をサンプリングする前に酵母ペーストの除去は、酵母にクロールおよびその下の寒天を分割から幼虫を防止するために行われる。残りのリンゴジュース寒天及び酵母ペースト残基は幼虫の成長のための栄養素を提供する。酵母ペーストに直接敷設胚酵母ペーストの除去によって失われているが、この損失は、染色効率を低下させることができ、サンプル中の酵母および寒天残留することが好ましい。一つは、酵母ペーストを除去しないことを選択すべきは、酵母はペイントブラシと混合し、リン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）で液化し、その後、固定前に、細胞ストレーナーを試料から除去することができる。 </li></ol> 2。固定<ol><li>リンゴジュース寒天プレート上に置か胚は所望の時点に老化したら、慎重に目からサンプルを除去するためにリン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）水溶液で湿らせ、小さな絵筆を使う電子版。 注：古い幼虫がモバイルであり、蓋の内側にクロールすることができる。このサンプルは、絵筆で除去することによって、同様に収集することができる。 </li><li>セルストレーナーの内側に面した尾根に対してサンプルを含んだ絵筆を拭きます。その後、PBTx溶液を含む噴霧ボトルとストレーナーの壁や絵筆をすすぐ。 PBTxソリューションをキャプチャするために、ストレーナの下にペトリ皿のカバーを置きます。 </li><li>すべてのサンプルは、ストレーナに転送された後に、メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐ。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。 </li><li>酵母を除去し、サンプルと一緒に転送されている可能性があり、廃棄物を飛ぶために繰り返して、ステップ2.3三回。 </li><li>メッシュから幼虫を高めるために、ストレーナに十分な、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）/水（のddH 2 O）水溶液を注ぐ。幼虫は5分間溶液に座ってできるようにします。その後、ストレーナを持ち上げ、tは注ぐ彼液体廃棄物容器内のペトリ皿の内容。 注： - 絨毛膜を除去するために、22時間ブリーチのみ0歳胚のサンプルが必要である。古いサンプルへの漂白剤の塗布を省略することができるが、その含有は有害ではない。省略を希望する場合は、PBTxと、この工程で漂白剤を交換してください。希薄化後漂白剤は溶液調製の24時間以内に使用する必要があります。 </li><li>メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐことにより、PBTxとストレーナでサンプルを洗浄します。サンプルは3分間溶液に座ってできるようにします。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。 </li><li>繰り返しステップ2.6の5倍。 </li><li>デイブセルストレーナーの乾燥の下​​部には、絵筆を使ってPEMS液1.75 mlを含むシンチレーションバイアルにサンプルを移す。 </li><li>換気されたドラフト内で作業する、シンチレーションバイアルに37％ホルムアルデヒド250μlの試薬グレードのヘプタン8ミリリットルを追加します。 <br/&gt;注意：ホルムアルデヒドおよびヘプタンは危険です。 3.3 - 安全のため、換気されたドラフト内で作業し、ステップ2.9に適切な手袋を着用し続けています。 </li><li>バイアルを20分間200回転または同様の適度なスピードで振るようにします。 </li><li>前の水相を除去することなく、シンチレーションバイアルに10mlのメタノールを加え、バイアルを1分間500rpmで激しく振りすることができます。 注意：メタノールは危険です。換気されたドラフト内で作業し、適切な手袋を着用し続けます。 </li><li>シェーカーからバイアルを取り出し、すぐにフード内の液体廃棄物容器の上にセルストレーナーに内容を注ぐ。バイアルに余分なメタノールを追加し、すべてのサンプルが削除されていることを確認するために、必要に応じてセルストレーナーを介して実行。 注：セルストレーナーがゆっくりと排出することができる。これを解決するには、より迅速にストレーナーを通して溶液を引くために、セルストレーナーの底に実験室の組織をタッチします。メタノール、ホルムアルデヒド、およびヘプタンであるべき施設のガイドラインに従って適切に廃棄するまで、適切な廃棄物容器に格納されている。 </li><li>実験室の組織を用いて細胞ストレーナーの乾燥底部は、次いでメタノール0.5 mlを含む1.5mlのマイクロチューブにストレーナに取り込まれたサンプルを転送するために絵筆を使用しています。 セルストレーナー上での乾燥からサンプルを防ぐために、一度に2.12と2.13 1バイアル複数のシンチレーションバイアルが使用されている場合は、手順：注意してください。 </li><li>試料が微量遠心管に添加された後、ピペットを用いて、メタノールを除去。サンプルは、チューブの底に沈殿していることを確認してください。 </li><li>試験管にメタノール約0.5ミリリットルを添加することにより微量遠心管中に試料をすすぐ。その後落ち着くピペットでメタノールを除去するためのサンプルのを待ちます。 </li><li>繰り返しステップ15三回。 </li><li>試験管にメタノールを0.5ミリリットルを追加し、後で使用するために℃の冷凍庫-20℃で保存する。 </li></ol> 3。再水和および免疫染色用サンプルの調製<ol><li>チューブ内のサンプルを残して、ピペットを用いてマイクロチューブからメタノールを除去します。適正処理するまで、適切な廃棄容器に保管メタノール廃棄物。 、超音波処理効率を向上させるために、試料のせいぜい3ミリメートルを1.5 mlマイクロチューブの底に沈降していない使用します。注意して​​ください。過剰のサンプルは、上記の再水和ステップを始める前に、ピペットを用いて別のチューブに移すことができる。清浄なカミソリの刃でピペットの先端をカットするピペットチップの目詰まりを防止するために使用することができる。 </li><li> 3分間、チューブやロックに50％メタノール/リン酸緩衝液のTween（PBTw）溶液1.0mlを追加します。 </li><li>適切な廃棄容器にメタノール水溶液を取り出し、二回PBTwの1.0μlを洗い流してください。各リンス後、サンプルをピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。 </li><li>バイアルと岩に混ぜウシ血清アルブミン/リン酸緩衝トゥイーン（BBTw）の1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、SAMPを許可ルを沈降し、ピペットでBBTwを削除します。 </li><li>繰り返しステップ3.4最後の洗浄後のサンプルを失うことなく、可能な限り多くのBBTwを削除するように注意しながら2回。 </li><li>チューブにBBTwの0.5ミリリットルを加え、チューブを氷上に置きます。 </li></ol>サンプルの4。超音波処理<ol><li> 10％最大振幅の超音波処理装置を設定し、2秒定数の超音波処理の実行時間を指定します。 注：これらの設定は、材料および装置の表に示されている超音波処理装置に固有であり、異なる超音波処理の最適化が必要な場合があります。 </li><li>サンプルの超音波処理に先立って、50ミリリットルにプローブを洗浄するために、脱イオン水および実行ソニケーターで満たされたコニカルチューブをプローブ先端を配置することによって、超音波処理器プローブを清掃してください。走行後、実験室組織とドライ超音波処理器プローブ。 </li><li>それが位置するように、約3〜4ミリメートルのサンプルの上に試料を含有するマイクロチューブにプローブを浸し、超音波処理を開始します。 </li><li> Mを削除するicrocentrifuge管および超音波処理からの熱を放散し、試料を微量遠心チューブの底に沈降させるために、少なくとも30秒間、氷上に置く。 </li><li>処理されているサンプルの年齢に基づいて、必要に応じて繰り返します4.3と4.4を繰り返します。 注：最適な超音波処理のサンプル·ボリュームの場合、より若い17時間を胚は超音波処理を必要としませんが、17および24時間（ステージ17 /早-L1）との間のものが2超音波処理を必要とします。 36（初期/中期L1）、36 - - 48（中期/後期-L1）、48から60（初期/中期L2）、60から72（中期​​/後期-L2）、72から84（24との間の幼虫早期L3）、84から96（初期/中期L3）、96 - ）108（中期/後期-L3時間はそれぞれ5、9、11、13、15、18、22超音波処理を必要とする。超音波処理時間へのさらなる詳細のための議論を参照してください。 </li><li> BBTw回1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。 </li><li>バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。&lt;/李&gt; <li>繰り返しステップ4.7の2倍。 </li></ol> 5。免疫染色<ol><li>マイクロ遠心チューブにBBTwで希釈した5％正常血清を添加することにより、サンプルをブロックします。 1時間ロッキング後のブロックを削除します。 注：二次抗体が生成される種から正常血清を使用してください。 </li><li> 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な一次抗体を希釈します。 </li><li> 4℃で、または（約22°C、室温で少なくとも3時間、一次抗体溶液をOで岩石試料/ N。 注：抗体インキュベーション時間および温度は変更になる場合があります。 O / NをRTで4℃でのインキュベーション、または3時間、典型的には十分である。しかし、2日間のインキュベーション期間は、特に古いサンプルまたは低親和性の一次抗体を使用すると、染色の品質を向上させることができる。より長いインキュベーションは、典型的には4℃で行われる。二次抗体を使用した場合、同様の考察は（5.10を参照）を行う必要があります。 </li><li>サンプルはに沈むことを許可マイクロチューブの底。ピペットを用いて一次抗体をオフに描画します。必要に応じて再利用するための抗体を保存します。 </li><li>二回BBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。 </li><li>バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。 </li><li>繰り返しステップ5.6の5倍。 </li><li>マイクロ遠心チューブに5％正常血清/ BBTw溶液を添加することによって、ブロックのサンプル。 1時間に30分間ロッキング後のブロックを削除します。 注：この追加のブロッキング工程は必須ではありませんが、特異的な抗体の染色品質を向上させることができる。 </li><li> 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な二次抗体を希釈する。 </li><li>露光に起因する退色低減するためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。 4℃で12時間〜48用の二次抗体溶液中またはRT（約22℃で少なくとも3時間岩石試料。 </li><li>サンプルはマイクロチューブの底に沈殿することを許可する。ピペットを用いて二次抗体をオフに描画します。 </li><li>二回PBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。 </li><li>バイアルと岩にPBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上で5分後、サンプルをピペットでPBTwを解決して削除することができます。 </li><li>繰り返しステップ5.13三回。 </li><li>オプション：PBTw 1,000：DAPIは1に希釈し追加します。岩石試料は、3分間のアルミホイルに包まれ;その後ピペットでDAPI溶液を取り除く。サンプルはピペットでPBTwを削除する前に沈降させ、PBTwの1.0ミリリットルで5回洗浄します。 </li><li> -20℃でのマイクロ遠心チューブとストアに1,4 - ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）溶液100μl - 80を追加する。 注：別のグリセロールベースの​​アンチフェード剤は、置換されていてもよい。 </li></ol> 6。分析<ol><li> DABCO / P-フェン10μlの - スライド上にサンプルをマウントする前に、余分な5を追加メチレンジアミン（PPD）マイクロチューブに退色防止ソリューションを提供します。 注：サンプルは、切開せずにスライドに添加することができる。スライドに添加された試料体積は、カバースリップの大きさによって変化する。スライド上にサンプルをピペッティングすると、ピペットチップは、試料の剪断を防止するために、カミソリの刃を用いて切断することができる。