Nous sommes reconnaissants à Ruth Lehman et Dorthea Godt qui a gracieusement fourni les anticorps Vasa et Embouteillage. Nous tenons à remercier le Stock Center Bloomington à l&#39;Université d&#39;Indiana pour maintenir les stocks prévus et le développement des études Hybridoma Banque élaborées sous les auspices de la NICHD et entretenus par l&#39;Université de l&#39;Iowa. Nous remercions tous les membres du laboratoire Wawersik pour leurs conseils et leur soutien. Ce travail a été financé par le Programme de subventions Monroe Scholars (AF et LB) et NSF accorder IOS0823151 (à MW).

1: Préparation d&#39;une cage de collecte <ol><li> Anesthésier les jeunes, les mouches fertiles avec du CO 2. Transfert mouches anesthésiés dans une cage. Pour obtenir un rendement optimal, utilisez 100-120 mouches adultes allant de 2-7 jours d&#39;âge à un ratio de 4: 1 femmes-hommes. Laisser vol une période d&#39;acclimatation appropriée, ~ 24 heures avant d&#39;obtenir l&#39;échantillon pour la fixation. Si la cage a été mis en place avec des femelles vierges accouplées à des mâles, une utilisation de 36 - période d&#39;acclimatation de 48 h. </li><li> Sur l&#39;extrémité ouverte de la cage, placer une plaque de gélose de jus de pommes préalablement préparée avec une goutte de taille dime de la pâte de levure dans le centre au-dessus de l&#39;ouverture de la cage. Ensuite, fixez avec du ruban adhésif. Sceller la jonction entre la plaque de gélose de jus de pomme et la cage avec du parafilm. </li><li> Placer la cage dans un récipient secondaire avec le jus de pomme plaque de gélose en tant que base et permettent de reproduire les mouches à une température définie pendant une période appropriée de temps tel que déterminé par l&#39;expérience. Remarque: Les temps de prélèvement d&#39;échantillons will varier. Par exemple, lors de la collecte des embryons à un stade avancé / larves L1 précoce (17 - 24 h), permettre à mouches pondent leurs œufs sur des plaques de gélose de jus de pomme pendant 7 heures à 25 ° C avant le vieillissement de l&#39;échantillon pendant 17 heures à 25 ° C. De même, pour une collection de mi-fin du premier stade larvaire (36-48 h) permettent mouches pondent des œufs pendant 12 heures à 25 ° C avant le vieillissement de l&#39;échantillon pendant 36 heures à 25 ° C. </li><li> Une fois la période terminée, appuyez sur la cage sur une table afin que les mouches tombent loin de la plaque de gélose de jus de pomme sans anesthésie. Remplacer rapidement la plaque utilisée par une nouvelle contenant une goutte de pâte de levure. Fixez la nouvelle plaque avec du ruban adhésif et du parafilm et stocker la cage avec du jus de pomme plaque de gélose comme base. </li><li> Retirez délicatement la chute de la levure de la plaque utilisée avec une spatule métallique. Placer le couvercle sur la plaque utilisée pomme de jus et permettent mis embryons à l&#39;âge si nécessaire expérimentalement. Remarque: Si le vieillissement des échantillons, des plaques peuvent être conservés à 25 ° C, sauf si des températures plus élevées sont experimentally requis. Des exemples de la façon d&#39;embryons pour la collecte sont décrites ci-dessus l&#39;âge (voir la note pour l&#39;étape 1.3). Retrait de la pâte de levure avant vieillissement échantillon est effectuée à empêcher les larves de ramper dans la levure et de briser l&#39;agar-dessous. L&#39;agar de jus de pomme et pâte de levure résidu restant à fournir des nutriments pour la croissance des larves. Lorsque des embryons fixés directement à la pâte de levure sont perdus à travers le retrait de la pâte de levure, cette perte est préférable de levure et de la gélose résidu de l&#39;échantillon qui peut réduire l&#39;efficacité de coloration. Faut-il choisir de ne pas retirer la pâte de levure, levure peut être liquéfié avec un tampon phosphate de Triton X-100 (PbTx), mélangé avec un pinceau, puis retiré de l&#39;échantillon avec un tamis cellulaire avant la fixation. </li></ol> 2 Fixation <ol><li> Une fois les embryons fixés sur la plaque de gélose jus de pomme ont vieilli au point de temps souhaité, utiliser un petit pinceau humidifié avec un tampon phosphate de Triton X-100 (PbTx) solution pour éliminer soigneusement échantillon de eplaque de e. Remarque: Les larves plus âgées sont mobiles et peuvent ramper sur l&#39;intérieur du couvercle. Cet échantillon peut être prélevé de façon similaire par élimination avec un pinceau. </li><li> Essuyer le pinceau de l&#39;échantillon chargé contre l&#39;arête intérieure face d&#39;un tamis cellulaire. Ensuite, rincer les parois de la crépine et le pinceau avec un vaporisateur contenant une solution PbTx. Placez un couvercle de boîte de Pétri sous le filtre pour capturer la solution PbTx. </li><li> Après tout l&#39;échantillon a été transféré à la passoire, verser suffisamment PbTx dans la crépine d&#39;augmenter l&#39;échantillon de la maille. Ensuite, soulevez le filtre et verser le contenu de la boîte de Pétri dans un conteneur de déchets liquides. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.3 de trois fois pour éliminer les levures et volent déchets qui peuvent avoir été transférés avec l&#39;échantillon. </li><li> Verser suffisamment d&#39;eau de Javel à 50% (NaOCl) / eau (le trou DDH 2 O) solution dans le filtre à élever les larves au large de la maille. Laisser les larves de s&#39;asseoir dans une solution pendant 5 min. Ensuite, soulevez le filtre et versez til contenu de la boîte de Pétri dans un récipient à déchets. Remarque: Bleach est nécessaire uniquement dans les échantillons embryonnaires âgés de 0 à 22 heures afin de retirer la membrane chorionique. L&#39;application d&#39;eau de javel à des échantillons plus âgés peut être omis, mais son inclusion n&#39;est pas préjudiciable. Si omission est souhaitée, remplacer l&#39;eau de Javel dans cette étape avec PbTx. L&#39;eau de Javel diluée doit être utilisée dans les 24 heures de préparation de la solution. </li><li> Laver l&#39;échantillon dans la passoire avec PbTx en versant assez PbTx dans la passoire pour recueillir l&#39;échantillon large de la maille. Laisser l&#39;échantillon reposer dans la solution pendant 3 min. Ensuite, soulevez le filtre et verser le contenu de la boîte de Pétri dans un conteneur de déchets liquides. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.6 cinq fois. </li><li> Tamponner le fond de la crépine de la cellule sèche, puis transférer l&#39;échantillon dans un flacon à scintillation contenant 1,75 ml de solution à l&#39;aide d&#39;un pinceau PEMS. </li><li> Travailler dans une hotte ventilée, ajouter 250 ul de formaldehyde à 37% et 8 ml d&#39;heptane de qualité réactif dans le flacon de scintillation. <br/&gt; Remarque: le formaldéhyde et l&#39;heptane sont dangereux. Pour des raisons de sécurité, continuera à travailler dans une hotte ventilée et porter des gants appropriés pour les étapes 2.9 à 3.3. </li><li> Amener le flacon à agiter à 200 tours par minute ou une vitesse modérée similaire pour 20 min. </li><li> Ajouter 10 ml de methanol à scintillation fiole sans enlever la phase aqueuse précédente et permettre à la fiole à secouer vigoureusement à 500 rpm pendant 1 min. Remarque: Le méthanol est dangereux. Continuer à travailler dans une hotte ventilée et porter des gants appropriés. </li><li> Retirer le flacon de secoueur et immédiatement verser le contenu dans un tamis cellulaire sur un récipient à déchets dans la hotte. Ajouter méthanol supplémentaire pour le flacon et courir à travers la crépine si nécessaire cellulaire pour s&#39;assurer que tout échantillon a été supprimé. Remarque: filtres cellulaires peuvent s&#39;écouler lentement. Pour y remédier, un toucher de tissu de laboratoire à la partie inférieure de la crépine de la cellule afin d&#39;aspirer la solution à travers le filtre plus rapidement. Le méthanol, le formaldéhyde, l&#39;heptane et doit êtreentreposés dans des contenants de déchets appropriés jusqu&#39;à ce que l&#39;élimination appropriée conformément aux directives institutionnelles. </li><li> Fond sec de filtre cellulaire en utilisant un tissu de laboratoire, puis utilisez un pinceau pour transférer l&#39;échantillon capturé dans la passoire à un tube de 1,5 ml contenant 0,5 ml de méthanol. Remarque: Si plusieurs flacons de scintillation sont en cours d&#39;utilisation, suivez les étapes 2.12 et 2.13 un flacon à la fois pour éviter échantillon de séchage sur tamis cellulaires. </li><li> Une fois que l&#39;échantillon a été ajouté au tube à centrifuger, éliminer le methanol avec une pipette. Assurer échantillon a déposé au fond du tube. </li><li> Rincer l&#39;échantillon dans le tube à centrifuger en ajoutant environ 0,5 ml de methanol à tube. Attendez échantillon à régler puis retirez du méthanol avec une pipette. </li><li> Répétez l&#39;étape 15 trois fois. </li><li> Ajouter 0,5 ml de methanol pour le tube, et ensuite stocker dans un congélateur à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 3. réhydratation et Préparation de l&#39;échantillon pour Immunocoloration <ol><li> Retirer le methanol du microtube avec une pipette, en laissant l&#39;échantillon dans