我々は、この議定書の早期開発に多大な貢献をしたLindsey W. PlasschaertとJustin Suiに感謝したい。著者らは、試薬に対する寛大さ、特にルース・レーマンとベンジャミン・リンが、出版前に Nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'ラインを贈呈したことに感謝しています。ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(NIH P40OD018537)から得られたストックを本研究に使用した。この作業は、NIH RO1 GM060804、R33AG04791503、R35GM136270(S.D.)、およびトレーニング助成金T32GM007229(B.W.)およびF32GM125123(L.A.)によって支援されました。

1. 解剖前日の準備
<ol><li>得られた直径が約0.03mmとなるようにタングステン針24 を電解的に鋭くする。供給電圧を約14Vに調整し、3.3MのNaOHを使用してください。シャープニングには1〜2分しかかかりません。 注意:NaOHは非常に腐食性があり、皮膚と接触すると火傷を引き起こします。取り扱い中は手袋とゴーグルを着用し、ヒュームフード内で作業してください。 注:使用後は、NaOHをポリプロピレン製のファルコンチューブに保管してください。</li>
	<li>準備した撮像媒体を作る。15 mL の円錐管で、4.25 mL のシュナイダー培地を 750 μL のウシ胎児血清 (FBS、最終濃度 15%)および 27.5 μL のペニシリン-ストレプトマイシン (0.05 U/μL のペニシリン、0.05 μg/μL の最終濃度) と組み合わせます。この調製した撮像媒体を4°Cで保存する。</li>
	<li>ヘプタン接着剤溶液を作る。約20 cmの両面テープで詰めた20 mLの密封可能なバイアルに約0.5 mLのヘプタンを加える。ヌテーターを約1時間揺らすか、水とグリセロールの一貫性が達成されるまでピペットチップで攪拌します。溶解した接着剤のこの溶液は、ヘプタンが蒸発する前に数日間持続する。溶液を新鮮にするために、さらに0.5mLのヘプタンを加え、そして岩を加える。 注:効果的なヘプタン接着剤溶液は、テープに対するヘプタンの様々な比率、ならびに様々なロッキング/攪拌の持続時間を使用して調製することができる。上記の仕様は、そのような適切な解決策の1つを調製または新鮮化するための単なる提案である。</li>
</ol>2. 胚採取—解剖の15~17時間前
<ol><li>りんご果寒天プレート25に新鮮な酵母ペーストを加える。小さな穴26で穿孔された空の食物瓶に成虫のハエ(生後10日未満)を加えて胚採取ケージを設置する。酵母寒天プレートを用いて収集ケージに蓋をし、ボトルにテープを貼り、プレート側を下にしてケージを25°Cの暗所インキュベーター内に1時間置いた。 注:ハエは、胚の解剖が実体蛍光顕微鏡下で行われるため、生殖巣を蛍光的にマークする導入遺伝子、例えば six4-eGFP::Moesin20を発現しなければならない。生殖腺をマークするために使用される遺伝子型のリストについては、 材料表 を参照してください。</li>
	<li>インキュベーターからケージを取り出し、この最初のコレクションを捨てます。それを新しく酵母たての寒天プレートと交換し、ケージをインキュベーターに2時間戻します。 注:最初の胚収集は、受精し、発達中の胚の雌をクリアし、タイトなタイミングの胚の第2の収集を達成するために使用される。</li>
	<li>寒天プレートをケージから取り出し、密封可能なプラスチック容器内の湿ったペーパータオルの上に(酵母の側を上に向けて)置きます。この湿ったチャンバーを25°Cのインキュベーターに入れ、胚を14.5時間熟成させます(最終年齢、産卵後14.5〜16.5時間)。 メモ: 手順 2.4 を開始する直前に、手順 3.1 および 3.2 を完了します。</li>
	<li>寒天プレートをインキュベーターから取り出し、ホヤボトルを使用して、寒天プレートに十分な水を加え、ペイントブラシで軽くブラッシングして酵母ペーストを溶解させる。胚をすすぎ、酵母を計量ボートの中に置かれた小さなメッシュスクリーンバスケットに溶かします。ほとんどの酵母ペーストがメッシュを通してろ過されるまで、水ホヤボトルでバスケットをすすいでください。</li>