それは簡単な分析のために列にサンプルを並べることが有用であることが多い。付加的な退色防止剤としてPPDの添加は必要とされないかもしれないが、サンプルは長期間保存した場合、光退色を防止することができる。 </li><li>静かにサンプル上のカバーガラスを配置します。マニキュアを使用して適切な位置で、安全なカバースリップ。 </li><li>ビューは、蛍光顕微鏡を使用してサンプルをマウントした。 </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、成功したので、解剖の必要性を排除し、 その場でターゲットショウジョウバエ胚および幼虫組織を免疫染色する方法を提供する。初期胚の1,2,3を染色するための従来のプロトコルに従って、絨毛膜は、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）を用いて除去される。サンプルは、ホルムアルデヒドおよびメタノール中で固定されている。幼虫のクチクラ...

ショウジョウバエの胚および幼虫は多くの器官および組織中の発達過程を研究するための優れたモデルを提供する。個別の細胞のイメージングは​​、細胞が発達する複雑な環境を確認するために、これらの研究においてしばしば必要である。組織中の細胞の可視化は、免疫染色により達成することができる。プロトコルは17時間産卵（AEL）1-3の後、胚ショウジョウバエ組織 &lt;のために存在する免疫染色よく記載。有効な抗体の浸透を防止胚発生の終了に向かったが、保護キューティクルフォーム、。したがって、これらの免疫染色のプロトコルは、後期胚における組織の分析においてと幼虫の発育（ 第 1齢（L1）、2 番目の齢（L2）、及び第3齢（L3））のその後の段階で非効率的である。この非効率性は、この拡張された発育期間4中に発生した動的プロセスの理解に対する障壁を課している。 TISSUE郭清はこの障壁5-7を回避するために広く使用される技術である。しかし、解剖は非効率的な証明することができます。抽出は、胚および幼虫の組織を配置するか、単離することの難しさによって妨げてもよい。また、標的組織の物理的除去は、それらを破壊するか、またはその全体でそれらを抽出するために失敗することによって損傷を与える可能性がある。 超音波処理は、分子間相互作用を妨害するために音波を用いる方法である。これは、神経細胞型6を開発する免疫染色するために、 ショウジョウバエの幼虫クチクラの完全性を破壊するために使用されている。このプロトコルは、直径8〜10には50μmと小さくすることができ、後期胚および幼虫の生殖腺を、免疫染色するようになってきた。このような研究により、男性生殖細胞系列幹細胞（GSC）ニッチ形成のプロセスは、後期に特徴づけられた幹細胞の発生とのdifを調節するショウジョウバエ胚 8-10とメカニズム後期胚性生殖腺と幼虫ferentiationは9-12解明されている。このように、超音波処理が原因組織サイズが難しいかもしれ組織切開への効率的な代替手段を提供します。さらに、生物全体のコンテキスト内のセルを残してその場の形態で維持し、 その場でショウジョウバエ組織の免疫染色を可能にします。ここでは、 その場での初期/中期のL3組織を後期胚の蛍光免疫染色のためのステップバイステップのプロトコルを記述します。 ショウジョウバエの生殖腺組織および神経組織の分析は、このプロトコルの有効性を実証する代表的な結果に示されている。さらに、この免疫染色プロトコルは、外側のキューティクルと他の生物において他のショウジョウバエ組織ならびに組織を分析するように適合され得る。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1: Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)</td>
			<td>For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)</td>
			<td>For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4</td>
			<td>Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEMS</td>
			<td>0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH</td>
			<td>Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>37% formaldehyde by weight in methanol</td>
			<td>Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>n-Heptane</td>
			<td>CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Methanol</td>
			<td>CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Tween (PBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%</td>
			<td>Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O</td>
			<td>Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td>To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol</td>
			<td>In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution</td>
			<td>1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)</td>
			<td>Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple juice plates</td>
			<td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O</td>
			<td>Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept 10%</td>
			<td>To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol</td>