le tube. Magasin méthanol déchets dans le conteneur de déchets approprié jusqu&#39;à ce que le temps de mise au rebut. Remarque: Pour améliorer l&#39;efficacité du traitement par ultrasons, n&#39;utilisent pas plus de 3 mm de l&#39;échantillon sont installés au fond du tube de 1,5 ml. L&#39;excès de l&#39;échantillon peut être transféré dans un tube séparé avec une pipette avant de commencer l&#39;étape de réhydratation ci-dessus. Coupe de la pointe de pipette avec une lame de rasoir stérile peut être utilisé pour éviter le colmatage de la pointe de pipette. </li><li> Ajouter 1,0 ml d&#39;un mélange méthanol / tampon phosphate Tween (PBTw) solution à 50% dans le tube et le rock pendant 3 min. </li><li> Enlever la solution de méthanol dans le conteneur des déchets et rincer avec 1,0 pi de PBTw deux fois. Après chaque rinçage, laisser l&#39;échantillon se déposer avant le soutirage PBTw avec une pipette. </li><li> Ajouter 1,0 ml de sérum-albumine bovine / tampon phosphate Tween (BBTw) mélanger le flacon et le rock. Après 3 min sur une bascule, permettre à la sample pour régler et retirer le BBTw avec pipette. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.4 deux fois en prenant soin d&#39;enlever autant que possible BBTw sans perdre échantillon après le dernier lavage. </li><li> Ajouter 0,5 ml de BBTw au tube et placer le tube sur de la glace. </li></ol> 4 La sonication de l&#39;échantillon <ol><li> Réglez le dispositif de traitement ultrasonique à 10% d&#39;amplitude maximale et désigner un temps de fonctionnement de 2 sec sonication constante. Remarque: Ces paramètres sont spécifiques à l&#39;appareil à ultrasons indiqué dans les matériaux et les ustensiles de table et peuvent nécessiter l&#39;optimisation pour différentes sonicateurs. </li><li> Avant de sonication de l&#39;échantillon, nettoyer la sonde de sonication en plaçant la pointe de la sonde dans un tube conique de 50 ml remplie de déminéralisée sonique eau et course à nettoyer la sonde. Sonde de sonication à sec avec un tissu de laboratoire après course. </li><li> Plonger la sonde dans le tube à centrifuger contenant l&#39;échantillon afin qu&#39;il soit positionné environ 3 à 4 mm au-dessus de l&#39;échantillon et commencer à ultrasons. </li><li> Retirez le mTube icrocentrifuge et le placer sur de la glace pendant au moins 30 secondes pour dissiper la chaleur à partir de sonication et permettre à l&#39;échantillon se déposent au fond du tube à centrifuger. </li><li> Répétez les étapes 4.3 et 4.4 selon les besoins en fonction de l&#39;âge de l&#39;échantillon en cours de traitement. Remarque: Pour un volume d&#39;échantillon de sonication optimale, les embryons de moins de 17 heures ne nécessitent pas de traitement par ultrasons, mais celles entre 17 et 24 heures (stade 17 / début-L1) nécessitent deux sonications. Les larves entre 24 à 36 (début / mi-L1), 36-48 (mi / fin-L1), 48 - 60 (début / mi-L2) 60 - 72 (mi / fin-L2), 72-84 ( début-L3), 84-96 (début / mi-L3), 96-108 (mi / fin-L3) h nécessitent 5, 9, 11, 13, 15, 18, et 22 sonications respectivement. Voir discussion pour de plus amples précisions sur les temps de sonication. </li><li> Rincer BBTw deux fois avec 1,0 ml. Après chaque rinçage laisser l&#39;échantillon à régler avant de tirer hors BBTw avec une pipette. </li><li> Ajouter 1,0 ml de BBTw dans le flacon et le rock. Après 3 min sur la bascule, laisser l&#39;échantillon se régler et retirer le BBTw avec pipette. &lt;/ Li&gt; <li> Répétez l&#39;étape 4.7 deux fois. </li></ol> 5. Immunocoloration <ol><li> Bloquer échantillon par addition de 5% de sérum dilué dans BBTw normale au tube à centrifuger. Retirer le bloc après bascule pendant 1 heure. Remarque: Utilisez un sérum normal de l&#39;espèce dans laquelle les anticorps secondaires sont générés. </li><li> Diluer anticorps primaires de s&#39;approprier la concentration de travail dans 5% solution normale de sérum / BBTw. </li><li> Roche échantillon en solution d&#39;anticorps primaire O / N à 4 ° C ou pendant au moins 3 heures à température ambiante (22 ° C environ. Remarque: Les durées et les températures d&#39;incubation d&#39;anticorps peuvent varier. O / N incubation à 4 ° C et 3 heures à température ambiante est généralement suffisante. Cependant, une période d&#39;incubation de deux jours, peut améliorer la qualité de la teinture, en particulier avec des échantillons plus âgés ou lorsque des anticorps primaires de faible affinité sont utilisés. Incubations plus longues sont généralement effectuées à 4 ° C. Des considérations similaires doivent être prises lors de l&#39;utilisation des anticorps secondaires (voir 5.10). </li><li> Laisser l&#39;échantillon de s&#39;installer àfond du tube de centrifugeuse. Prélever des anticorps primaires avec pipette. Enregistrer anticorps pour la réutilisation, si désiré. </li><li> Rincer deux fois avec 1,0 ml de BBTw. Après chaque rinçage permet échantillon de régler avant de tirer hors BBTw avec une pipette. </li><li> Ajouter 1,0 ml de BBTw dans le flacon et le rock. Après 3 min sur la bascule, permet échantillon de régler et retirer BBTw avec pipette. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.6 cinq fois. </li><li> Bloc échantillon par addition d&#39;une solution à 5% / BBTw de sérum normal de la microtube. Retirer le bloc après bascule pour 30 min à 1 h. Remarque: Cette étape de blocage supplémentaire n&#39;est pas nécessaire, mais peut améliorer la qualité de la coloration d&#39;anticorps spécifiques. </li><li> Diluer anticorps secondaires de s&#39;approprier la concentration de travail dans 5% solution normale de sérum / BBTw. </li><li> Enveloppez microtube dans une feuille d&#39;aluminium pour réduire la décoloration due à l&#39;exposition de la lumière. Roche échantillon dans une solution d&#39;anticorps secondaire pendant 12 à 48 heures à 4 ° C ou pendant au moins 3 heures à température ambiante (environ 22 ° C. </li><li> Laisser l&#39;échantillon à déposer au fond du tube de centrifugeuse. Prélever Anticorps secondaires à la pipette. </li><li> Rincer deux fois avec 1,0 ml de PBTw. Après chaque rinçage permet échantillon de régler avant de tirer au large de la PBTw avec une pipette. </li><li> Ajouter 1,0 ml de PBTw dans le flacon et le rock. Après 5 min sur la bascule, laisser l&#39;échantillon se régler et retirer le PBTw avec pipette. </li><li> Répétez l&#39;étape 5.13 trois fois. </li><li> OPTION: Ajouter DAPI dilué 1: 1000 dans PBTw. échantillon de roche enveloppé dans une feuille d&#39;aluminium pendant 3 min; puis retirez solution DAPI avec une pipette. Rincer cinq fois avec 1,0 ml de PBTw, permettant échantillon de régler avant de retirer PBTw avec pipette. </li><li> Ajouter 80 - 100 ul de 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) solution pour microtube et conserver à -20 ° C. Note: Un autre agent anti-décoloration à base de glycérol peut être remplacé par. </li></ol> Analyse 6. <ol><li> Avant de montage d&#39;échantillons sur des lames, ajouter un supplémentaire 5 - 10 pi de DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade solution pour microtube. Remarque: l&#39;échantillon peut être ajouté à des diapositives sans dissection. ajouter le volume à une lame de l&#39;échantillon varie avec la taille de housse. Lorsque pipetage échantillon sur la glissière, la pointe de la pipette peut être coupé avec une lame de rasoir pour éviter échantillon cisaillement. Il est souvent utile d&#39;aligner l&#39;échantillon en rangées pour faciliter l&#39;analyse. L&#39;ajout de PPD en tant qu&#39;agent de antifade supplémentaire ne peut être tenu, mais peut empêcher photoblanchiment si les échantillons sont stockés à long terme. </li><li> Placez délicatement couvercle en verre glissement sur échantillon. Ensuite, lamelle fixer en place à l&#39;aide de vernis à ongles. </li><li> Voir monté échantillon en utilisant la microscopie de fluorescence. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li><li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila.">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li><li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal.">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li><li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li><li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila.">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li><li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ce protocole fournit un procédé pour cibler avec succès immunocoloration embryonnaire de Drosophila et tissus larvaires in situ, ce qui élimine la nécessité d&#39;une dissection. Selon les protocoles antérieurs pour la coloration des embryons précoces 1,2,3, la membrane chorionique est éliminé en utilisant 50% de javel (NaOCl). Les échantillons sont fixés dans du formol et du méthanol. Parce que la cuticule des larves provoque échantillon âgé de flotter, la totalité de l&#39...

