Name: dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad
Uploaded: 2020-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
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我々は、この議定書の早期開発に多大な貢献をしたLindsey W. PlasschaertとJustin Suiに感謝したい。著者らは、試薬に対する寛大さ、特にルース・レーマンとベンジャミン・リンが、出版前に Nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'ラインを贈呈したことに感謝しています。ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(NIH P40OD018537)から得られたストックを本研究に使用した。この作業は、NIH RO1 GM060804、R33AG04791503、R35GM136270(S.D.)、およびトレーニング助成金T32GM007229(B.W.)およびF32GM125123(L.A.)によって支援されました。

1. 解剖前日の準備
<ol><li>得られた直径が約0.03mmとなるようにタングステン針24 を電解的に鋭くする。供給電圧を約14Vに調整し、3.3MのNaOHを使用してください。シャープニングには1〜2分しかかかりません。 注意:NaOHは非常に腐食性があり、皮膚と接触すると火傷を引き起こします。取り扱い中は手袋とゴーグルを着用し、ヒュームフード内で作業してください。 注:使用後は、NaOHをポリプロピレン製のファルコンチューブに保管してください。</li>
	<li>準備した撮像媒体を作る。15 mL の円錐管で、4.25 mL のシュナイダー培地を 750 μL のウシ胎児血清 (FBS、最終濃度 15%)および 27.5 μL のペニシリン-ストレプトマイシン (0.05 U/μL のペニシリン、0.05 μg/μL の最終濃度) と組み合わせます。この調製した撮像媒体を4°Cで保存する。</li>
	<li>ヘプタン接着剤溶液を作る。約20 cmの両面テープで詰めた20 mLの密封可能なバイアルに約0.5 mLのヘプタンを加える。ヌテーターを約1時間揺らすか、水とグリセロールの一貫性が達成されるまでピペットチップで攪拌します。溶解した接着剤のこの溶液は、ヘプタンが蒸発する前に数日間持続する。溶液を新鮮にするために、さらに0.5mLのヘプタンを加え、そして岩を加える。 注:効果的なヘプタン接着剤溶液は、テープに対するヘプタンの様々な比率、ならびに様々なロッキング/攪拌の持続時間を使用して調製することができる。上記の仕様は、そのような適切な解決策の1つを調製または新鮮化するための単なる提案である。</li>
</ol>2. 胚採取—解剖の15~17時間前
<ol><li>りんご果寒天プレート25に新鮮な酵母ペーストを加える。小さな穴26で穿孔された空の食物瓶に成虫のハエ(生後10日未満)を加えて胚採取ケージを設置する。酵母寒天プレートを用いて収集ケージに蓋をし、ボトルにテープを貼り、プレート側を下にしてケージを25°Cの暗所インキュベーター内に1時間置いた。 注:ハエは、胚の解剖が実体蛍光顕微鏡下で行われるため、生殖巣を蛍光的にマークする導入遺伝子、例えば six4-eGFP::Moesin20を発現しなければならない。生殖腺をマークするために使用される遺伝子型のリストについては、 材料表 を参照してください。</li>
	<li>インキュベーターからケージを取り出し、この最初のコレクションを捨てます。それを新しく酵母たての寒天プレートと交換し、ケージをインキュベーターに2時間戻します。 注:最初の胚収集は、受精し、発達中の胚の雌をクリアし、タイトなタイミングの胚の第2の収集を達成するために使用される。</li>
	<li>寒天プレートをケージから取り出し、密封可能なプラスチック容器内の湿ったペーパータオルの上に(酵母の側を上に向けて)置きます。この湿ったチャンバーを25°Cのインキュベーターに入れ、胚を14.5時間熟成させます(最終年齢、産卵後14.5〜16.5時間)。 メモ: 手順 2.4 を開始する直前に、手順 3.1 および 3.2 を完了します。</li>
