Somos gratos a Ruth Lehman e Dorthea Godt que gentilmente fornecido anticorpos Vasa e Engarrafamento. Gostaríamos de agradecer o Bloomington Banco Central da Universidade de Indiana para a manutenção das existências previstas eo Developmental Studies Hybridoma Banco desenvolvidas sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa. Agradecemos a todos os membros do laboratório Wawersik para os seus conselhos e apoio. Este trabalho foi financiado pela Monroe Scholars Programa Bolsa (para AF e LB) e NSF conceder IOS0823151 (a MW).

1 Preparação de uma gaiola coleção <ol><li> Anestesiar jovens, moscas férteis com CO 2. Transferir moscas anestesiadas para uma gaiola. Para obter o rendimento ideal, use 100-120 moscas adultas variam de 2-7 dias de idade em uma proporção de 4: 1 de mulheres para homens. Permitir moscas um período de aclimatação apropriada, ~ 24 horas antes da obtenção de amostra para a fixação. Se a gaiola foi criado com fêmeas virgens acoplado aos homens, o uso de um 36 - período de aclimatação de 48 hr. </li><li> Na extremidade aberta da gaiola, colocar uma placa de agar pré-preparados sumo de maçã com uma gota do tamanho de uma moeda, de levedura pasta no centro ao longo da abertura da jaula. Em seguida, prenda com fita adesiva. Selar a junção entre a placa de ágar suco de maçã ea gaiola com Parafilm. </li><li> Coloque a gaiola em um contentor secundário com sumo de maçã placa de agar na forma de base e permitir que as moscas para reproduzir a uma temperatura definida por um período de tempo adequado, tal como determinado pela experiência. Nota: Os tempos de colheita de amostras wivai variar. Por exemplo, quando a recolha de embriões de fase tardia / larvas L1 precoce (17 - 24 horas), permitir que as moscas a pôr ovos em placas de agar de sumo de maçã durante 7 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 17 horas a 25 ° C. Da mesma forma, para uma recolha de larvas de primeiro estádio de meados de atraso (36 - 48 h) permitir que as moscas a pôr ovos durante 12 horas a 25 ° C, antes do envelhecimento das amostras durante 36 horas a 25 ° C. </li><li> Uma vez que o período de tempo é completo, toque na gaiola em uma mesa para que as moscas cair longe da placa de ágar suco de maçã sem anestesia. Substituir rapidamente a placa utilizada por uma nova, contendo uma gota de pasta de levedura. Fixe a placa de fresco com fita adesiva e parafilm e armazenar a gaiola com suco de maçã placa de ágar como base. </li><li> Remova cuidadosamente a queda levedura da placa usada com uma espátula de metal. Coloque a tampa na placa de suco de maçã usado e permitir que os embriões colocados para a idade, se experimentalmente necessário. Nota: Embora as amostras de envelhecimento, as placas podem ser armazenadas a 25 ° C, a menos que as temperaturas mais elevadas são experimentally necessária. Exemplos de como envelhecer embriões para a coleta são descritos acima (ver nota para o passo 1.3). A remoção da levedura pasta antes de provar o envelhecimento é realizada para evitar larvas de rastejar na levedura e quebrando o agar por baixo. O resíduo ágar suco de maçã e levedura pasta restante fornecer nutrientes para o crescimento larval. Enquanto os embriões fixados directamente na pasta de levedura são perdidos através de remoção de pasta de levedura, esta perda é preferível para levedura e agar de resíduo na amostra, que pode reduzir a eficiência da coloração. Se uma escolha não remover a pasta de levedura, a levedura pode ser liquefeito com Tampão Fosfato de Triton X-100 (PbTx), misturado com um pincel, e em seguida removido a partir da amostra com um filtro de células antes da fixação. </li></ol> 2 Fixação <ol><li> Uma vez que os embriões fixados sobre a placa de agar de sumo de maçã têm idade para o ponto de tempo desejado, utilizar um pequeno pincel humedecido com solução de tampão fosfato de Triton X-100 (PbTx) para remover cuidadosamente amostras de poe placa. Nota: larvas mais velhas são móveis e podem rastejar para o interior da tampa. Esta amostra pode ser recolhida de forma semelhante por remoção com um pincel. </li><li> Limpe o pincel amostra-laden contra virado para o interior cume de um filtro de células. Em seguida, lave as paredes do filtro e do pincel com uma garrafa de esguicho contendo solução PbTx. Coloque uma tampa de placa de petri por baixo do filtro para capturar a solução PbTx. </li><li> Depois de toda a amostra foi transferida para o filtro, despeje PbTx suficiente no filtro de levantar a amostra para fora da malha. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos. </li><li> Repita o passo 2.3 três vezes para remover fungos e resíduos que possam ter sido transferidos juntamente com a amostra de voar. </li><li> Despeje suficiente 50% de lixívia (ddH2O) (NaOCl) / água no filtro para aumentar as larvas fora da malha. Permitir que as larvas se sentar na solução por 5 min. Em seguida, levante a peneira e deitar fora tele conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos. Nota: Bleach é necessária apenas em amostras embrionárias com idades entre 0-22 horas, a fim de remover a membrana coriônica. A aplicação de água sanitária para amostras mais velhas pode ser omitido, mas a sua inclusão não é prejudicial. Se a omissão for desejado, substituir a água sanitária nesta etapa com PbTx. Água sanitária diluída deve ser utilizada dentro de 24 horas de preparação da solução. </li><li> Lave amostra no coador com PbTx derramando bastante PbTx no coador para aumentar a amostra para fora da malha. Deixar a amostra para sentar-se em solução para 3 min. Em seguida, levante a peneira e despeje o conteúdo da placa de petri em um recipiente de resíduos líquidos. </li><li> Repita o passo 2.6 cinco vezes. </li><li> Dab parte inferior do filtro de células secas, em seguida, transferir a amostra para um frasco de cintilação contendo 1,75 ml de solução de PEMS utilizando um pincel. </li><li> Trabalhando numa hotte ventilada, adicionar 250 mL de formaldeído a 37% e 8 ml de heptano de grau de reagente para o frasco de cintilação. <br/&gt; Nota: Formaldeído e heptano são perigosos. Por razões de segurança, continuar a trabalhar em um exaustor ventilado e usar luvas apropriadas para as etapas 2,9-3,3. </li><li> Deixe o frasco para agitar a 200 rpm ou uma velocidade moderada semelhante para 20 min. </li><li> Adicionar 10 ml de metanol a ampola de cintilação, sem remoção da fase aquosa anterior e permitir que o frasco para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min. Nota: O metanol é perigoso. Continuar a trabalhar em um exaustor ventilado e usar luvas apropriadas. </li><li> Remover o frasco do shaker e imediatamente despeje o conteúdo em um filtro de células sobre um recipiente de resíduos líquidos na capa. Adiciona-se metanol adicional para o frasco e executado através do filtro, conforme necessário para garantir que todo célula da amostra foi removido. Nota: coadores célula pode drenar lentamente. Para remediar esta situação, um toque de tecido de laboratório para a parte inferior do coador de células, de modo a extrair a solução através do filtro de forma mais rápida. Metanol, formaldeído, e heptano deve serarmazenado em lixeiras apropriadas até o descarte adequado de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Inferior a seco de filtro de células utilizando um tecido de laboratório, em seguida, usar um pincel para transferir a amostra capturada na peneira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,5 ml de metanol. Nota: Se vários frascos de cintilação estão em uso, conclua as etapas de 2,12 e 2,13 um frasco de cada vez para evitar a amostra de secagem em filtros celulares. </li><li> Assim que a amostra foi adicionada ao tubo de microcentrífuga, remover o metanol, com uma pipeta. Certifique-se de amostra tenha assentado no fundo do tubo. </li><li> Lavar amostra no tubo de microcentrífuga, adicionando cerca de 0,5 ml de metanol ao tubo. Espere por amostra para resolver depois remover o metanol com uma pipeta. </li><li> Repita o passo 15 três vezes. </li><li> Adicionar 0,5 ml de metanol ao tubo, em seguida, armazenar em um freezer -20 ° C para uso posterior. </li></ol> 3. Reidratação e Preparação de Amostras para Imunocoloração <ol><li> Remover o metanol a partir do tubo de microcentrifugadora com uma pipeta, deixando a amostra no tubo. Loja resíduos de metanol para o recipiente adequado de lixo até à hora de eliminação adequada. Nota: Para aumentar a eficiência de ultra-sons, utilizar não mais de 3 mm de amostra depositada no fundo do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Excesso de amostra pode ser transferida para um tubo separado com uma pipeta, antes de começar a etapa de re-hidratação acima. Cortar a ponta da pipeta com uma lâmina de barbear limpa pode ser usada para evitar o entupimento da ponta da pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de uma solução a 50% de metanol / tampão de fosfato Tween (PBTw) para o tubo e rocha durante 3 min. </li><li> Remover solução de metanol para o recipiente de resíduos adequado e enxaguar com 1,0 l de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem, deixar a amostra para resolver antes de tirar fora do PBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de albumina sérica bovina / tampão fosfato Tween (BBTw) misturar ao frasco e rock. Após 3 min em uma cadeira de balanço, permitir que o sample para resolver e remover o BBTw com pipeta. </li><li> Repita o passo 3.4 duas vezes, tendo o cuidado de retirar o máximo BBTw possível, sem perder de amostra após a última lavagem. </li><li> Adicionar 0,5 ml de BBTw para o tubo e colocar o tubo em gelo. </li></ol> 4. Sonicação de Amostra <ol><li> Defina o sonicador a 10% da amplitude máxima e designar um tempo de execução de 2 seg sonicação constante. Nota: Essas configurações são específicas para o sonicador indicada nos Materiais e Equipamentos Tabela e pode exigir de otimização para diferentes sonicators. </li><li> Antes de ultra-sons de amostra, limpar a sonda de ultra-sons colocando a ponta da sonda