Embryons de drosophile et les larves fournissent un excellent modèle pour étudier les processus de développement dans de nombreux organes et tissus. L&#39;imagerie de cellules individuelles est souvent nécessaire dans ces études afin de déterminer les milieux complexes dans lesquelles les cellules se développent. La visualisation des cellules dans les tissus peut être réalisée par coloration immunologique. Bien décrits immunomarquage protocoles existent pour les tissus embryonnaires de drosophile &lt;17 h après la ponte (AEL) 1-3. Cependant, une protection formes de la cuticule vers la fin de l&#39;embryogenèse, empêchant la pénétration d&#39;anticorps efficace. Ainsi, ces protocoles immunocoloration sont inefficaces dans l&#39;analyse des tissus d&#39;embryons à un stade avancé et dans les étapes ultérieures du développement larvaire (1er stade (L1), 2 ème stade (L2), et 3 e stade (L3)). Cette inefficacité impose un obstacle à notre compréhension des processus dynamiques qui se produisent pendant cette période de développement prolongée 4. Tissue dissection est une technique largement utilisée pour contourner cette barrière 5-7. Cependant, la dissection peut se révéler inefficace. L&#39;extraction peut être encombré par la difficulté à trouver ou à isoler l&#39;embryon et les tissus des larves. En outre, l&#39;élimination physique des tissus cibles peut causer des dommages par les rompre ou en omettant de les extraire dans leur intégralité. La sonication est une méthode qui utilise des ondes sonores pour perturber les interactions intermoléculaires. Elle a été utilisée pour perturber l&#39;intégrité de la cuticule des larves de Drosophila immunocoloration pour développer des types cellulaires neuronaux 6. Ce protocole a été adapté pour immunocoloration embryonnaire à un stade avancé et les gonades des larves, qui peuvent être aussi petites que 50 microns de diamètre 8-10. Grâce à ces études, le processus de cellules souches de la lignée germinale (CGC) formation masculine de niche a été caractérisé à un stade avancé embryons de drosophile 8-10 et les mécanismes régulant le développement des cellules souches et difdifféren- à un stade avancé gonades embryonnaires et les larves ont été élucidée 9-12. Ainsi, la sonication fournit une alternative efficace à la dissection de tissu qui peut être difficile en raison de la taille des tissus. En outre, il permet l&#39;immunomarquage des tissus de Drosophila in situ, ce qui laisse les cellules dans le cadre de l&#39;ensemble de l&#39;organisme et le maintien de la morphologie in situ. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la fluorescence immunomarquage de l&#39;embryon à un stade avancé grâce à début / mi-L3 tissus in situ. Analyse de la drosophile gonadique et le tissu nerveux est représenté dans les résultats représentatifs pour démontrer l&#39;efficacité de ce protocole. De plus, ce protocole d&#39;immunocoloration peut être adapté pour analyser d&#39;autres tissus de Drosophila ainsi que des tissus chez d&#39;autres organismes par une cuticule externe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1: Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)</td>
			<td>For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)</td>
			<td>For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4</td>
			<td>Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEMS</td>
			<td>0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH</td>
			<td>Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>37% formaldehyde by weight in methanol</td>
			<td>Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>n-Heptane</td>
			<td>CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Methanol</td>
			<td>CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Tween (PBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%</td>
			<td>Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O</td>
			<td>Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td>To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol</td>
			<td>In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution</td>
			<td>1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)</td>
			<td>Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple juice plates</td>
			<td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O</td>
			<td>Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept 10%</td>
			<td>To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol</td>
			<td>Store aliquots at -20 degrees C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast paste</td>
			<td>~50 g Dry Active Yeast</td>
			<td>Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2: Staining Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571 //// Stock at 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Vasa</td>