	<li>寒天プレートをインキュベーターから取り出し、ホヤボトルを使用して、寒天プレートに十分な水を加え、ペイントブラシで軽くブラッシングして酵母ペーストを溶解させる。胚をすすぎ、酵母を計量ボートの中に置かれた小さなメッシュスクリーンバスケットに溶かします。ほとんどの酵母ペーストがメッシュを通してろ過されるまで、水ホヤボトルでバスケットをすすいでください。</li>
	<li>計量ボートから水を取り除き、バスケットを中に入れ直します。胚を50%漂白剤溶液に浸すことによって胚を脱絨毛し、ホヤ瓶を使用する。漂白剤溶液の深さは3〜5mmでなければなりません。胚を漂白剤に沈めて約2分間保ち、時折渦巻く。 警告: 漂白剤は腐食性があり、目や気道を刺激したり損傷させたりする可能性があります。漂白剤を取り扱うときは、手袋とゴーグルを着用してください。 メモ: この間、ステップ 3.3 のできるだけ多くを完了して下さい。脱絨毛の進行は、バスケットを実体顕微鏡下に置き、背側付属器がないかどうかを確認することによって確認することができる。必要に応じて、胚を漂白剤溶液にさらに時間沈める。</li>
	<li>漂白剤を捨て、バスケット内の胚をホヤ瓶の水で徹底的にすすいでください(約3秒間、メッシュバスケットをペーパータオルで吸い取り、2〜3回繰り返します)。</li>
</ol>3. 解剖日の準備
<ol><li>1.5 mL エッペンドルフチューブ (最終濃度 0.2 mg/mL) で 1,500 μL 調製したイメージング培地 (ステップ 1.2 を参照) に 30 μL インスリン (10 mg/mL) を追加します。よく混ぜ合わせ、チューブをベンチトップに残して室温まで平衡化します。</li>
	<li>接着剤でコーティングされたカバースリップストリップを準備します。<ol>
<li>ダイヤモンドの先端を持つナイフを使用して、22 mm x 22 mmのカバースリップを4つの同じサイズのストリップに切ります(図1A)。</li>
		<li>鉗子を使用してストリップを1つ拾い上げ、合計約30μLのヘプタン接着剤溶液をストリップの両側に広げます(図1B)。接着剤残渣の均一な層を達成するには、ヘプタンが蒸発している間にストリップを様々な角度で傾ける。</li>
		<li>接着剤で覆われたストリップをカバースリップボックスの空のスロットに保管してください。粘着性を維持するには、ストリップを斜めに、しかし直立した位置に置き、箱の端にもたれかかって箱の表面との接触を最小限に抑えます(図1C)。空気中の微粒子が接着剤をコーティングし、その粘着性を軽減しないように箱を閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ベンチトップに次のアイテムを置きます:6インチガラスパスツールピペット、顕微鏡スライド、適切なピペットチップを備えたP200およびP1000ピペットマン、リンゲル溶液27 (NaOHでpHを7.3に調整)、および覆われていないPoly-D-リジンコーティングされた35mmイメージングディッシュ。</li>
	<li>メッシュスクリーンバスケットから、500~750μLのヘプタンで満たされた小さな時計皿に胚を移す。<ol>
<li>バスケットの側面と底をティッシュワイプで乾かします。絵筆をヘプタンで湿らせ、絵筆を胚に触れ(疎水性ビテリン膜が剛毛に付着するはずです)、絵筆を時計皿のヘプタンに戻します(胚は下に沈むはずです)。 注:胚が乾燥するのを防ぐために、次のステップをできるだけ早く実行する必要があります。胚は20秒以上空気に曝されるべきではありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パスツールピペットを用いて胚を顕微鏡スライド上に移す(図1D)。胚をゆっくりとピペットに引き込み、ピペットの狭い部分に制限します。ピペットの胚はゆっくりとスライド上に形成され、スライドに流れる前にピペットの先端のすぐ内側に凝集します。ティッシュワイプの角を細かい先端にねじり、スライド上の胚からヘプタンを吸い取ります。それらは集約され、より小さな領域をカバーするため、次のステップで接着剤で覆われたストリップにそれらをキャプチャすることが容易になります。</li>