em um tubo de 50 ml cheia de água deionizada e de execução sonicador de limpar a sonda. Sonda de ultra-sons a seco com tecido laboratório após corrida. </li><li> Submerge da sonda para o tubo de microcentrífuga contendo amostra de modo que fique posicionado aproximadamente 3 a 4 mm acima da amostra e iniciar sonicação. </li><li> Remover o microcentrifuge tubo e coloca-se em gelo durante pelo menos 30 segundos para dissipar o calor a partir de ultra-sons e permitir que a amostra se depositam no fundo do tubo de microcentrífuga. </li><li> Repita os passos 4.3 e 4.4, conforme necessário, com base na idade da amostra que está sendo processado. Nota: Para um volume ótimo de amostra sonificação, os embriões mais jovens do que 17 horas não necessitam de ultra-som, mas aqueles entre 17 e 24 horas (fase 17 / early-L1) requerem dois sonicações. Larvas entre 24-36 (início / meio-L1), 36-48 (mid / late-L1), 48-60 (início / meio-L2), 60-72 (mid / late-L2), 72-84 ( early-L3), 84-96 (início / meio-L3), 96-108 (mid / late-L3) hr exigem 5, 9, 11, 13, 15, 18 e 22 sonicações respectivamente. Veja a discussão para posterior elaboração em tempos de sonicação. </li><li> Enxágüe com 1,0 ml BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o BBTw com pipeta. &lt;/ Li&gt; <li> Repita o passo 4.7 duas vezes. </li></ol> 5. Imunocoloração <ol><li> Bloquear amostra por adição de 5% de soro normal diluído em BBTw ao tubo de microcentrífuga. Remova o bloco após balançar por 1 hora. Nota: Use soro normal das espécies em que os anticorpos secundários são gerados. </li><li> Diluir anticorpos primários para se apropriar concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw. </li><li> Amostra de rocha no anticorpo primário solução O / N a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. Nota: Os tempos de incubação de anticorpos e as temperaturas podem variar. S / N incubação a 4 ° C ou 3 horas à temperatura ambiente é tipicamente suficiente. No entanto, um período de incubação de dois dias, pode melhorar a qualidade de coloração, especialmente com amostras mais velhas ou quando os anticorpos primários de baixa afinidade são utilizadas. Incubações mais longas são geralmente realizados a 4 ° C. Considerações similares devem ser feitas quando se utiliza anticorpos secundários (ver 5.10). </li><li> Deixar a amostra em repouso para ainferior do tubo de microcentrífuga. Colhem-se anticorpos primários com pipeta. Salve anticorpos para reutilização, se desejar. </li><li> Enxágüe com 1,0 ml de BBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir amostra para resolver antes de tirar fora BBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de BBTw ao frasco e rock. Após 3 min do roqueiro, permitir que a amostra se instalar e remover BBTw com pipeta. </li><li> Repita o passo 5.6 cinco vezes. </li><li> Bloco amostra por adição de uma solução de soro normal de / BBTw 5% para o tubo de microcentrífuga. Remova o bloco de balanço depois durante 30 minutos a 1 hora. Nota: Esta etapa bloqueio adicional não é necessária, mas pode melhorar a qualidade de coloração para detecção de anticorpos específicos. </li><li> Diluir anticorpos secundários se apropriar de concentração de trabalho na solução de 5% de soro normal de / BBTw. </li><li> Enrole tubo de microcentrífuga em papel de alumínio para reduzir o desbotamento devido à exposição à luz. Amostra de rocha na solução de anticorpo secundário por 12 a 48 horas a 4 ° C ou durante pelo menos 3 horas à temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. </li><li> Deixar a amostra em repouso para a parte inferior do tubo de microcentrífuga. Empate fora de anticorpos secundários com pipeta. </li><li> Enxágüe com 1,0 ml de PBTw duas vezes. Depois de cada lavagem permitir que a amostra antes de se estabelecer a remoção do PBTw com uma pipeta. </li><li> Adicionar 1,0 ml de PBTw ao frasco e rock. Depois de 5 minutos sobre o roqueiro, permitir que a amostra se estabelecer e remover o PBTw com pipeta. </li><li> Repita o passo 5.13 três vezes. </li><li> Opcional: Adicione DAPI diluído 1: 1.000 em PBTw. Amostra de rocha embrulhados em papel alumínio por 3 min; em seguida, remover a solução DAPI com uma pipeta. Lavar cinco vezes com 1,0 ml de PBTw, permitindo amostra para resolver antes de remover PBTw com pipeta. </li><li> Adicionar 80 - 100 mL de 1,4-diazabiciclo solução [2.2.2] octano (DABCO) ao tubo de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C. Nota: Um outro agente anti-desbotamento base de glicerol pode ser substituído por. </li></ol> 6 Análise <ol><li> Antes de amostra de montagem em lâminas, adicionar um extra de 5 - 10 mL de DABCO / p-fenylenediamine (PPD) antifade solução para tubo de microcentrífuga. Nota: A amostra pode ser adicionada a lâminas sem a dissecção. O volume de amostra adicionada a uma corrediça varia com o tamanho da tampa deslizante. Quando pipetar amostra em slide, a ponteira pode ser cortada com uma lâmina de barbear para evitar amostra de corte. Muitas vezes, é útil para a linha de exemplo em linhas de análise fácil. A adição de um agente de PPD como antifade adicional pode não ser necessária, mas pode evitar a fotodegradação se as amostras são armazenadas a longo prazo. </li><li> Delicadamente, coloque a tampa de vidro de deslizamento ao longo da amostra. Então, lamínula seguro no local usando unha polonês. </li><li> Ver montado amostra usando microscopia de fluorescência. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li><li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila.">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li><li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li><li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila.">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li><li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo fornece um método para atingir com sucesso imunocoloração Drosophila embrionário e larval tecidos in situ, eliminando, assim, a necessidade de dissecção. De acordo com os protocolos anteriores, para a coloração de embriões de 1,2,3, a membrana coriónica é removido usando 50% de lixívia (hipoclorito de sódio). As amostras são fixadas em formol e metanol. Porque a cutícula larval provoca amostra mais para flutuar, a totalidade da amostra é então passada através...

Embriões de Drosophila e larvas de fornecer um excelente modelo para estudar os processos de desenvolvimento em vários órgãos e tecidos. Imagem de células individuais é muitas vezes necessário nestes estudos, a fim de apurar os ambientes complexos em que as células se desenvolvem. A visualização de células em tecidos pode ser realizada através de imunomarcação. Bem descrito imunomarcação existem protocolos para tecidos de Drosophila embrionárias &lt;17 horas após a postura dos ovos (AEL) 1-3. No entanto, se forma uma cutícula protetora para o fim da embriogênese, impedindo a permeação de anticorpos eficazes. Assim, estes protocolos imunocoloração são ineficientes na análise de tecidos em embriões em estágio final e em fases posteriores do desenvolvimento larval (1 º instar (L1), 2 º instar (L2), e 3 º instar (L3)). Essa ineficiência impõe uma barreira à nossa compreensão dos processos dinâmicos que ocorrem durante este período de desenvolvimento prolongado 4. Tissue dissecção é uma técnica amplamente utilizada para contornar essa barreira 5-7. No entanto, a dissecção pode provar ineficiente. Extração podem ser sobrecarregados com dificuldade em localizar ou isolar embrionário e tecidos larvais. Além disso, a remoção física dos tecidos-alvo pode causar danos pela ruptura los ou ao não extraí-los em sua totalidade. A sonicação é um método que emprega ondas sonoras para perturbar interacções intermoleculares. Tem sido usada para romper a integridade da cutícula larval Drosophila, a fim de imunocoloração tipos de células neurais em desenvolvimento 6. Este protocolo foi adaptado para imunocoloração embrionário de fase final e gónadas larvais, o que pode ser tão pequeno quanto 50 um de diâmetro de 8-10. Através desses estudos, o processo de célula-tronco da linhagem germinativa (GSC) formação nicho masculino tem sido caracterizada em fase final de embriões de Drosophila 8-10 e mecanismos que regulam o desenvolvimento de células-tronco e difdife- em fase final de gônadas embrionárias e as larvas foram elucidados 9-12. Assim, de ultra-sons constitui uma alternativa eficiente para a dissecção de tecidos que pode ser difícil por causa do tamanho dos tecidos. Além disso, permite a imunocoloração de tecidos in situ de Drosophila, deixando as células no contexto de todo o organismo e manutenção da morfologia situ. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a fluorescência imunocoramento tarde-estágio embrionário através primeiros tecidos / mid-L3 in situ. Análise de Drosophila gonadal e tecido neural é mostrado nos resultados representativos para demonstrar a eficácia do presente protocolo. Além disso, este protocolo de imuno pode ser adaptado para analisar outros tecidos de Drosophila, bem como os tecidos em outros organismos com uma cutícula externa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1: Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)</td>
			<td>For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)</td>
			<td>For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4</td>
			<td>Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEMS</td>
			<td>0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH</td>
			<td>Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>37% formaldehyde by weight in methanol</td>
			<td>Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>n-Heptane</td>
			<td>CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Methanol</td>
			<td>CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Tween (PBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%</td>
			<td>Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O</td>
			<td>Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td>To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol</td>