	<li>計量ボートから水を取り除き、バスケットを中に入れ直します。胚を50%漂白剤溶液に浸すことによって胚を脱絨毛し、ホヤ瓶を使用する。漂白剤溶液の深さは3〜5mmでなければなりません。胚を漂白剤に沈めて約2分間保ち、時折渦巻く。 警告: 漂白剤は腐食性があり、目や気道を刺激したり損傷させたりする可能性があります。漂白剤を取り扱うときは、手袋とゴーグルを着用してください。 メモ: この間、ステップ 3.3 のできるだけ多くを完了して下さい。脱絨毛の進行は、バスケットを実体顕微鏡下に置き、背側付属器がないかどうかを確認することによって確認することができる。必要に応じて、胚を漂白剤溶液にさらに時間沈める。</li>
	<li>漂白剤を捨て、バスケット内の胚をホヤ瓶の水で徹底的にすすいでください(約3秒間、メッシュバスケットをペーパータオルで吸い取り、2〜3回繰り返します)。</li>
</ol>3. 解剖日の準備
<ol><li>1.5 mL エッペンドルフチューブ (最終濃度 0.2 mg/mL) で 1,500 μL 調製したイメージング培地 (ステップ 1.2 を参照) に 30 μL インスリン (10 mg/mL) を追加します。よく混ぜ合わせ、チューブをベンチトップに残して室温まで平衡化します。</li>
	<li>接着剤でコーティングされたカバースリップストリップを準備します。<ol>
<li>ダイヤモンドの先端を持つナイフを使用して、22 mm x 22 mmのカバースリップを4つの同じサイズのストリップに切ります(図1A)。</li>
		<li>鉗子を使用してストリップを1つ拾い上げ、合計約30μLのヘプタン接着剤溶液をストリップの両側に広げます(図1B)。接着剤残渣の均一な層を達成するには、ヘプタンが蒸発している間にストリップを様々な角度で傾ける。</li>
		<li>接着剤で覆われたストリップをカバースリップボックスの空のスロットに保管してください。粘着性を維持するには、ストリップを斜めに、しかし直立した位置に置き、箱の端にもたれかかって箱の表面との接触を最小限に抑えます(図1C)。空気中の微粒子が接着剤をコーティングし、その粘着性を軽減しないように箱を閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ベンチトップに次のアイテムを置きます:6インチガラスパスツールピペット、顕微鏡スライド、適切なピペットチップを備えたP200およびP1000ピペットマン、リンゲル溶液27 (NaOHでpHを7.3に調整)、および覆われていないPoly-D-リジンコーティングされた35mmイメージングディッシュ。</li>
	<li>メッシュスクリーンバスケットから、500~750μLのヘプタンで満たされた小さな時計皿に胚を移す。<ol>
<li>バスケットの側面と底をティッシュワイプで乾かします。絵筆をヘプタンで湿らせ、絵筆を胚に触れ(疎水性ビテリン膜が剛毛に付着するはずです)、絵筆を時計皿のヘプタンに戻します(胚は下に沈むはずです)。 注:胚が乾燥するのを防ぐために、次のステップをできるだけ早く実行する必要があります。胚は20秒以上空気に曝されるべきではありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パスツールピペットを用いて胚を顕微鏡スライド上に移す(図1D)。胚をゆっくりとピペットに引き込み、ピペットの狭い部分に制限します。ピペットの胚はゆっくりとスライド上に形成され、スライドに流れる前にピペットの先端のすぐ内側に凝集します。ティッシュワイプの角を細かい先端にねじり、スライド上の胚からヘプタンを吸い取ります。それらは集約され、より小さな領域をカバーするため、次のステップで接着剤で覆われたストリップにそれらをキャプチャすることが容易になります。</li>
	<li>鉗子で、接着剤で覆われたストリップを拾い上げ、それを胚にそっと触れます(図1E)。ストリップを画像化皿に置き、胚をサイドアップし、Poly-D-リジンコーティングされた中心のすぐ外側に置きます。鉗子を使用してストリップを皿に押し付け、所定の位置に固定されていることを確認します。直ちに2〜3.5mLのリンゲル溶液で皿を浸す。胚が乾燥するのを防ぐために、最初に胚を沈めます(図1F)。</li>