	<li>鉗子で、接着剤で覆われたストリップを拾い上げ、それを胚にそっと触れます(図1E)。ストリップを画像化皿に置き、胚をサイドアップし、Poly-D-リジンコーティングされた中心のすぐ外側に置きます。鉗子を使用してストリップを皿に押し付け、所定の位置に固定されていることを確認します。直ちに2〜3.5mLのリンゲル溶液で皿を浸す。胚が乾燥するのを防ぐために、最初に胚を沈めます(図1F)。</li>
</ol>4. 解剖
メモ:これらの手順は、実体蛍光顕微鏡下で実行する必要があります。
<ol><li>10〜15個の胚をデビテリン化する。 注:これは、初心者のための2つの胚から、専門家のための15個の胚まで及ぶかもしれません。<ol>
<li>腸の形態に基づいてステージ16の胚を選択します(図2)。この段階では、胚には3つの腸狭窄があり、4つの積み重ねられた腸セグメントを作り出します(図2 B、B ')。デビテル化を開始するには、選択した胚をタングステン針で一端、好ましくは前部に突き刺す。胚はそのビテリン膜から飛び出すことがありますが、そうでない場合は、胚から膜を剥がします。 注:解剖するには若すぎる胚は、非局所化された腸を有する(図2C)。ステージ17胚の解剖は可能であるが、キューティクルがこの段階で発達し始めているため、ステージ16胚の解剖よりも困難である。初期段階17胚は、互いに相対的にシフトした4つの腸管セグメントを有する(図2D,D ́)。</li>
		<li>生殖腺から遠く離れた領域の胚に針を引っ掛ける。引っ掛けられた胚を皿のポリリジンコーティング領域(ここ以降は単に「カバースリップ」と呼ばれる)に移し、それが付着するまで底にドラッグする。これらのステップを繰り返し、ポリリジンコーティングされたカバースリップの上部に沿って一列にデビテリン化胚を配置し(図3A)、さらなる解剖のために下に十分なスペースを残します。 注:生殖巣は、使用される特定のマーカーおよび導入遺伝子のコピー数に応じて、明るく蛍光を発するはずの細胞の小さな球状の凝集体として現れる。この段階では、生殖腺はセグメントA5において横方向に位置し、前部からの胚長の約70%〜80%に位置する。解剖プロトコル全体を通して、組織は針にくっつくことがあります。針から破片を取り除くには、リンガーの溶液の表面のすぐ上に持ち上げます。デビテリン化は、生殖腺の適切なものができるだけ乱されない限り、乱れにくいことがあります。</li>
	</ol></li>
	<li>生殖腺を胚から取り出して皿にフィネスします(図3C、D)。<ol>
<li>まず、胚をファイリングしてその内部を露出させます(図3C)。胚をその中心からスライスし、針を後方に、生殖腺の間で移動させる。これは外部のキューティクルよりもはるかによく皿にくっつくので、いくつかの内部組織をからかいます。組織の粘着性は、生殖腺を明らかにし、それがカバースリップに付着することを可能にする次の操作を可能にする。 注:組織が皿に付着していない場合は、コーティングされたカバースリップの汚染されていない領域に同軸にしてみてください。カバースリップの外側の領域は特に粘着性があります。ステップ4.1.2で述べたように、生殖腺が無傷のままである限り、解剖操作によって胚の死体が壊れたかどうかは問題ではない。</li>
		<li>針を使用して生殖腺の周りをスライスし、生殖腺を含む組織の一部が残りの死体から分離されるまで切ります。針で、この組織をコーティングされたカバースリップの新鮮な領域に引き込み、それが皿に付着するまで底に同軸にします。 注:最良のイメージングは、生殖腺自体がカバースリップに直接付着する場合に達成されます, オーバーリーティッシュを介して間接的に付着するのではなく、.したがって、組織が死体から遠ざかるように、生殖腺が無関係な組織ではなく、まずカバースリップに触れるように試みる。</li>
		<li>接着組織を針で生殖腺からそっと引き離すことによって、できるだけ多くの周囲の組織を生殖腺から取り除く(図3D)。生殖腺に直接触れると生殖腺が損傷することは避けてください(図4E)。生殖腺が皿に十分に接着されるようにするには、生殖腺の周りを緩やかな円運動で針を動かし、移動する場合は、残りの付着組織に針を触れ、粘着性のカバースリップの新鮮な領域に生殖腺を向けます。生殖腺の検出可能な動きがなくなるまでこのプロセスを繰り返します。</li>