			<td>In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution</td>
			<td>1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)</td>
			<td>Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple juice plates</td>
			<td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O</td>
			<td>Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept 10%</td>
			<td>To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol</td>
			<td>Store aliquots at -20 degrees C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast paste</td>
			<td>~50 g Dry Active Yeast</td>
			<td>Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2: Staining Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571 //// Stock at 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Vasa</td>
			<td>1:250</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Ruth Lehmann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasciclin III</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>7G10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-1B1</td>
			<td>1:4</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>1B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guniea pig anti-Traffic Jam</td>
			<td>1:2500</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prospero</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Prospero MR1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-Elav</td>
			<td>1:30</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Rat-elav 7EBA10 anti-elav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Repo</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>8D12 anti-Repo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa546</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-guniea pig Alexa633</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rat Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3: Materials and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cages</td>
			<td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td>
			<td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model #: 102C (CE)</td>
			<td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-25-20</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td>
			<td>Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td>
			<td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>450-0020</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

Estudos realizados em Drosophila melanogaster embriões e larvas de fornecer informações cruciais nos processos de desenvolvimento, como especificação de destino celular e organogênese. Imunocoloração permite a visualização do desenvolvimento de tecidos e órgãos. No entanto, uma cutícula protectora que se forma na extremidade da embriogênese impede a permeação de anticorpos em embriões de fase tardia e de larvas. Enquanto dissecção antes de imunomarcação é regularmente utilizado para analisar Drosophila tecidos larvais, prova ineficiente para algumas análises, porque pequenos tecidos podem ser difíceis de localizar e isolar. Sonication fornece uma alternativa para dissecção em protocolos de positividade de larvas de Drosophila. Ela permite a rápida transformação, simultânea de um grande número de embriões em estágio final e larvas e mantém na morfologia situ. Após fixação em formaldeído, uma amostra é sonicada. A amostra é então submetida a imunocoloração com antigénio específico da formiga primárioibodies e anticorpos secundários marcados com fluorescência para visualizar os tipos de células-alvo e as proteínas específicas, através de microscopia de fluorescência. Durante o processo de sonicação, a colocação adequada de uma sonda de ultra-sons acima da amostra, bem como a duração e intensidade de ultra-sons, é crítica. Pequenas modificações adicional a protocolos de positividade padrão pode ser necessária para manchas de alta qualidade. Para os anticorpos com baixa relação sinal-ruído, o tempo de incubação mais longos são tipicamente necessário. Como prova de conceito para este protocolo facilitou-sonificação, mostramos immunostains de três tipos de tecidos (testículos, ovários e tecidos neurais) em uma série de estágios de desenvolvimento.

Para demonstrar a eficácia de imunocoloração à base de ultra-sons na análise de embriões de fase final e tecidos larvais in situ, os embriões de tipo selvagem e as larvas foram processadas para imuno-coloração dos testículos, dos ovários, e tecido neural. As amostras foram fotografadas por microscopia confocal e os resultados representativos são mostrados (Figura 1 e Figura 2). Os resultados revelam que o protocolo descrito é eficaz para a visualização de caracte...

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Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.5K visualizações.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larval Dissection MNJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissecção e coloração de Drosophila Larval Ovários

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...