</ol>4. 解剖
メモ:これらの手順は、実体蛍光顕微鏡下で実行する必要があります。
<ol><li>10〜15個の胚をデビテリン化する。 注:これは、初心者のための2つの胚から、専門家のための15個の胚まで及ぶかもしれません。<ol>
<li>腸の形態に基づいてステージ16の胚を選択します(図2)。この段階では、胚には3つの腸狭窄があり、4つの積み重ねられた腸セグメントを作り出します(図2 B、B ')。デビテル化を開始するには、選択した胚をタングステン針で一端、好ましくは前部に突き刺す。胚はそのビテリン膜から飛び出すことがありますが、そうでない場合は、胚から膜を剥がします。 注:解剖するには若すぎる胚は、非局所化された腸を有する(図2C)。ステージ17胚の解剖は可能であるが、キューティクルがこの段階で発達し始めているため、ステージ16胚の解剖よりも困難である。初期段階17胚は、互いに相対的にシフトした4つの腸管セグメントを有する(図2D,D ́)。</li>
		<li>生殖腺から遠く離れた領域の胚に針を引っ掛ける。引っ掛けられた胚を皿のポリリジンコーティング領域(ここ以降は単に「カバースリップ」と呼ばれる)に移し、それが付着するまで底にドラッグする。これらのステップを繰り返し、ポリリジンコーティングされたカバースリップの上部に沿って一列にデビテリン化胚を配置し(図3A)、さらなる解剖のために下に十分なスペースを残します。 注:生殖巣は、使用される特定のマーカーおよび導入遺伝子のコピー数に応じて、明るく蛍光を発するはずの細胞の小さな球状の凝集体として現れる。この段階では、生殖腺はセグメントA5において横方向に位置し、前部からの胚長の約70%〜80%に位置する。解剖プロトコル全体を通して、組織は針にくっつくことがあります。針から破片を取り除くには、リンガーの溶液の表面のすぐ上に持ち上げます。デビテリン化は、生殖腺の適切なものができるだけ乱されない限り、乱れにくいことがあります。</li>
	</ol></li>
	<li>生殖腺を胚から取り出して皿にフィネスします(図3C、D)。<ol>
<li>まず、胚をファイリングしてその内部を露出させます(図3C)。胚をその中心からスライスし、針を後方に、生殖腺の間で移動させる。これは外部のキューティクルよりもはるかによく皿にくっつくので、いくつかの内部組織をからかいます。組織の粘着性は、生殖腺を明らかにし、それがカバースリップに付着することを可能にする次の操作を可能にする。 注:組織が皿に付着していない場合は、コーティングされたカバースリップの汚染されていない領域に同軸にしてみてください。カバースリップの外側の領域は特に粘着性があります。ステップ4.1.2で述べたように、生殖腺が無傷のままである限り、解剖操作によって胚の死体が壊れたかどうかは問題ではない。</li>
		<li>針を使用して生殖腺の周りをスライスし、生殖腺を含む組織の一部が残りの死体から分離されるまで切ります。針で、この組織をコーティングされたカバースリップの新鮮な領域に引き込み、それが皿に付着するまで底に同軸にします。 注:最良のイメージングは、生殖腺自体がカバースリップに直接付着する場合に達成されます, オーバーリーティッシュを介して間接的に付着するのではなく、.したがって、組織が死体から遠ざかるように、生殖腺が無関係な組織ではなく、まずカバースリップに触れるように試みる。</li>
		<li>接着組織を針で生殖腺からそっと引き離すことによって、できるだけ多くの周囲の組織を生殖腺から取り除く(図3D)。生殖腺に直接触れると生殖腺が損傷することは避けてください(図4E)。生殖腺が皿に十分に接着されるようにするには、生殖腺の周りを緩やかな円運動で針を動かし、移動する場合は、残りの付着組織に針を触れ、粘着性のカバースリップの新鮮な領域に生殖腺を向けます。生殖腺の検出可能な動きがなくなるまでこのプロセスを繰り返します。</li>
		<li>胚の死骸に戻り、第2生殖巣を解剖する。このプロセスをできるだけ多くの胚で繰り返すが、25分を超えないようにしてください。組織生存率は、約40〜45分以上後にリンゲルの溶液中で損なわれます。</li>