		<li>胚の死骸に戻り、第2生殖巣を解剖する。このプロセスをできるだけ多くの胚で繰り返すが、25分を超えないようにしてください。組織生存率は、約40〜45分以上後にリンゲルの溶液中で損なわれます。</li>
	</ol></li>
	<li>解剖が完了したら、消えないマーカーを使用してイメージング皿の外縁にレジストレーションマークを追加し、解剖中の向きを記録します。</li>
	<li>接着剤でコーティングされたストリップを皿から取り出します。<ol>
<li>ストリップの下に一対の鉗子の底のプロングを静かに挿入し、ストリップを留めてゆっくりと上に傾けて、付着した生殖腺の乱れを最小限に抑えるために、リンガーの溶液のスロッシングをできるだけ少なくして皿から解放します。 注:ストリップは、解剖された生殖腺から離れて傾ける必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>リンゲル溶液のスロッシングを避けるように、皿をイメージング顕微鏡にそっと運びます。</li>
</ol>5. イメージング
<ol><li>ステージホルダー内に撮像皿を置き、レジストレーションマークを用いて、解剖時と同様におおよその向きで皿を配置する。明視野顕微鏡と低消費電力(約10倍)の対物レンズを使用して、カバースリップに付着している組織片を特定し、焦点を合わせます。接眼レンズの設定を切り替えて蛍光を明らかにし、両眼接眼レンズを使用して皿を体系的にスキャンし、イメージングソフトウェア内の各生殖腺の位置をマークします( 材料表を参照)。 注: 位置をマークする前に、生殖腺が視野の中央に配置されていることを確認してください。</li>
	<li>イメージング皿をホルダーに入れた状態でステージホルダーアセンブリ全体を慎重に取り外し、アセンブリをワークベンチに置きます。</li>
	<li>リンゲル溶液をインスリンを含む調製したイメージング媒体と交換する(ステップ1.2および3.1を参照)。<ol>
<li>P1000を使用して、イメージングディッシュの内側上部棚からすべてのリンゲル溶液を除去します(中央カバースリップ領域からリンゲル液をピペットで拭かないでください)。次に、P200に切り替えて、その先端を中央領域の残りのリンガーの表面のすぐ下に置きます。50~100 μLのリンゲルを慎重に除去する。ソリューション全体を削除しないでください。</li>
		<li>約200μLのイメージングメディアを引き出し、残りのリンゲルの表面のすぐ下にP200チップを再び配置して、このイメージングメディアをゆっくりと追加します。次に、残りのイメージングメディア(約1,300μL)をディッシュに加え、上棚の最外縁から開始します。ピペッティング中は、流体の中央ドームに向かって移動し、最終的にピペットチップを両方にブラッシングして2つをマージします。皿に蓋をします。 メモ:イメージングメディアは、蒸発を防ぐために、ディッシュの内径全体を深さ約2mmで覆う必要があります(図4D)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>顕微鏡を高出力対物レンズ(63x、1.2 NA)に切り替え、使用する対物レンズ(対物レンズに必要な液浸流体の種類と屈折率)に基づいて適切な浸漬流体を適用し、ステージホルダーアセンブリを交換します。明視野顕微鏡を使用して、イメージング皿の底に付着した組織に焦点を合わせます。 注: ステージが移動されなかった場合、目標がフォーカスされると、最後の生殖腺が視界に入ります。</li>
	<li>マークされた各生殖腺の位置をステップ実行し、必要に応じてその位置を調整します。画像の明瞭さ、生殖腺の性別などに基づいて、画像化する生殖腺を選択します。イメージング設定(マルチチャンネル、露光時間、レーザー強度、Zシリーズ増分、適切な間隔でのタイムラプスなど)をカスタマイズします。イメージングを開始します。 注:雄性生殖腺は、ニッチと生殖腺の反対側の端、男性特異的体性生殖腺前駆体(msSGP)と呼ばれる小さくて円形の体細胞のクラスターの両方の存在によって識別することができる。 64-eGFP::moesin蛍光マーカーを使用する場合、ニッチ細胞は生殖腺内で2番目に明るい細胞であり、最も明るいのはmsSGPである。この段階では、女性の生殖腺はニッチもmsSGPも持っていません。</li>
</ol>