			<td>Store aliquots at -20 degrees C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast paste</td>
			<td>~50 g Dry Active Yeast</td>
			<td>Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2: Staining Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571 //// Stock at 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Vasa</td>
			<td>1:250</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Ruth Lehmann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasciclin III</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>7G10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-1B1</td>
			<td>1:4</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>1B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guniea pig anti-Traffic Jam</td>
			<td>1:2500</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prospero</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Prospero MR1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-Elav</td>
			<td>1:30</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Rat-elav 7EBA10 anti-elav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Repo</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>8D12 anti-Repo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa546</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-guniea pig Alexa633</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rat Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3: Materials and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cages</td>
			<td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td>
			<td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model #: 102C (CE)</td>
			<td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-25-20</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td>
			<td>Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td>
			<td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>450-0020</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

キイロショウジョウバエの胚および幼虫において行われた研究は、このような細胞の運命仕様と器官形成などの発生過程に重要な洞察を提供する。免疫染色は、組織および器官の開発の可視化を可能にする。しかし、胚発生の最後に形成した保護キューティクルは後期胚および幼生への抗体の浸透を防ぐことができます。免疫染色の前に切開を定期的にショウジョウバエ幼虫の組織を分析するために使用される小さな組織を見つけて単離することは困難であるので、それはいくつかの分析のために非効率的な証明する。超音波処理は、幼虫ショウジョウバエの免疫染色プロトコルにおける解剖の代替手段を提供します。これは、後期胚および幼虫の大量の迅速、同時処理を可能にし、 その場で 、形態に維持します。ホルムアルデヒドで固定した後、試料を超音波処理する。次いで、試料を、抗原特異的な一次蟻で免疫染色が施されるibodiesおよび蛍光標識した二次抗体は、蛍光顕微鏡を介して標的細胞型および特定のタンパク質を可視化した。超音波処理の過程で、上記サンプル音波処理プローブ、ならびに超音波処理の持続時間および強度の適切な配置は重要である。標準免疫染色プロトコルへのadditonal小さな変更は、高品質の汚れのために必要とされ得る。対雑音比が低い信号を有する抗体については、より長いインキュベーション時間は、典型的には必要である。この超音波処理促進性プロトコルのためのコンセプトの証明として、発達段階の範囲で3の組織型（精巣、卵巣、および神経組織）の免疫染色を示している。

その場での後期胚および幼虫の組織の分析において超音波処理ベースの免疫染色の有効性を実証するために、野生型の胚および幼虫は精巣、卵巣、および神経組織の免疫染色のために処理した。サンプルは、共焦点顕微鏡を介して画像化した代表的な結果は、（ 図1及び図2）が示されている。結果は、記述されたプロトコルは、 ショウジョウバエの開?...

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Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.5K ビュー.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

ビデオ: Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...