	</ol></li>
	<li>解剖が完了したら、消えないマーカーを使用してイメージング皿の外縁にレジストレーションマークを追加し、解剖中の向きを記録します。</li>
	<li>接着剤でコーティングされたストリップを皿から取り出します。<ol>
<li>ストリップの下に一対の鉗子の底のプロングを静かに挿入し、ストリップを留めてゆっくりと上に傾けて、付着した生殖腺の乱れを最小限に抑えるために、リンガーの溶液のスロッシングをできるだけ少なくして皿から解放します。 注:ストリップは、解剖された生殖腺から離れて傾ける必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>リンゲル溶液のスロッシングを避けるように、皿をイメージング顕微鏡にそっと運びます。</li>
</ol>5. イメージング
<ol><li>ステージホルダー内に撮像皿を置き、レジストレーションマークを用いて、解剖時と同様におおよその向きで皿を配置する。明視野顕微鏡と低消費電力(約10倍)の対物レンズを使用して、カバースリップに付着している組織片を特定し、焦点を合わせます。接眼レンズの設定を切り替えて蛍光を明らかにし、両眼接眼レンズを使用して皿を体系的にスキャンし、イメージングソフトウェア内の各生殖腺の位置をマークします( 材料表を参照)。 注: 位置をマークする前に、生殖腺が視野の中央に配置されていることを確認してください。</li>
	<li>イメージング皿をホルダーに入れた状態でステージホルダーアセンブリ全体を慎重に取り外し、アセンブリをワークベンチに置きます。</li>
	<li>リンゲル溶液をインスリンを含む調製したイメージング媒体と交換する(ステップ1.2および3.1を参照)。<ol>
<li>P1000を使用して、イメージングディッシュの内側上部棚からすべてのリンゲル溶液を除去します(中央カバースリップ領域からリンゲル液をピペットで拭かないでください)。次に、P200に切り替えて、その先端を中央領域の残りのリンガーの表面のすぐ下に置きます。50~100 μLのリンゲルを慎重に除去する。ソリューション全体を削除しないでください。</li>
		<li>約200μLのイメージングメディアを引き出し、残りのリンゲルの表面のすぐ下にP200チップを再び配置して、このイメージングメディアをゆっくりと追加します。次に、残りのイメージングメディア(約1,300μL)をディッシュに加え、上棚の最外縁から開始します。ピペッティング中は、流体の中央ドームに向かって移動し、最終的にピペットチップを両方にブラッシングして2つをマージします。皿に蓋をします。 メモ:イメージングメディアは、蒸発を防ぐために、ディッシュの内径全体を深さ約2mmで覆う必要があります(図4D)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>顕微鏡を高出力対物レンズ(63x、1.2 NA)に切り替え、使用する対物レンズ(対物レンズに必要な液浸流体の種類と屈折率)に基づいて適切な浸漬流体を適用し、ステージホルダーアセンブリを交換します。明視野顕微鏡を使用して、イメージング皿の底に付着した組織に焦点を合わせます。 注: ステージが移動されなかった場合、目標がフォーカスされると、最後の生殖腺が視界に入ります。</li>
	<li>マークされた各生殖腺の位置をステップ実行し、必要に応じてその位置を調整します。画像の明瞭さ、生殖腺の性別などに基づいて、画像化する生殖腺を選択します。イメージング設定(マルチチャンネル、露光時間、レーザー強度、Zシリーズ増分、適切な間隔でのタイムラプスなど)をカスタマイズします。イメージングを開始します。 注:雄性生殖腺は、ニッチと生殖腺の反対側の端、男性特異的体性生殖腺前駆体(msSGP)と呼ばれる小さくて円形の体細胞のクラスターの両方の存在によって識別することができる。 64-eGFP::moesin蛍光マーカーを使用する場合、ニッチ細胞は生殖腺内で2番目に明るい細胞であり、最も明るいのはmsSGPである。この段階では、女性の生殖腺はニッチもmsSGPも持っていません。</li>
</ol>