<ol>
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E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

著者らは開示するものは何もありません。

性腺形成の間、胚性生殖巣、特に雄性生殖巣15内の幹細胞ニッチは、急速な形態学的変化を受ける。これらのダイナミックな変化の根底にある発達メカニズムは、ライブイメージング技術によって最もよく理解されます。しかしながら、胚期ステージ17では、大規模な筋肉収縮17の発症により生殖巣の生体内イメージングが不可能になる。このプロト?...

ショウジョウバエのメラノガスター精巣は、多くの動的な細胞プロセスの理解のためのパラダイムとして役立ってきました。このモデルの研究は、幹細胞分裂制御1,2,3、生殖細胞発生4,5、piRNA生物学6、7、8、およびニッチ幹細胞シグナル伝達事象9、10、11、12、13に光を当てた。このモデルは遺伝的に扱いやすいため有利です14,15,そして自然環境で幹細胞をライブイメージングできる数少ないものの1つです3,16,17,18。しかし、このモデルのライブイメージングは成体組織と初期胚期に限定されており、ニッチが最初に形成され機能し始めている正確な段階である後期胚の生殖腺動態に関する知識にギャップを残しています。
後期胚性生殖巣は球体であり、前部の体細胞ニッチ細胞と、より後方領域19全体にわたって体性生殖腺細胞によって嚢胞された生殖細胞とからなる。この器官は、初期段階17から17、20、21の初期胚までインビボで生きて画像化することができる。さらに、大規模な筋肉収縮の開始により画像化が妨げられる。これらの収縮は非常に深刻で、生殖腺を画像フレームから押し出すため、そのような動きは画像化ソフトウェアでは補正できません。私たちの研究室では、ライブイメージングのためのこのとらえどころのない時期に起こるニッチ形成のメカニズムを明らかにすることに興味を持っています。そこで、胚期16から生殖巣を生きた画像化するエクスビボアプローチを生かし、生殖腺発生のこの重要な時期における細胞ダイナミクスの研究を促進しました。私たちの研究室の以前の研究は、このex vivoイメージングがin vivo生殖腺発達を忠実に再現することを示しています17。この技術は、ショウジョウバエの胚性生殖腺にとってその種の最初で唯一のものです。
ここでは、後期胚期における生殖巣のエクスビボライブイメージングに必要な解剖プロトコルを提示する。このプロトコールは、薬理学的処置、または生殖腺内の特定の細胞系譜のトランスジェニック操作と組み合わせることができる。この技術を用いて、幹細胞ニッチ形成17のステップを画像化することに成功した。したがって、このイメージングアプローチは、自然環境内でニッチ形成の初期段階をリアルタイムで視覚化できるため、幹細胞生物学の分野にとって有益です15,17。この方法は幹細胞生物学の分野にとって有益であるが、細胞再配列22、細胞接着2、12、23、および細胞遊走23を含む、この発生時点の間に生殖腺で起こる任意の動的プロセスを視覚化するためにさらに適用可能である。したがって、この解剖プロトコルは、多くの基本的な細胞生物学的プロセスに関する私たちの理解を深めるでしょう。

<table><tbody><tr><td>Alfa Aesar Tungsten wire</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster:&lt;/em&gt; His2Av::mRFP1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>FBtp0056035</td><td>Schuh, Lehner, &amp;amp; Heidmann, Current Biology, 2007</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: nos&lt;/em&gt;-lifeact::tdtomato</td><td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td><td></td><td>Lin, Luo, &amp;amp; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#039;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin&lt;/em&gt;</td><td></td><td>FBtp0083398</td><td>Sano et al., PLoS One, 2012</td></tr><tr><td>Diamond-tipped knife</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Imaging dish</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td></tr><tr><td>Insulin, bovine</td><td>Sigma</td><td>l0516</td><td>Store aliquots at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-955</td><td></td></tr><tr><td>Nytex basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution</td><td></td><td></td><td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&amp;rsquo;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Media</td><td>GIBCO</td><td>21720-024</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

ショウジョウバエメラノガスター雄胚性生殖巣は、生殖細胞発生、piRNA生物学、およびニッチ形成を含むがこれらに限定されない発生生物学の様々な側面を研究するのに有利なモデルである。ここでは、生体内ライブイメージングが非常に効果のない期間に、生体外で生殖巣をライブイメージングする解剖技術を提示する。このプロトコルは、胚をイメージング皿に移し、適切に段階的に配列された雄胚を選択し、その構造的完全性を維持しながら周囲の組織から生殖腺を解剖する方法を概説する。解剖に続いて、生殖巣を共焦点顕微鏡を用いて画像化し、動的な細胞プロセスを視覚化することができる。解剖手順には正確なタイミングと器用さが必要ですが、一般的な間違いを防ぐ方法とこれらの課題を克服する方法についての洞察を提供します。我々の知る限り、これはショウジョウバエの胚性生殖腺の最初の解剖プロトコルであり、そうでなければアクセスできない時間枠の間にライブイメージングを可能にするでしょう。この技術は、薬理学的または細胞型特異的トランスジェニック操作と組み合わせて、天然の生殖腺環境において細胞内または細胞間で起こる動的プロセスを研究することができる。

「解剖準備の日」で説明したように画像化皿の調製を 図1に例示する。これらの方法は、最終的に、十分に水和した胚をカバースリップストリップに接着させ、これを皿の底に一時的に固定し、リンガーの溶液に沈める結果となるはずである(図1F)。ダイヤモンド先端のナイフを使用すると、22 x 22 mmのカバースリップを3~4本の小さなストリップにき...

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.2K ビュー.  University of Pennsylvania. ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

発生生物学

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

生物学

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Drosophila melanogaster Third Instar Larvaeのライブ脳外植片のイメージング

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

著者スポットライト:非対称細胞分裂ダイナミクスの調査:ショウジョウバエ幼虫の脳外植片のライブイメージングのためのプロトコル 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

後期胚性ショウジョウバエ生殖腺の解剖とライブイメージング

要約

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のライブイメージング

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

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