			<td>1:250</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Ruth Lehmann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasciclin III</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>7G10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-1B1</td>
			<td>1:4</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>1B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guniea pig anti-Traffic Jam</td>
			<td>1:2500</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prospero</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Prospero MR1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-Elav</td>
			<td>1:30</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Rat-elav 7EBA10 anti-elav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Repo</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>8D12 anti-Repo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa546</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-guniea pig Alexa633</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rat Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3: Materials and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cages</td>
			<td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td>
			<td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model #: 102C (CE)</td>
			<td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-25-20</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td>
			<td>Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td>
			<td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>450-0020</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

Les études réalisées chez Drosophila melanogaster embryons et des larves donnent un aperçu essentiel dans les processus de développement tels que la spécification du destin cellulaire et l&#39;organogenèse. Immunomarquage permet la visualisation de tissus et organes en développement. Cependant, une cuticule protectrice qui se forme à la fin de l&#39;embryogenèse empêche la pénétration des anticorps dans des embryons à un stade avancé et des larves. Bien que la dissection avant immunomarquage est régulièrement utilisé pour analyser les tissus des larves de drosophile, il s&#39;avère inefficace pour certaines analyses parce que les petits tissus peuvent être difficiles à localiser et isoler. Le traitement par ultrasons offre une alternative à la dissection dans les protocoles de larves de drosophile immunomarquage. Il permet d&#39;obtenir rapidement un traitement simultané d&#39;un grand nombre d&#39;embryons à un stade avancé et des larves et maintient la morphologie situ. Après fixation dans le formol, un échantillon est soumis à une sonication. L&#39;échantillon est ensuite soumis à une coloration immunologique spécifique de l&#39;antigène avec ant primaireet ibodies Anticorps secondaires marqués par fluorescence pour visualiser types de cellules cibles spécifiques et des protéines par microscopie de fluorescence. Au cours du processus de sonication, une mise en place correcte de la sonde de sonication ci-dessus de l&#39;échantillon, ainsi que la durée et l&#39;intensité de la sonification, est critique. Modifications mineures supplementaires aux protocoles d&#39;immunomarquage standard peuvent être nécessaires pour les taches de haute qualité. Pour les anticorps ayant un faible rapport signal à bruit, de plus longs temps d&#39;incubation sont typiquement nécessaires. Comme une preuve de concept pour ce protocole de traitement par ultrasons facilitée, nous montrons immunomarquages ​​de trois types de tissus (testicules, ovaires, et des tissus neuronaux) à une série de stades de développement.

Pour démontrer l&#39;efficacité de l&#39;immunomarquage base ultrasons dans l&#39;analyse de l&#39;embryon à un stade avancé et les tissus des larves in situ, les embryons de type sauvage et des larves ont été traitées pour immunomarquage des testicules, des ovaires, et le tissu neural. Les échantillons ont été imagées par microscopie à foyer commun et les résultats représentatifs sont présentés (figure 1 et figure 2). Les résultats montrent que le protocole d?...

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Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

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JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.6K vues.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

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Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire

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