<ol>
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E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

著者らは開示するものは何もありません。

性腺形成の間、胚性生殖巣、特に雄性生殖巣15内の幹細胞ニッチは、急速な形態学的変化を受ける。これらのダイナミックな変化の根底にある発達メカニズムは、ライブイメージング技術によって最もよく理解されます。しかしながら、胚期ステージ17では、大規模な筋肉収縮17の発症により生殖巣の生体内イメージングが不可能になる。このプロト?...

ショウジョウバエのメラノガスター精巣は、多くの動的な細胞プロセスの理解のためのパラダイムとして役立ってきました。このモデルの研究は、幹細胞分裂制御1,2,3、生殖細胞発生4,5、piRNA生物学6、7、8、およびニッチ幹細胞シグナル伝達事象9、10、11、12、13に光を当てた。このモデルは遺伝的に扱いやすいため有利です14,15,そして自然環境で幹細胞をライブイメージングできる数少ないものの1つです3,16,17,18。しかし、このモデルのライブイメージングは成体組織と初期胚期に限定されており、ニッチが最初に形成され機能し始めている正確な段階である後期胚の生殖腺動態に関する知識にギャップを残しています。
後期胚性生殖巣は球体であり、前部の体細胞ニッチ細胞と、より後方領域19全体にわたって体性生殖腺細胞によって嚢胞された生殖細胞とからなる。この器官は、初期段階17から17、20、21の初期胚までインビボで生きて画像化することができる。さらに、大規模な筋肉収縮の開始により画像化が妨げられる。これらの収縮は非常に深刻で、生殖腺を画像フレームから押し出すため、そのような動きは画像化ソフトウェアでは補正できません。私たちの研究室では、ライブイメージングのためのこのとらえどころのない時期に起こるニッチ形成のメカニズムを明らかにすることに興味を持っています。そこで、胚期16から生殖巣を生きた画像化するエクスビボアプローチを生かし、生殖腺発生のこの重要な時期における細胞ダイナミクスの研究を促進しました。私たちの研究室の以前の研究は、このex vivoイメージングがin vivo生殖腺発達を忠実に再現することを示しています17。この技術は、ショウジョウバエの胚性生殖腺にとってその種の最初で唯一のものです。
ここでは、後期胚期における生殖巣のエクスビボライブイメージングに必要な解剖プロトコルを提示する。このプロトコールは、薬理学的処置、または生殖腺内の特定の細胞系譜のトランスジェニック操作と組み合わせることができる。この技術を用いて、幹細胞ニッチ形成17のステップを画像化することに成功した。したがって、このイメージングアプローチは、自然環境内でニッチ形成の初期段階をリアルタイムで視覚化できるため、幹細胞生物学の分野にとって有益です15,17。この方法は幹細胞生物学の分野にとって有益であるが、細胞再配列22、細胞接着2、12、23、および細胞遊走23を含む、この発生時点の間に生殖腺で起こる任意の動的プロセスを視覚化するためにさらに適用可能である。したがって、この解剖プロトコルは、多くの基本的な細胞生物学的プロセスに関する私たちの理解を深めるでしょう。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar&#160;Tungsten wire</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA10408G6</td>
			<td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: His2Av::mRFP1</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>FBtp0056035</td>
			<td>Schuh, Lehner, &#38; Heidmann, Current Biology, 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato</td>
			<td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td>
			<td></td>
			<td>Lin, Luo, &#38; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#39;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin</td>
			<td></td>
			<td>FBtp0083398</td>
			<td>Sano et al., PLoS One, 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l0516</td>
			<td>Store aliquots at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nytex basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&#8217;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

ショウジョウバエメラノガスター雄胚性生殖巣は、生殖細胞発生、piRNA生物学、およびニッチ形成を含むがこれらに限定されない発生生物学の様々な側面を研究するのに有利なモデルである。ここでは、生体内ライブイメージングが非常に効果のない期間に、生体外で生殖巣をライブイメージングする解剖技術を提示する。このプロトコルは、胚をイメージング皿に移し、適切に段階的に配列された雄胚を選択し、その構造的完全性を維持しながら周囲の組織から生殖腺を解剖する方法を概説する。解剖に続いて、生殖巣を共焦点顕微鏡を用いて画像化し、動的な細胞プロセスを視覚化することができる。解剖手順には正確なタイミングと器用さが必要ですが、一般的な間違いを防ぐ方法とこれらの課題を克服する方法についての洞察を提供します。我々の知る限り、これはショウジョウバエの胚性生殖腺の最初の解剖プロトコルであり、そうでなければアクセスできない時間枠の間にライブイメージングを可能にするでしょう。この技術は、薬理学的または細胞型特異的トランスジェニック操作と組み合わせて、天然の生殖腺環境において細胞内または細胞間で起こる動的プロセスを研究することができる。

「解剖準備の日」で説明したように画像化皿の調製を 図1に例示する。これらの方法は、最終的に、十分に水和した胚をカバースリップストリップに接着させ、これを皿の底に一時的に固定し、リンガーの溶液に沈める結果となるはずである(図1F)。ダイヤモンド先端のナイフを使用すると、22 x 22 mmのカバースリップを3~4本の小さなストリップにき...

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.1K ビュー.  University of Pennsylvania. ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。

ビデオ: Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

発生生物学

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

マウス胎児腎臓の解剖および培養

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

後期胚性ショウジョウバエ生殖腺の解剖とライブイメージング